Một số hiện tượng bất thường trong vi nhân giống thực vật và giải pháp khắc phục

Bài viết tập trung phân tích một số hiện tượng bất thường hay gặp trong vi nhân giống thực vật như thủy tinh thể; hiện tượng vàng và rụng lá; sự nhiễm vi sinh vật; hoại tử chồi đỉnh, rễ và mẫu mô nuôi cấy; sự hóa nâu mẫu, môi trường nuôi cấy và một số hạn chế khác. Bên cạnh đó, đề xuất các giải pháp hiệu quả để khắc phục những hiện tượng bất thường này.

Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 18(1): 23-39, 2020 BÀI TỔNG QUAN MỘT SỐ HIỆN TƯỢNG BẤT THƯỜNG TRONG VI NHÂN GIỐNG THỰC VẬT VÀ GIẢI PHÁP KHẮC PHỤC Hà Thị Mỹ Ngân1,2, Hoàng Thanh Tùng2, Bùi Văn Lệ1, Dương Tấn Nhựt2,* Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam
 * Người chịu trách nhiệm liên lạc E-mail: duongtannhut@gmail.com Ngày nhận bài: 27.6.2019 Ngày nhận đăng: 03.8.2019 TĨM TẮT Ni cấy mô, tế bào quan thực vật trở thành phương pháp nhân giống chuẩn phổ biến nhiều loại trồng như: cảnh, dược liệu, ăn trái rau xanh Ưu điểm phương pháp tạo số lượng lớn giống đồng mặt di truyền, kiểm soát yếu tố gây bệnh cho cây, tạo giống bệnh, công cụ để bảo tồn, phát triển nguồn gen nghiên cứu đặc tính sinh lý thực vật Bên cạnh ưu điểm phương pháp tồn hạn chế chưa khắc phục hình thái, sinh lý cấu trúc giải phẫu bất thường, bị thối hóa, dị dạng, khí khổng chức Những bất thường tác động lớn lên hệ số nhân giống sinh trưởng phát triển thực vật giai đoạn vườn ươm Điều kiện nuôi cấy in vitro hệ thống ni cấy kín, thành phần hàm lượng chất dinh dưỡng, chất điều hòa sinh trưởng thực vật môi trường nuôi cấy, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, tuổi nguồn gốc mẫu cấy… nguyên nhân chủ yếu gây bất thường Do đó, việc cải tiến tối ưu hóa hệ thống nuôi cấy đồng thời nâng cao chất lượng giống ln mục tiêu vi nhân giống thương mại Trong tổng quan chúng tơi tập trung phân tích số tượng bất thường hay gặp vi nhân giống thực vật thủy tinh thể; tượng vàng rụng lá; nhiễm vi sinh vật; hoại tử chồi đỉnh, rễ mẫu mơ ni cấy; hóa nâu mẫu, mơi trường nuôi cấy số hạn chế khác Bên cạnh đó, đề xuất giải pháp hiệu để khắc phục tượng bất thường Từ khóa: Hóa nâu, hoại tử mẫu cấy, nhiễm vi sinh vật, nuôi cấy in vitro, rụng lá, thủy tinh thể GIỚI THIỆU Thuật ngữ nhân giống vơ tính thực vật thường đề cập đến phương pháp sinh sản vơ tính từ mô quan sinh dưỡng để bảo tồn kiểu gen mong muốn giống thực vật tốt chọn lựa nông nghiệp lâm nghiệp Theo truyền thống, phương pháp đạt cách sử dụng đoạn cắt (giâm hom), chiết cành, tách cây, ghép Tuy nhiên, nhiều loài thực vật, đặc biệt hoa lan loài thân gỗ phương pháp khó thực nhiều thời gian (Bhojwani, Dantu, 2013) Nhiều năm qua, diện tích sản xuất mở rộng, nhu cầu giống tăng theo phương pháp nhân giống khơng ngừng cải tiến phương pháp truyền thống đáp ứng kịp nhu cầu giống, mặt khác mang nguy làm lây lan bệnh hại làm thối hóa giống Vào đầu năm 1960, tính tồn tế bào thực vật thiết lập 23 Hà Thị Mỹ Ngân et al số lượng lớn thực vật tái tạo mảnh nhỏ mô sinh dưỡng điều kiện vô trùng ni cấy mơ dự đốn phương pháp thay tiềm để nhân giống thực vật cách nhanh chóng Nhân giống vơ tính thực vật in vitro hay gọi vi nhân giống tạo nên cách mạng khoa học công nghệ sử dụng rộng rãi giới để nhân giống loại cảnh, ăn rừng (George et al., 2008; Yam, Arditti, 2009) Phương pháp vi nhân giống tỏ hiệu sản xuất số lượng giống bệnh với tốc độ nhanh, chất lượng đồng đồng mặt di truyền có lợi vượt trội so với phương pháp nhân giống vơ tính thơng thường: (a) thời gian không gian tương đối, số lượng lớn thực vật sản xuất cá thể riêng lẻ, (b) điều kiện nuôi cấy vô trùng đảm bảo bệnh, (c) tỷ lệ nhân giống in vitro thành công thường cao nhiều so với phương pháp nhân giống ex vitro q trình ni cấy điều chỉnh nồng độ chất dinh dưỡng chất điều hòa sinh trưởng, nhiệt độ ánh sáng cách tối ưu hiệu quả, (d) áp dụng cho nhiều kiểu gen mà phương pháp truyền thống khó khơng thể thực hiện, (e) tiến hành quanh năm khơng phụ thuộc thời tiết hay mùa vụ, (f) sử dụng thực vật từ nguồn virus, chúng bảo vệ khỏi tái nhiễm vi nhân giống xuất với vấn đề kiểm dịch, (g) thực vật không bị phá hoại vi sinh vật, (h) thực vật sản xuất ống nghiệm hoạch định tốt cách lưu trữ nuôi cấy nhiệt độ thấp thời điểm nhu cầu thị trường thấp (i) trồng vi nhân giống có đặc điểm mong muốn chẳng hạn thay đổi màu sắc hoa cảnh tăng số lượng ngó (cây con) dâu tây (Bhojwani, Dantu, 2013) Bên cạnh nhiều lợi ích mang lại phương pháp với đặc trưng điều kiện ni cấy kín, nhiệt độ, độ ẩm cao bình ni cấy, mơi trường dinh dưỡng… cịn có hạn chế chưa khắc phục 24 tượng thủy tinh thể; vàng, rụng lá; nhiễm mơi trường ni cấy; hóa nâu mẫu cấy mơi trường nuôi cấy; hoại tử mẫu cấy tượng biến dị soma Hiện tượng thủy tinh thể Các chồi vi nhân giống nuôi cấy điều kiện độ ẩm cao dị dưỡng bên bình ni cấy kín thường thể bất thường hình thái, sinh lý hoạt động trao đổi chất Những bất thường hình thái giải phẫu sinh lý miêu tả nhiều thuật ngữ: tượng thủy tinh thể hóa, tích lũy nước q mức, mọng nước hay tượng vắt thuỷ tinh (Hình 1A, B, C) Thuật ngữ “vitrification” thuật ngữ đề cập đến q trình sinh lý khơng phải q trình sinh học, thuật ngữ dùng nhiều để diễn tả biến đổi mẫu dẫn đến tượng thủy tinh thể (Kharrazi et al., 2011) Những bất thường liên quan đến tượng “thủy tinh thể” biệt hóa hóa gỗ mơ, tế bào bị thủy tinh thể bao quanh vách mỏng chứa nguyên sinh chất nghèo dinh dưỡng với không bào lớn, hàm lượng lục lạp thấp Kiểm tra qua kính hiển vi phát rằng, nhiều trường hợp bị mọng nước thiếu mô giậu hay chứa lớp mô giậu mỏng Ở táo, quan bị dị tật phát triển vượt mức, gia tăng thể tích bị khiếm khuyết gấp năm lần so với bình thường Ở hoa cẩm chướng, gia tăng không gian nội màng đồng nghĩa với việc gia tăng nước nguyên sinh chất, nuôi cấy môi trường lỏng lục lạp chứa nhiều hạt tinh bột lớn Đối với mận, hoa cẩm chướng mâm xôi, hàm lượng lục lạp bị thủy tinh thể thấp bình thường (Ziv, 1991) Đối với vài loài cây, thủy tinh thể kéo theo khiếm khuyết mô biểu bì Sự khiếm khuyết trình hình thành lớp lông sừng bị thủy tinh thể nghiên cứu số lượng chất lượng Lớp lông sừng bị thủy tinh thể mỏng manh so với bình thường Thủy tinh thể cịn Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 