pháp pha loãng (Geert Huys, 2002):
Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của natsol bằng môi trường NB lỏng lên vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila, có thay đổi các bước:
Bước 1: Chuẩn bị môi trường hóa chất, hóa chất
Môi trường NB, NA tiệt trùng.
Nước muối sinh lý tiệt trùng, nước cất tiệt trùng. Ống nghiệm tiệt trùng, đầu col tiệt trùng.
Bước 2: Chuẩn bị dung dịch thuốc natsol và dung dịch thuốc kháng sinh
chloramphenicol (như3.3.1.2)
Bước 3: Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn
Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn (như3.3.1.1)
Thao tác thực hiện: Cho 2 ml vi khuẩn đã điều chỉnh mật độ vào mỗi ống
nghiệm có hàm lượng thuốc từ 4ppm - 1024ppm và 23,4375ppm - 24000ppm.
Lưu ý: Không nên cho vi khuẩn vào thuốc lâu hơn 1 giờ sau khi đo mật độ
vi khuẩn. Lắc đều dung dịch vi khuẩn trước khi cho vào ống nghiệm có
thuốc. Tất cả các ống nghiệm được ủ ở 28oC - 30oC trong 24 giờ (hoặc lâu hơn đến khi nào thấy vi khuẩn trong ống đối chứng dương phát triển).
Mỗi chủng vi khuẩn sau khi điều chỉnh mật độ phải được cấy lên môi
trường NA để kiểm tra sự thuần chủng và phải được ủ trong cùng điều
kiện với các ống MIC.
Mỗi thí nghiệm cầncó hai đối chứng:
+ Đối chứng âm (2ml NB + 2ml nước muối sinh lý (0,85% NaCl))
+ Đối chứng dương (2ml vi khuẩn + 2ml nước muối sinh lý (0,85% NaCl))
Tất cả các ống nghiệm được ủ ở 280C, trong 18 - 24 giờ.
Bước 4: Đọc kết quả
Kiểm tra sự thuần chủng của chủng vi khuẩn xét nghiệm trên đĩa TSA.
Nếu phát hiện có sự tạp nhiễm thì không đọc kết quả MIC.
Sự phát triển của vi khuẩn được xác định bằng cách so sánh độ đục của
mỗi ống MIC với ống đối chứng âm.
Loạt ống nghiệm của chủng vi khuẩn nào phát triển không liên tục thì loại
bỏ, không lấy kết quả, thực hiện lại thí nghiệm (ví dụ: vi khuẩn phát triển ở ống 5 & 7 nhưng không phát triển ở ống 6).
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Giá trị MIC được xác định là hàm lượng thuốc trong ống nghiệm có nồng
độ thuốc nhỏ nhất không có vi khuẩn phát triển. Trường hợp vi khuẩn
phát triển ở tất cả nồng độ thì giá trị MIC được xác định ở ống nghiệm có hàm lượng thuốc mà sự phát triển của vi khuẩn giảm khoảng 80% so với
các ống trong loạtống kiểm tra.
* Chú ý: Khi đọc kết quả ta thấy một số ống MIC có độ đục gần bằng nhau, khó phân biệt bằng mắt thường thì ta tiến hành kiểm tra sự phát triển của vi
khuẩn trên đĩa petri môi trường thạch. Tuỳ theo từng độ đục khác nhau mà ta có thể pha loãng theo nồng độ giảm dần sao cho có thể dễ dàng đếm các khuẩn lạc trên đĩa thạch. Dùng pipet vớiđầu col tiệt trùng hút 0,5 ml dung dịch vi khuẩn
cần xác định mật độ cho vào 4,5 ml nước muối sinh lý (0,85% NaCl) (ống
nghiệm 10-1), trộn đều mẫu. Tiếp tục dùng pipet hút 0,5 ml dung dịch từ ống
nghiệm 1 cho vào 4,5 ml nước muối sinh lý ống nghiệm 2 (ống 10-2), thực hiện
pha loãng như vậy cho đến nồng độ thích hợp. Sau khi pha loãng xong nhỏ 20µl dung dịch vi khuẩn lên đĩa NA bằng pipet, mỗi nồng độ lặp lại ít nhất 3 lần. Ủ đĩa trong tủ ấm tại điều kiện nhiệt độ 280C - 300C, đọc kết quả sau 24 giờ đối với A. hydrophila hoặc 48 giờ đối với E. ictaluri. Đếm số khuẩn lạc vi
khuẩn phát triển trên môi trường thạch và áp dụng công thức sau:
Mật độ vi khuẩn (cfu/ml) = trung bình số khuẩn lạc * 50* độ pha loãng
Chọn nồng độ nào có mật độ vi khuẩn thấp nhất (giảm 80% so với mật độ vi
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ THẢO LUẬN