18(1): 23-39, 2020 làm cho khả định hướng vi sợi cellulose vách tế bào bảo vệ lỗ khí giảm nên khả đóng, mở khí khổng chúng Những khí khổng dị thường cho thấy có vết thương xung quanh lỗ khí chúng khơng đáp ứng với stress nước, abscisic acid (ABA) nồng độ CO2 cao (Gaspar et al., 2002) Sự nước chồi vấn đề nghiêm trọng vi nhân giống quy mơ thương mại chồi bất thường thể đáp ứng rễ tỷ lệ sống thấp Những triệu chứng bất thường khơng giống tất lồi biểu nhiều mức độ phát sinh hình thái dị thường, mức độ tích lũy nước phụ thuộc vào loài giống trồng, tính chất vật lý mơi trường, loại bình ni cấy, loại hàm lượng tác nhân làm đông, nồng độ loại cytokinin (Gaspar et al., 1987) Sự sản sinh mức ethylene mô thực vật, tác động photon quang hợp, nồng độ CO2, độ ẩm cao bên bình ni cấy (≥ 95%), nhiệt độ khơng khí làm cho khơng tăng trưởng hoàn chỉnh được, gây dị dạng cho thân đặc biệt gây tượng thủy tinh thể Ethylene (C2H4) hormone thực vật dạng khí, tác động đến sinh trưởng, biệt hóa già hóa thực vật nồng độ thấp 0,01 µl/L (Chang, 2016) Cùng với việc nghiên cứu chất điều hoà sinh trưởng thực vật cổ điển cytokinin auxin tốc độ sản sinh hormone thực vật dạng khí ethylene chứng minh có ảnh hưởng đến biệt hóa, tăng sinh sinh trưởng mẫu tế bào mô nuôi cấy in vitro Các mô thực vật nuôi cấy in vitro thường sinh ethylene tổn thương mẫu cấy trình cấy chuyền với nhiều điều kiện stress khác (Kumar et al., 1998) Hàm lượng ethylene thay đổi phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng mẫu cấy, nồng độ chất điều hoà sinh trưởng sử dụng kiểu giống Đối với loài cẩm chướng ‘Ceris Royallete’ bổ sung x 10-6 M amino oxyacetic acid (AOA), chất ức chế tạo thành ethylene vào môi trường làm giảm số bị thủy tinh thể, tăng hàm lượng chlorophyll lớp lông sừng ni cấy mơi trường lỏng Ni cấy thống khí cách đục lỗ nắp nhựa bao phủ màng micropore (kích thước lỗ màng 0,20 µm) giúp giảm tích tụ ethylene bình ni cấy làm giảm tượng thủy tinh thể (Bhojwani, Dantu, 2013) Hai thành phần quan trọng điều kiện ni cấy có liên hệ trực tiếp đến phát sinh hình thái bất thường phát triển trạng thái hóa học lý học mơi trường Agar có ảnh hưởng đến nước, độ ẩm, nước có sẵn chất hịa tan có mơi trường; nuôi cấy lỏng, tượng thủy tinh thể ghi nhận vài lồi chí chồi khơng bị ngập chìm ni cấy lắc tiếp xúc với khơng khí bình nằm số giá thể (như cầu giấy lọc hay giá thể khác) Sự gia tăng hàm lượng agar giúp giảm tượng thủy tinh thể lại cho tỉ lệ nhân giống thấp Khả đáp ứng mẫu nuôi cấy trạng thái agar hay chất tạo gel khác phụ thuộc vào nồng độ chất tạo gel lồi ni cấy Đối với táo, sử dụng giá thể gelrite chứa nhiều K+ Mg2+ làm gia tăng tượng thủy tinh thể (García-Gonzáles et al., 2010) Việc sử dụng chất làm khô để làm giảm độ ẩm tương đối khơng khí bên bình ni cấy giúp gia tăng lớp lông sừng cẩm chướng cải bắp; sử dụng lớp lanolin phủ lớp agar làm giảm độ ẩm tương đối môi trường nuôi cấy đến 35% Điều đạt cách đặt bình ni cấy đĩa lạnh, sử dụng đĩa lạnh nước ngưng tụ mơi trường agar, giảm tượng thủy tinh thể (Ziv, 1991) Ngoài trạng thái vật lý môi trường, nhiều thành phần hịa tan ảnh hưởng đến phát sinh hình thái Sucrose carbohydrate cung cấp nuôi cấy in vitro Đối với cẩm chướng, chồi đỉnh có số bị thủy tinh thể lượng đường 3%, thành phần sucrose thay dung dịch mannitol nồng độ lại cảm ứng mọng nước 25 Hà Thị Mỹ Ngân et al Hiện tượng xuất theo mức độ khác tùy loài đáp ứng chúng gia tăng hàm lượng carbohydrate môi trường Đối với Philodendron, việc bổ sung thêm mannitol làm gia tăng hàm lượng chlorophyll không cải thiện sinh trưởng Đối với hạnh nhân ô liu, nhiều loại carbohydrate thử nghiệm 4,5% fructose làm giảm đáng kể tượng thủy tinh thể (Bahmani et al., 2009) Mơi trường giàu khống mơi trường MS (Murashige, Skoog, 1962) cho thấy có khả làm gia tăng tượng thủy tinh thể số lồi Dùng mơi trường có hàm lượng khoáng thấp hay phân nửa khoáng MS cải thiện phát triển cẩm chướng dưa leo; giảm hàm lượng NH4+ mơi trường làm gia tăng hóa gỗ giảm tượng thủy tinh thể liễu, mận, xương rồng Gia tăng hàm lượng Ca2+ chứng minh giúp giảm tượng thủy tinh thể loài thân thảo thân gỗ, nhiên, việc gia tăng nồng độ Ca2+ cản trở hóa gỗ thơng qua hoạt động enzyme peroxidase cảm ứng hình thành mơ sẹo (Mayor et al., 2003) Gần đây, nghiên cứu cho thấy việc sử dụng nano bạc (AgNPs) giúp hạn chế tượng thủy tinh thể vi nhân giống số loại trồng AgNPs hạn chế tượng thủy tinh thể vi nhân giống dâu tây (Dương Tấn Nhựt et al., 2014), hoa cúc (Luong Thien Nghia et al., 2017), hoa đồng tiền (Hà Thị Mỹ Ngân et al., 2019) ghi nhận Quá trình tái sinh chồi in vitro nhân giống đòi hỏi cung cấp chất điều hòa sinh trưởng mơi trường ni cấy Những chất điều hịa sinh trưởng thường dùng chất thuộc nhóm auxin cytokinin riêng rẽ hay dùng chung với tỉ lệ đa dạng phụ thuộc vào loài loại mô dùng để nuôi cấy Nghiên cứu cẩm chướng cho thấy benzyl amino purine (BA), kinetin (KIN) cảm ứng tượng thủy tinh thể sử dụng nồng độ cao gia tăng phân bào thay đổi trình biến dưỡng in vitro, lý mà 26 nhiều lồi lại đáp ứng cách khác hàm lượng khác cytokinin Mối liên hệ auxin với tượng thủy tinh thể nghiên cứu hầu hết trường hợp, ảnh hưởng chúng có mối liên hệ với cytokinin, cân auxin cytokinin cảm ứng tượng thủy tinh thể (Kharrazi et al., 2011) Cây nuôi cấy in vitro cung cấp nguồn carbohydrate chúng sống theo hình thức dị dưỡng Tuy nhiên, chất lượng ánh sáng, thời gian cường độ chiếu sáng có ảnh hưởng đến sinh trưởng phát sinh hình thái từ có vai trị quang hợp Ánh sáng kiểm sốt kích thước thân đường phát sinh hình thái, có ảnh hưởng tới việc hình thành sắc tố tượng thủy tinh thể Đối với phong lữ, hoa hồng bạch diệp lớn điều kiện nuôi cấy in vitro phát triển hình thái dị thường cho cường độ ánh sáng thấp phòng nuôi cấy Tăng cường độ chiếu sáng làm giàu CO2 phịng ni cấy cải thiện hiệu quang hợp Sự sinh trưởng số loài thực vật đẩy mạnh cách rõ đặt điều kiện cường độ ánh sáng cao với làm gia tăng lượng CO2 không khí bao quanh phịng ni cấy Nhiều nghiên cứu vai trị cường độ ánh sáng cho thấy có liên quan đến giai đoạn cuối giai đoạn thích nghi (Da Silva et al., 2013) Các chứng nêu bất thường cấu trúc bị thủy tinh thể, cho thấy nhiều nhân tố phức hợp môi trường nuôi cấy mối quan hệ bên nhiều đường biến dưỡng cảm ứng dị thường cấu trúc chứng Hậu giảm khả sống sót chuyển ngồi bầu đất, chúng địi hỏi phải trải qua bước thích nghi kéo dài điều kiện ex vitro kể việc tạo thay cũ Hiện tượng vàng rụng Thực vật vi nhân giống thường xuyên chịu ảnh hưởng stress sinh học phi sinh Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 18(1): 23-39, 2020 học gây tác động xấu đến sinh trưởng, phát triển, sinh sản giảm tỷ lệ sống chuyển vườn ươm từ làm giảm suất trồng Bên cạnh tượng thủy tinh thể, vi nhân giống số lồi thực vật cịn gặp phải tượng vàng rụng (Hình 1D) Sự rụng quan thuật ngữ sử dụng để mơ tả q trình mà phận thực vật bị tách rời, thường xảy quan lá, hoa, hạt Tiến trình chịu tác động thời gian lẫn khơng gian, ví dụ thụ phấn thất bại tồn hoa bị rụng thụ phấn đạt hiệu xúc tác rụng tơ bao phấn, cánh hoa đài hoa Những quan sát cho biết dấu hiệu dẫn đến rụng quan phải phối hợp chặt chẽ với tín hiệu dẫn đến xáo trộn số địa điểm kích hoạt q trình nơi khác (Roberts et al., 2002) Kết tách rời quan thường liên quan đến giai đoạn phát triển quan bị Lá rụng loài thực vật rụng liên kết với suy giảm quang chu kỳ; nhiên, tượng xảy sớm tác động yếu tố môi trường hạn hán, mặn, thiếu chất dinh dưỡng công mầm bệnh Trong tự nhiên, đặc biệt nơng nghiệp khoa học trồng q trình có vai trị hữu ích Nếu rụng sớm hoa trái non tác động mơi trường gây hậu nghiêm trọng đến suất rụng trái trưởng thành, thơng qua việc áp dụng hóa chất kích thích q trình rụng ethylene hay ethephone tạo điều kiện cho việc thu hoạch sớm (Taylor, Whitelaw, 2001; Li et al., 2006) Trong vi nhân giống thực vật, rụng quan đặc biệt rụng chồi nuôi cấy thường liên quan tới tác động khí ethylene auxin Các tế bào chịu tác động dẫn đến khiếm khuyết hóa gỗ, điều kiện bất lợi kích thích tạo nên enzyme phân huỷ thành tế bào tầng rời, làm tầng rời nhanh chóng xuất Tầng rời (2 - lớp tế bào nối liền quan thực vật với thân chính) gồm số tế bào nhu mơ đặc biệt có đặc trưng tế bào bé hơn, tròn, chất nguyên sinh đặc hơn, gian bào bé, khơng hóa suberin lignin, hệ thống dẫn qua vùng mỏng manh Các cấu trúc làm cho vùng yếu vùng tế bào khác Khi có điều kiện cảm ứng rụng tầng rời xuất nhanh chóng Các biến đổi xảy vùng tế bào mạnh đặc biệt huy động enzyme thủy phân enzyme pectinase cellulase phân huỷ thành tế bào làm tế bào trở nên rời rạc, khơng dính cịn giữ lại bó mạch mỏng manh dễ dàng rụng (Phan, Letouze, 1983; Ngan et al., 2020) Ethylene yếu tố quan trọng liên quan đến rụng lá, khơng phải yếu tố điều khiển rụng quan thực vật nhiều trường hợp, số trường hợp chí khơng quan trọng Tuy nhiên vi nhân giống với điều kiện ni cấy bình kín, độ ẩm cao với hình thức sinh dưỡng dị dưỡng thực vật ni cấy tích tụ khí ethylene lại trở thành yếu tố điều khiển rụng (Agustí et al., 2009) Tiến trình rụng nghiên cứu rộng rãi nhiều phân tích thực cách cho mô mẫu cấy tiếp xúc với chất điều hòa sinh trưởng thực vật ethylene auxin thời gian dài từ vài đến vài ngày (GonzálezCarranza et al., 2002) Thông thường, nuôi cấy môi trường độ ẩm cao nhạy cảm với tác động ethylene số nghiên cứu cho thấy auxin nội sinh ngoại sinh từ môi trường nuôi cấy có khả ức chế rụng Ở giai đoạn I rụng bị ức chế auxin tác động ethylene không gây tượng rụng Sau đó, tế bào vùng rụng trở nên nhạy cảm với tốc độ sản sinh nhanh nhiều ethylene lúc vai trị ức chế auxin khơng thể dịng auxin từ bị giảm chế vận chuyển theo cực bị phá bỏ Thực tế non quan sản sinh ethylene nhiều rụng lại xảy nhiều già nhất, thấp ethylene cho rút ngắn thời gian giai đoạn I ức chế 27 Hà Thị Mỹ Ngân et al chuyển hóa auxin (Tucker et al., 2007) Nồng độ cao ethylene gây tượng rụng cánh hoa hồng, nồng độ ethylene vùng rụng thường tăng trước xảy phân tách quan Sự gia tăng nồng độ ethylene cho kích hoạt tiết biểu gen mã hóa cho enzyme thủy phân thành tế bào, chẳng hạn pectinase cellulase (MacDonald et al., 2011, Ngan et al., 2020) Trong cà chua, hoa nở tiếp xúc với ethylene khí rụng cuống hoa xảy nhanh so với mơi truờng khơng có ethylene Ngược lại, mẫu cấy tiền xử lý aminoethoxyvinyl glycine (AVG), chất ức chế sinh tổng hợp ethylene, tách rời quan bị kìm hãm; tương tự tiền xử lý mẫu cấy chất ức chế hoạt động ethylene khác 1-metyl-cyclopropene (1MCP) giúp làm chậm gây chậm tiến trình rụng (Meir et al., 2010) Gần đây, công nghệ nano biết đến lĩnh vực khoa học khám phá thuộc cơng nghệ nano mở nghiên cứu tiên tiến ứng dụng nhiều lĩnh vực y học, môi trường, lượng, điện tử, khoa học đời sống bao gồm khoa học trồng Tác động tích cực hạt nano kim loại lên thực vật chứng minh thông qua khả gia tăng tỉ lệ nảy mầm, tăng cường sinh trưởng hoạt động sinh lý, hạn chế rụng quan sinh sản thực vật, tăng sản lượng xuất trồng, tăng cường chuyển hóa hợp chất thứ cấp nhiều trồng quan trọng (Nair et al., 2010) Nano bạc (AgNPs) nano cobalt (CoNPs) hai nano kim loại có vai trị quan trọng khắc phục tượng thủy tinh thể, vàng rụng trồng nuôi cấy in vitro thông qua khả ức chế sinh tổng hợp hoạt động khí ethylene AgNPs ngăn ngừa hoạt động khí ethylene cách làm đảo lộn vùng bám dính thụ thể ethylene thông qua việc thay Cu2+ Ag+, điều khiến cho thụ thể liên kết với ethylene ngăn ngừa tín hiệu ức chế ethylene lên thực vật (Kumar et al., 2009) Bổ sung mg/L 28 AgNPs vào môi trường nuôi cấy hoa hồng giúp hạn chế tích lũy khí ethylene bên bình ni cấy, giảm hoạt độ enzyme thủy phân gia tăng chất lượng in vitro (Hà Thị Mỹ Ngân et al., 2019) Bên cạnh đó, CoNPs lại đóng vai trò quan trọng ức chế sinh tổng hợp khí ethylene thơng qua ức chế enzyme laminocyclo-propane carboxylic acid (enzyme ACC) – enzyme quan trọng trình chuyển đổi ACC thành ethylene (Thao et al., 2015) CoNPs nồng độ thích hợp sử dụng để thay muối CoCl2 môi trường nhân giống in vitro hoa hồng, kết ghi nhận cho thấy CoNPs đóng vai trị quan trọng khắc phục tượng vàng lá, rụng ức chế hình thành hoạt động khí ethylene vi nhân giống loài (Ngan et al., 2020) Từ cho thấy việc sử dụng chất ức chế hoạt động sinh tổng hợp ethylene, thay đổi điều kiện môi trường nuôi cấy, sử dụng màng thống khí… điều khiển tượng rụng nhân giống in vitro Trong tượng rụng lá, auxin ethylene tác nhân điều khiển q trình có tác động qua lại với nhau, nồng độ auxin vị trí xa gần với vùng rụng có liên quan đến thời điểm rụng phụ thuộc nồng độ không tuyệt đối Nồng độ auxin thấp vị trí xa nồng độ cao vị trí gần vùng rụng lá, rụng trì hỗn nồng độ auxin cao xa vùng rụng Do đó, nhà nghiên cứu gợi ý dãy nồng độ auxin xung quanh khu vực rụng có khả điều chỉnh cảm ứng rụng Như vậy, việc giảm nồng độ auxin phía xa, tăng cường sinh tổng hợp ethylene nhạy cảm mẫu cấy với ethylene gây hoạt động enzyme thủy phân làm suy yếu thành tế bào tăng cường rụng già hóa Trong auxin acid indoleacetic (IAA) nội sinh chứng minh làm trì hỗn q trình phân tách quan cà chua, nhiên, auxin ngoại sinh lại khơng ảnh hưởng đến hình thái tượng Các kết cho thấy IAA NAA Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 18(1): 23-39, 2020 IBA làm hạn chế rụng nhiên tác dụng yếu auxin trì hỗn phân tách tế bào cách ức chế biểu enzyme phân hủy tế bào định khơng ảnh hưởng đến biệt hóa hình thái giải phẫu vùng rụng (Tucker et al., 2002) Các nhà nghiên cứu cho giảm lượng auxin vùng rụng làm gia tăng tín hiệu ethylene ngược lại nồng độ auxin vùng cao, phân tách tế bào bị ức chế, đó, auxin tự tầng rời điều chỉnh độ nhạy với ethylene có yếu tố điều tiết trình sinh tổng hợp auxin, vận chuyển auxin tầng rời ảnh hưởng đến độ nhạy tế bào với ethylene Vì vậy, nghiên cứu vai trò ethylene IAA cần thiết để xác định chínhxác cách thức chúng hoạt động để điều chỉnh thời gian rụng quan (Taylor, Whitelaw, 2001; González-Carranza et al., 2012) Hình Một số tượng bất thường nhân giống in vitro thực vật Thủy tinh thể chồi cẩm chướng (A), chồi hoa hồng (B) chồi đồng tiền (C) Hiện tượng vàng rụng chồi hoa hồng nuôi cấy in vitro (D) 29 Hà Thị Mỹ Ngân et al Nếu ethylene lẫn IAA yếu tố định cho việc phân tách tế bào, tác nhân khác acid abscisic (ABA) ban đầu cho chất điều hòa sinh trưởng quan trọng, nhiên, năm gần vai trị thay đổi trở thành tác nhân cảm ứng lão hóa mơ sản xuất ethylene cách nhanh chóng chí mơ xa liên quan trực tiếp với tách rời quan thực vật; số nghiên cứu khác cho thấy methyl jasmonate có chức điều chỉnh thời gian rụng (Patterson, 2001) Hiện tượng nhiễm vi sinh vi nhân giống thực vật Sự nhiễm vi sinh vật bình ni cấy vấn đề nghiêm trọng phịng thí nghiệm nào, đặc biệt phịng thí nghiệm thương mại gây thiệt hại kinh tế to lớn không trực tiếp môi trường ni cấy mà cịn làm chậm tiến độ sản xuất Trong phịng thí nghiệm thương mại thiết lập tốt, vấn đề nhiễm nhấn mạnh thực tế loại ô nhiễm thay đổi theo thời gian Ban đầu, nhiễm vi khuẩn, nấm, virus bệnh liên quan đến thực vật, vài trường hợp vấn đề nhiễm vi sinh vật nghiêm trọng vi khuẩn phát triển chậm mang mô thực vật mà không bị phát xuất giai đoạn muộn thứ dường (Bhojwani, Dantu, 2013) Nhiễm vi sinh vật vi nhân giống chia làm hai loại: ngoại sinh từ mơi trường nội sinh có nguồn gốc từ mẫu cấy, dù dạng chúng gây thiệt hại nghiêm trọng cho mẫu cấy giai đoạn sinh trưởng khác (Hình 2A) Các vi sinh vật ngoại sinh loại bỏ cách hiệu cách sử dụng chất khử trùng bề mặt; nhiễm nội sinh dễ dàng loại bỏ vấn đề nghiêm trọng vi nhân giống thực vật vi khuẩn nội sinh cư trú thực vật cầu nối tế bào không gian nội bào tế bào nhu mô 30 vỏ Nhiễm khuẩn nội sinh đặc biệt rắc rối chúng khơng thể rõ ràng mẫu thực vật bắt đầu đưa vào môi trường nuôi cấy xuất vài tuần sau tồn qua lần cấy chuyền Nhiễm vi sinh vật tiềm ẩn vi nhân giống dẫn đến thay đổi tăng trưởng mẫu cấy, gây hoại tử mẫu, giảm gia tăng chồi rễ (Bairu, 2008) Hiện tượng nhiễm xuất nhanh chóng thường xuất sau 2-4 tháng kể từ bắt đầu ni cấy (Oda et al., 2003) Do đó, để đảm bảo hiệu việc kiểm soát vi sinh vật điều sau khuyến nghị: môi trường nuôi cấy cần phải tiệt trùng trước sử dụng; sử dụng nguồn mẫu bệnh khuyến cáo nên sử dụng mô cấy non, mùa xuân mùa đơng thời điểm thích hợp để thu nhận mô cấy; mô bị nhiễm cần làm cách rửa nước cất vô trùng sau ngâm vào dung dịch kháng sinh trước cấy vào môi trường; dụng cụ nuôi cấy (dao cấy, kẹp, đĩa cấy, giấy…) cần khử trùng trước đưa vào sử dụng 180°C/2 h (Alkhateeb, 2008) Trong vi nhân giống việc bổ sung kháng sinh vào môi trường sử dụng để giảm tượng nhiễm vi sinh vật Zacchini, Agazio (2004) báo cáo sử dụng thủy ngân clorua sodium hypochloride bước khử trùng kháng sinh bổ sung mơi trường ni cấy giúp khắc phục tình trạng ô nhiễm nghiêm trọng nuôi cấy ô liu Nebbiar AgNPs sử dụng chất khử trùng bề mặt nhân giống African violet, theo đó, sử dụng AgNPs nồng độ 0,05% 15 phút cho hiệu khử trùng tốt mà tác động xấu đến sinh trưởng phát triển mẫu cấy so với sử dụng thủy ngân clorua sodium hypochloride (Dương Tấn Nhựt et al., 2018) Sử dụng AgNPs nồng độ thích hợp giúp loại bỏ vi sinh vật gây nhiễm (nấm, vi khuẩn, …) vi nhân giống thực vật nhiều đối tượng trồng (Spinoso-Castillo et al., 2017) AgNPs nồng độ 7,5 mg/L có khả Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 18(1): 23-39, 2020 ức chế loài vi khuẩn (Corynebacterium sp., Enterobacter sp., Arthrobacter sp., Agrobacterium sp., Xanthomonas sp., Pseudomonas sp., Bacillus sp Micrococcus sp.) loài nấm (Aspergillus sp., Fusarium sp Alterneria sp.) nuôi cấy vi thủy canh hoa cúc trắng (Tung et al., 2018) Ngoài để hạn chế nhiễm cần phải kiểm tra thường xuyên vi khuẩn gây bệnh cần phải loại bỏ nguồn mẫu bị nhiễm bệnh, hạn chế vào khu vực nuôi cấy, tiến hành khử trùng formaldehyde thiobendazole thường xuyên để giảm tỷ lệ ô nhiễm… Tác động rõ nhiễm môi trường nuôi cấy thời gian, tiền bạc, gây cản trở q trình thí nghiệm, ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường nuôi cấy dẫn đến kết thực nghiệm khơng xác, sai lệch mát sản phẩm có giá trị Vì cần phải có phương pháp hiệu để hạn chế khắc phục tình trạng (Bhojwani, Dantu, 2013) Hiện tượng hoại tử mẫu cấy (chồi đỉnh, rễ, mẫu mô nuôi cấy) Hiện tượng hoại tử chồi đỉnh hay hoại tử mẫu cấy trở ngại lớn tiến trình nhân giống thành cơng số lồi thực vật ni cấy mô (Bairu et al., 2009) Các triệu chứng tượng mẫu hóa nâu đen, chồi non vàng dần hoại tử chết (Hình 2C, D) Giả thiết thấy tượng hoại tử chồi đỉnh thiếu hụt chất dinh dưỡng Các triệu chứng thiếu hụt chất dinh dưỡng yếu tố di động canxi (Ca) boron (B) xuất mô phân sinh non, triệu chứng dư thừa khoáng chất quan sát thấy già (Chiruvella et al., 2012) Tuy nhiên, tượng hoại tử mẫu hay chồi đỉnh vi nhân giống chịu tác động kết hợp nhiều yếu tố thành phần muối, nồng độ loại chất điều hòa sinh trưởng, nồng độ than hoạt tính bổ sung vào mơi trường, nguồn nồng độ đường, tần suất cấy chuyền, số rối loạn sinh lý liên quan đến rễ, hàm lượng lưu huỳnh, tỷ lệ NH4+/NO3- biến động pH (Chiruvella et al., 2012) Nồng độ loại chất điều hòa sinh trưởng thực vật yếu tố gây nên tượng hoại tử mẫu cấy, nghiên cứu cho thấy chồi nuôi cấy môi trường bổ sung với isopentenyladenine (iP), thidiazuron (TDZ) kinetin có vàng hoại tử mức nồng độ cao, đó, cần giảm nồng độ cytokinin xuống mức thấp hoạt động ức chế rễ chúng (Piagnani et al., 1996) Mặt khác có báo cáo cho 6benzylaminopurine (BA) lại khơng ảnh hưởng đến hoại tử chồi, Perez-Tornero Burgos (2000) phát việc tiền xử lý chồi vào dung dịch BA trước chuyển sang môi trường rễ giúp khắc phục tình trạng hoại tử đỉnh mai, hạt dẻ in vitro Từ cho thấy tác động chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên tượng hoại tử mẫu cấy phụ thuộc vào kiểu gen thực vật Ngược lại với cytokinin, auxin lại tỏ hiệu với vai trị giúp hạn chế tượng hoại tử, indole-3-butyric acid (IBA) bổ sung vào môi trường rễ giúp giảm thối hóa đỉnh làm thay đổi sản xuất tính sẵn có cytokinin nội sinh từ ngăn chặn tượng hoại tử mẫu (Perez, Burgos, 2000) Canxi cation thiết yếu tìm thấy với số lượng tương đối lớn mơ thực vật, Ca có mặt thành tế bào, màng tế bào, không bào chiếm 10% tổng trọng lượng khơ số lồi thực vật (Hirschi, 2004) Ca hoạt động chất mang thơng tin cịn đóng vai trị chất điều chỉnh tăng trưởng phát triển trồng, liên quan đến kéo dài phân chia tế bào, ảnh hưởng đến độ pH tế bào, tăng cường tính ổn định màng tế bào cách kết nối protein lipid khác bề mặt màng tế bào, cung cấp khả chịu stress (sinh học phi sinh học) ngăn chặn lão hóa sinh lý Đây lý thiếu Ca thực vật, hầu hết trường hợp, có liên quan đến bệnh lý vấn đề sau thu hoạch (Hepler, 2005; Hirschi, 2004) Có nhiều báo cáo vai trị Ca ngăn ngừa hoại tử chồi đỉnh 31 Hà Thị Mỹ Ngân et al nuôi cấy in vitro ex vitro Bổ sung Ca vào môi trường làm giảm hoại tử hạt dẻ, mẫu đơn in vitro Việc sử dụng nguồn cung cấp canxi khác (calcium chloride, calcium acetate, calcium ammonium nitrate calcium pantothenate) tác động đến tượng thối hóa mẫu cấy, Ca cung cấp dạng muối calcium chloride làm giảm tượng thối hóa không ức chế nhân lên kéo dài chồi Ca cung cấp dạng calcium acetate gây ức chế nghiêm trọng kéo dài chồi (Piagnani et al., 1996; Wang, Van Staden, 2001) Qua cho thấy Ca có ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển hoại tử chồi, mẫu cấy nhiên ảnh hưởng Ca thay đổi từ lồi sang lồi khác phụ thuộc nhiều vào kiểu gen thực vật Một số phương pháp khác sử dụng để khắc phục tượng hoại tử mẫu cấy: thay đổi nồng độ môi trường nuôi cấy với giảm nồng độ thành phần dinh dưỡng (khoáng đa lượng, vi lượng vitamin) có mơi trường xuống cịn phần tư, sử dụng nguồn cacbon khác (glucose, fructose), ni cấy thống khí, sử dụng than hoạt tính với nồng độ thích hợp Ngồi việc loại bỏ lá, vùng mẫu bị vàng, nâu trước chồi sử dụng để nuôi cấy để làm giảm bớt tượng (Chiruvella et al., 2012) Hiện tượng hóa nâu mẫu môi trường nuôi cấy Trong vi nhân giống nhiều thân gỗ số loài thân thảo thường xuất tượng hóa nâu mẫu cấy hóa nâu mơi trường Đơi tình trạng hóa nâu trở nên nghiêm trọng đến mức mẫu cấy có màu nâu sẫm/đen, trở nên hoại tử cuối chết (Hình 2B, E) Các nhà khoa học cho sản sinh phenol suốt q trình ni cấy gây oxy hóa làm cho mẫu cấy mơi trường bị hóa nâu (Bhojwani, Dantu, 2013) Tình trạng hóa nâu xảy vị trí mặt cắt mẫu cắt phenol sản xuất liên tục suốt trình ni cấy Những phenol trở nên độc hại với mẫu cấy 32 cách liên kết ngược với protein liên kết hydro trình oxy hóa chúng tạo thành quinon có hoạt tính cao, quinon sau polymer hóa oxy hóa protein để hình thành hợp chất melanic gọi polyphenol độc tố thực vật Các enzyme oxy hóa phenol bị ảnh hưởng yếu tố môi trường, diện ánh sáng nhiệt độ cao làm tăng tỷ lệ hóa nâu cách tăng hoạt động enzyme Trong tự nhiên, hợp chất phenol biết đóng vai trị quan trọng thực vật đáp ứng với cân hormone thực vật, ngăn chặn, kháng bệnh bảo vệ mô bị tổn thương nhiễm trùng Các phenol khơng có vai trị phịng thủ, bảo vệ mà cịn đóng vai trò chất nguồn cho tổng hợp số hợp chất khác carbohydrate, amino acid số protein q trình biệt hóa phát sinh hình thái thực vật (Dobránszki, Teixeira, 2010) Mức độ hóa nâu phụ thuộc vào lồi ni cấy, kiểu gen, độ tuổi mô cấy (mô già cho thấy khả bị hóa nâu cao hơn), mùa bắt đầu ni cấy (nhiều vào mùa đông mùa thu) thành phần trạng thái mơi trường (sự hóa nâu xuất nhiều mẫu nuôi cấy môi trường lỏng) (Hình 2E) Một số phương pháp đơn giản để bảo vệ mẫu cấy khỏi hóa nâu cấy chuyền thường xuyên giai đoạn nuôi cấy ban đầu; hạn chế oxi hóa phenol phương pháp nuôi cấy tối cường độ ánh sáng thấp (3-4 µmol.m -2.s-1); giảm nồng độ muối mơi trường giúp làm giảm tượng hóa nâu mẫu cấy mô sẹo kiwi (Actinidia arguta) (Han et al., 2010) Các khống kim loại mơi trường ni cấy Mn2+, Cu2+ chất đồng dạng với enzyme peroxidase phenolase (tương ứng) nên giảm loại bỏ để khơng kích thích enzyme oxy hóa hợp chất phenol ngăn ngừa tượng hóa nâu mẫu cấy (Bhojwani, Dantu, 2013) Bên cạnh biện pháp nêu việc bổ sung chất bổ trợ acid ascorbic (AA), cystein-HCl Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 18(1): 23-39, 2020 acid citric (chất chống oxy hố), polyvinylpyrolidone (PVP) than hoạt tính giúp hấp thụ phenol từ kiểm sốt tình trạng hóa nâu mẫu cấy mơi trường ni cấy Trong tái sinh chồi giống chuối Formosana, tình trạng hóa nâu gây chết 100% mẫu cấy, việc bổ sung thêm 0,01% AA vào môi trường không ngăn ngừa tượng hóa nâu gây chết mẫu mà cịn làm tăng đáng kể số lượng hình thành Tuy nhiên, AA có hiệu thêm vào bề mặt mơi trường, khơng hiệu thêm vào môi trường trước hấp khử trùng nhiệt độ làm hoạt tính phân hủy AA (Bhojwani, Dantu, 2013) Một phương pháp hiệu để chống lại vấn đề tình trạng hóa nâu mẫu Sideritis trojana kết hợp 100 mg/L AA 50 mg/L acid citric (Çưrdük, Aki, 2011) Hình Một số tượng bất thường nhân giống in vitro thực vật (tiếp theo) Hiện tượng nhiễm vi sinh vật (A), hóa nâu hoại tử rễ hoa hồng (B), hoại tử chồi đỉnh hoa hồng (C), hoại tử tồn mẫu cấy hoa hồng (D), hóa nâu mẫu cấy lan đồng tiền (E) Các chất bổ sung khác vào môi trường giúp ngăn ngừa tượng hóa nâu polyvinylpyrolidone (PVP), canxi pantothenate than hoạt tính có khả hấp thụ 33 Hà Thị Mỹ Ngân et al phenol PVP, polyamide thường sử dụng để hấp phụ sắc ký, cịn sử dụng để hấp thụ hợp chất phenolic nuôi cấy mô PVP hấp thụ phenol thông qua liên kết hydro, ngăn chặn q trình oxy hóa trùng hợp chúng Calcium pantothenate chất phụ gia môi trường báo cáo giúp làm giảm màu nâu mô nuôi cấy Mẫu ngâm hỗ hợp acid ascorbic acid citric cho thấy màu nâu xuất sau thời gian nuôi cấy, trường hợp này, nơi màu nâu tái phát, hiệu canxi pantothenate việc giảm màu nâu thử nghiệm Canxi pantothenate bổ sung vào môi trường giúp giảm hóa nâu đến mức độ định mẫu cấy sử dụng nồng độ cao (200 mg/L), nồng độ canxi pantothenate thấp tỏ khơng hiệu việc giảm mức độ hóa nâu Khả than hoạt tính để hấp thụ chất ức chế ghi nhận Bổ sung than hoạt tính báo cáo giúp tránh tích tụ hợp chất phenolic ni cấy mơ, nhiên hiệu đạt không cao phenol tiếp tục hình thành từ mẫu cấy, mẫu tiếp tục hóa nâu hoại tử (Bajaj, 1996) Nhìn chung chất hấp phụ bổ sung vào môi trường ni cấy giúp hạn chế tượng hóa nâu mẫu cấy môi trường nuôi cấy, nhiên, chất hấp thụ hợp chất hữu ích cần thiết cho thực vật từ mơi trường việc sử dụng loại nồng độ chúng nên lựa chọn cách thận trọng (Bhojwani, Dantu, 2013) Một số vấn đề khác Nhiều lồi thực vật khơng tn theo quy trình ni cấy mơ chúng khơng khó tái sinh ống nghiệm Sự hạn chế thể rõ rệt nhiều lồi thân gỗ khắc phục cách sử dụng mô, phận chưa trưởng thành non cây; bên cạnh đó, xử lý với cytokinin làm trẻ hóa mẫu cấy, kích thích phát triển chồi non cho phép sử dụng chúng nguồn mẫu để bắt đầu cho 34 q trình ni cấy in vitro Một số lồi thực vật thân gỗ Prunus, Eucalyptus, Pinus Sequoia ni cấy mơi trường có bổ sung cytokinin nồng độ thích hợp kích hoạt hình thành mô phân sinh Sự thành công phương pháp nhân giống in vitro đối tượng thân gỗ ăn đóng vai trị quan trọng công tác nhân giống, bảo tồn nguồn gene quý góp phần phục vụ cho mục đích thương mại (Ahuja, 2013) Một khía cạnh quan trọng cần xem xét tái sinh từ phương pháp vi nhân giống trì tính tồn vẹn di truyền mẹ Thuật ngữ 'biến dị soma' đặt để biến đổi di truyền loại trồng, tự nhiên, đa dạng di truyền thay đổi di truyền quần thể tạo thông qua kiện tái tổ hợp Trong vi nhân giống, tăng trưởng tái sinh tế bào thực vật thành toàn thực vật q trình vơ tính liên quan đến việc phân chia tế bào Trong trình xuất biến đổi tự phát ngẫu nhiên khơng kiểm sốt được, biến dị soma báo cáo mức độ khác (hình thái, tế bào học, sinh hóa cấp độ phân tử) Điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường nuôi cấy, thời gian chu kỳ ni cấy gây đột biến số quan nuôi cấy (mô sẹo, tế bào trần, phơi soma, …) đơi cho thấy biến đổi kiểu hình lẫn kiểu gen Thông thường, thay đổi xảy cách tự phát kết thay đổi tạm thời thay đổi di truyền vĩnh viễn tế bào mô suốt q trình ni cấy ống nghiệm Những thay đổi tạm thời kết từ tác động không phụ thuộc kiểu gen (epigenetic) tác động sinh lý, tác động tránh khỏi phục hồi Ngược lại, thay đổi vĩnh viễn liên quan đến di truyền thường biểu thị biến đổi tồn từ trước mẹ kết biến dị de novo Sự xuất biến dị soma vấn đề quan tâm lớn hệ thống vi nhân giống nào, để đánh giá diện nó, số chiến lược sử dụng để phát Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 18(1): 23-39, 2020 biến thể theo thời gian, dựa nhiều yếu tố định từ đặc điểm hình thái hay phân tích tế bào (biến đổi số cấu trúc nhiễm sắc thể), sử dụng marker phân tử phương pháp sinh hóa Các nghiên cứu biến dị soma quan trọng với mục đích sản xuất giống trồng đồng mặt di truyền sử dụng công cụ để tạo biến đổi di truyền có giá trị để cải thiện trồng thơng qua việc lựa chọn biến thể có khả kháng bệnh, cải thiện chất lượng, suất cao (Leva et al., 2012) Bên cạnh đó, ngày với nhu cầu giống bệnh, đồng đáp ứng thị hiếu người tiêu dùng số lượng lớn trồng có giá trị kinh tế cao bao gồm loại rau, hoa, cảnh, ăn quả, rừng dược liệu nhân giống phương pháp nuôi cấy mô Hơn tỷ giống năm sản xuất phương pháp này, nhiên, trồng vi nhân giống thường đắt trồng phương pháp truyền thống, cần nhiều trang thiết bị vận hành, môi trường nuôi cấy đặc biệt, nhiều vật tư hóa chất địi hỏi cần sử dụng suốt q trình ni cấy Do chi phí sản xuất cao nên kéo theo giá thành sản phẩm nuôi cấy cao Để giảm thiểu chi phí người ta thường giảm chi phí từ nhân cơng lao động lượng điện tiêu thụ, nhân giống theo hợp đồng, rút ngắn giảm bớt số giai đoạn nuôi cấy tiến trình nhân giống in vitro, tự động hóa mở rộng quy mơ sản xuất … (Tomar et al., 2008) lý học (thủy tinh thể, vàng rụng lá, hoại tử mẫu cấy, hóa nâu mẫu cấy, biến dị soma ) Việc nghiên cứu tìm nguyên nhân giải pháp khắc phục tượng bất thường việc làm mang tính cấp thiết để hạn chế rủi ro, nâng cao hiệu suất chất lượng vi nhân giống đồng thời hạ giá thành sản phẩm Có lẽ khơng xác định khắc phục tất tác nhân, tượng bất thường, xác định nhiều tượng có nhiều khả kiểm sốt tốt trình vi nhân giống thực vật Từ đó, hạn chế, khắc phục, loại bỏ tượng bất thường không mong muốn tận dụng tượng hữu ích q trình vi nhân giống thực vật Lời cảm ơn: Nhóm tác giả xin chân thành cảm ơn tài trợ kinh phí đề tài “Nghiên cứu tác động hạt nano kim loại lên khả tái sinh, sinh trưởng, phát triển tích lũy hoạt chất q trình nhân giống vơ tính số trồng có giá trị kinh tế cao Việt Nam” thuộc Hợp phần IV: “Nghiên cứu chế tác động đánh giá an toàn sinh học chế phẩm nano nghiên cứu dự án”, mã số: VAST.TĐ.NANO.04/15– 18 Phòng Sinh học phân tử Chọn tạo giống trồng (Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên) tạo điều kiện cho chúng tơi hồn thành nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO KẾT LUẬN Ahuja MR (2013) Micropropagation of woody plants Springer Science and Business Media Vi nhân giống thực vật q trình phức tạp đóng vai trị quan trọng cơng tác chọn tạo giống Việc sử dụng phương pháp nuôi cấy mô để nhân nhanh lồi phục vụ cho mục đích thương mại thường có chi phí giá thành cao tác động rủi ro bất thường khác sau trình vi nhân giống Các vấn đề gặp phải hầu hết phịng thí nghiệm ni cấy mơ có hai loại: bệnh lý (nhiễm vi sinh vật) sinh Alkhateeb AA (2008) A review the problems facing the use of tissue culture technique in date palm (Phoenix dactylifera L.) Sci J King Faisal Univ Basic Appl Sci 9: 85-104 Agustí J, Merelo P, Cercós M, Tadeo FR, Talón M (2009) Comparative transcriptional survey between laser-microdissected cells from laminar abscission zone and petiolar cortical tissue during ethylenepromoted abscission in citrus leaves BMC Plant Biol 9: 1-20 35 Hà Thị Mỹ Ngân et al Bairu M, Jain N, Stirk W, Doležal K, Van Staden J (2009) Solving the problem of shoot-tip necrosis in Harpagophytum procumbens by changing the cytokinin types, calcium and boron concentrations in the medium S Afr J Bot 75(1): 122-127 phát triển cúc, dâu tây, đồng tiền nuôi cấy in vitro Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 12(1): 103-111 Bairu MW (2008) Characterization and control of micropropagation problems in Aloe, Devil’ claw and Banana Doctor of phisology University of Kwazulu Natal García-Gonzáles R, Quiroz R, Carrasco B, Caligari P (2010) Plant tissue culture: Current status, opportunities and challenges Cien Inv Agr 37(3): 530 Bajaj Y (1996) Biotechnology in agriculture and forestry 35 Trees IV Springer-Verlag, Berlin Gaspar T, Franck T, Bisbis B, Kevers C, Jouve L, Hausman JF, Dommes J (2002) Concepts in plant stress physiology Application to plant tissue cultures Plant Growth Regul 37: 263–285 Bahmani R, Karami O, Gholami M (2009) Influence of carbon sources and their concentrations on rooting and hyperhydricity of apple rootstock MM.106 Appl Sci 6(11): 1513–1517 Dobránszki J, Teixeira da Silva JA (2010) Micropropagation of apple - A review Biotechnol Adv 28: 462-488 Bhojwani SS, Dantu PK (2013) Plant Tissue Culture: An Introductory Text Springer, India Gaspar TH, Kevers C, Debergh P, Maene L, Paques M, Boxus PH (1987) Vitrification: morphological, physiological and ecological aspects In Bonga JM, Durzan DJ, eds Cell and tissue culture in forestry, Vol Martinus Nijhoff, Dordrecht: 152-166 Chang C (2016) Q and A: How plants respond to ethylene and what is its importance? BMC Biol 14: 1–7 George EF, Hall MA, De Klert GJ (2008) Plant propagation by tissue culture, 3rd edn, Vol 1, The background Springer, The Netherlands Chiruvella KK, Mohammed A, Dampuri G, Ghanta RG (2012) In vitro shoot regeneration and control of shoot tip necrosis in tissue cultures of soymida febrifuga (Roxb.) A Juss Plant Tiss Cult Biotechnol 21(1): 11-25 González-Carranza ZH, Shahid AA, Zhang L, Liu Y, Ninsuwan U, Roberts JA (2012) A novel approach to dissect the abscission process in Arabidopsis Plant Physiol 160(3): 1342-1356 Çưrdük N, Aki C (2011) Inhibition of browning problem during micropropagation of Sideritis trojana bornm., an endemic medicinal herb of Turkey Rom Biotechnol Lett 16(6): 61-67 Da Silva JAT, Dobránszki J, Ross S (2013) Phloroglucinol in plant tissue culture Vitr Cell Dev Biol Plant 49: 1-16 Dương Tấn Nhựt, Dương Bảo Trinh, Đỗ Mạnh Cường, Hoàng Thanh Tùng, Nguyễn Phúc Huy, Vũ Thị Hiền, Vũ Quốc Luận, Lê Thị Thu Hiền, Nguyễn Hoài Châu (2018) Khảo sát nano bạc làm chất khử trùng mẫu nhân giống vơ tính african violet (Saintpaulia ionantha H Wendl.) Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 16(1): 87-98 Dương Tấn Nhựt, Hồ Thanh Tâm, Nguyễn Thị Thanh Hiền, Lê Kim Cương, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Phúc Huy, Vũ Thị Hiền, Trịnh Thị Hương, Nguyễn Hồng Hoàng, Nguyễn Xuân Tuấn, Nguyễn Việt Cường, Đỗ Mạnh Cường, Nguyễn Hồi Châu Ngơ Quốc Bưu (2014) Khảo sát ảnh hưởng nano bạc lên sinh trưởng 36 González-Carranza ZH, Whitelaw CA, Swarup R, Roberts JA (2002) Temporal and spatial expression of a polygalacturonase during leaf and flower abscission in oilseed rape and Arabidopsis Plant Physiol 128(2): 534-543 Han M, Gleave transformation of strength of basal callus browning 138 AP, Wang T (2010) Efficient Actinidia arguta by reducing the salts in the medium to alleviate Plant Biotechnol Rep 4(2): 129- Hà Thị Mỹ Ngân, Trần Đào Hồng Trinh, Đỗ Mạnh Cường, Hoàng Thanh Tùng, Nguyễn Thị Nhật Linh, Phan Lê Hà Nguyễn, Vũ Thị Hiền, Vũ Quốc Luận, Bùi Văn Lệ, Dương Tấn Nhựt (2019) Hạn chế tượng thủy tinh thể gia tăng tỷ lệ sống hoa Đồng tiền (Gerbera jamesonii) nuôi cấy in vitro mơi trường có bổ sung nano bạc Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 17(1): 115-124 Hà Thị Mỹ Ngân, Hồng Thanh Tùng, Ngơ Đại Nghiệp, Bùi Văn Lệ, Dương Tấn Nhựt (2019) Tác động nano bạc lên hạn chế khí ethylene hoạt độ enzyme thủy phân vi nhân giống Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 18(1): 23-39, 2020 hoa hồng (Rosa hybrida L ‘Baby Love’) Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 17(3): 505-517 abscission zone in response to auxin depletion Plant Physiol 154(4): 1929-1956 Hepler PK (2005) Calcium: a central regulator of plant growth and development Plant Cell 17(8): 2142-2155 Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures Physiol Planta 15(3): 473-497 Hirschi KD (2004) The calcium conundrum Both versatile nutrient and specific signal Plant Physiol 136(1): 2438-2442 Nair R, Varghese SH, Nair BG, Maekawa T, Yoshida Y, Kumar DS (2010) Nanoparticulate material delivery to plants Plant Sci 179(3): 154163 Kharrazi IVM, Nemati H, Tehranifar A, Bagheri A, Sharifi A (2011) Culture of Carnation (Dianthus caryophyllus L.) focusing on the problem of vitrification J Biol Environ Sci 5(13): 1-6 Kumar P, Lakshmanan P, Thorpe TA (1998) Regulation of morphogenesis in plant tissue culture by ethylene In vitro Cell Dev Biol Plant 34(2): 93103 Kumar V, Parvatam G, Ravishankar GA (2009) AgNO3 - a potential regulator of ethylene activity and plant growth modulator Electron J Biotechnol 12(2): 1-15 Leva A, Petruccelli R, Rinaldi L (2012) Somaclonal variation in tissue culture: a case study with olive In Leva A, ed Recent advances in plant in vitro culture InTech: 123-150 Li C, Zhou A, Sang T (2006) Rice domestication by reducing shattering Sci 311(5769): 1936-1939 Luong Thien Nghia, Hoang Thanh Tung, Nguyen Phuc Huy, Vu Quoc Luan, Duong Tan Nhut (2017) The effects of silver nanoparticles on growth of Chrysanthemum morifolium Ramat cv ‘JIMBA’ in different cultural systems Vietnam J Sci Technol 55(4): 493-504 MacDonald MT, Lada RR, Dorais M, Pepin S (2011) Endogenous and exogenous ethylene induces needle abscission and cellulase activity in post-harvest balsam fir (Abies balsamea L.) Trees 25(5): 947 Mayor ML, Nestares G, Zorzoli R, Picardi LA (2003) Reduction of hyperhydricity in sunflower tissue culture Plant Cell Tissue Organ Cult 72: 99103 Meir S, Philosoph-Hadas S, Sundaresan S, Selvaraj KV, Burd S, Ophir R, Kochanek B, Reid MS, Jiang C-Z, Lers A (2010) Microarray analysis of the abscission-related transcriptome in the tomato flower Ngan HTM, Cuong DM, Tung HT, Nghiep ND, Le BV, Nhut DT (2020) The effect of cobalt and silver nanoparticles on overcoming leaf abscission and enhanced growth of rose (Rosa hybrida L ‘Baby Love’) plantlets cultured in vitro Plant Cell Tiss Org Cult 141(2): 393-405 Oda ML, de Faria RT, Fonseca ICB, Silva GL (2003) Fungicide and germicide on contamination escaping in the in vitro propagation of Oncidium varicosum Lindl (Orchidaceae) Ciên Agrá 24 (2): 273-276 Patterson SE (2001) Cutting loose Abscission and dehiscence in Arabidopsis Plant Physiol 126(2): 494-500 Perez-Tornero O, Burgos L (2000) Different media requirements for micropropagation of apricot cultivars Plant, Cell Tiss Org Cult 63: 133-141 Phan C, Letouze R (1983) A comparative study of chlorophyll, phenolic and protein contents, and of hydroxycinnamate: CoA ligase activity of normal and ‘vitreous’ plants (Prunus avium L.) obtained in vitro Plant Sci Lett 31(2-3): 323-327 Piagnani C, Zocchi G, Mignani I (1996) Influence of Ca2+ and 6-benzyladenine on chestnut (Castanea sativa Mill.) in vitro shoot-tip necrosis Plant Sci 118(1): 89-95 Roberts JA, Elliott KA, Gonzalez-Carranza ZH (2002) Abscission, dehiscence, and other cell separation processes Annu Rev Plant Biol 53(1): 131-158 Spinoso-Castillo J, Chavez-Santoscoy R, Bogdanchikova N, Pérez-Sato J, Morales-Ramos V, Bello-Bello J (2017) Antimicrobial and hormetic effects of silver nanoparticles on in vitro regeneration of vanilla (Vanilla planifolia Jacks ex Andrews) using a temporary immersion system 37 Hà Thị Mỹ Ngân et al Plant Cell Tiss Org Cult 129(2): 195-207 Taylor JE, Whitelaw CA (2001) Signals in abscission New Phytol 151(2): 323-340 Thao NP, Khan MIR, Thu NBA, Hoang XLT, Asgher M, Khan NA, Tran L-SP (2015) Role of ethylene and its cross talk with other signaling molecules in plant responses to heavy metal stress Plant physiol 169 (1):73-84 Tomar UK, Negi U, Sinha AK, Dantu PK (2008) Economics and factors influencing cost of microprop- agated plants My Forest 44:135–147 Tucker ML, Burke A, Murphy CA, Thai VK, Ehrenfried ML (2007) Gene expression profiles for cell wall-modifying proteins associated with soybean cyst nematode infection, petiole abscission, root tips, flowers, apical buds, and leaves J Exp Bot 58(12): 3395-3406 Tucker ML, Whitelaw CA, Lyssenko NN, Nath P (2002) Functional analysis of regulatory elements in the gene promoter for an abscission-specific cellulase from bean and isolation, expression, and binding affinity of three TGA-type basic leucine zipper transcription factors Plant Physiol 130(3): 1487-1496 Tung HT, Nam NB, Huy NP, Luan VQ, Hien VT, Phuong TTB, Dung LT, Loc NH, Nhut DT (2018) A system for large scale production of chrysanthemum using microponics with the supplement of silver nanoparticles under light-emitting diodes Sci Hortic 232: 153-161 Wang H, Van Staden J (2001) Establishment of in vitro cultures of tree peonies S Afr J Bot 67(2): 358361 Yam TW, Arditti J (2009) History of orchid propagation: a mirror of the history of biotechnology Plant Biotechnol Rep 3: 1-56 Zacchini M, Agazio M (2004) Micropropagation of a local olive cultivar for germplasm preservation Biol Plant 48: 589-592 
 Ziv M (1991) Vitrification: morphologycal and physiological disorders of in vitro plants In Debergh PC, Zimmerman RH, eds Micropropagation, Technology and Application Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, the Nertherlands: 45-69 ABNORMAL SYMPTOMS IN MICROPROPAGATION AND STRATEGIES TO OVERCOME Ha Thi My Ngan1,2, Hoang Thanh Tung2, Bui Van Le1, Duong Tan Nhut2 University of Science, Vietnam National University Ho Chi Minh City, Ho Chi Minh City Tay Nguyen Institute for Scientific Research, Vietnam Academy of Science and Technology SUMMARY Nowaday, plant cell, tissue and organ culture has become a standard and popular propagation method for many crops including ornamental plants, medicinal plants, fruit trees and green vegetables The advantage of this method is that it can generate a huge number of genetically identical seedlings, effectively control the pathogenicity in order to produce disease-free plants, become a tool for conservation and development of genetic sources and support study of physiological characteristics of plants However, this method still has some limitations such as abnormal physiological morphology and anatomical structure; necrosis and deformities plants; stomata loss of function, etc These abnormalities have great impacts on shoot multiplication as well as the growth and development of the plants after transplanted from the culture vessels to the nursery stage The components of in vitro culture conditions such as culture system, composition and content of nutrients, plant growth regulators used in the culture medium, light, temperature and humidity, age and origin of explants, etc., are the main causes of the abnormalities Therefore, optimization of culture system to improve the quality of seedlings has always been one of the main targets of commercial micropropagation In this review, we focused on some frequently abnormal symptoms in micro - propagation such as 38 Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 18(1): 23-39, 2020 vitrification, yellowing and abscission of leaves; microbial contamination; necrosis of shoot-tip, roots and tissues culture; browning of explants and medium culture and other restrictions More over, this report showed some the effective solutions to overcome these abnormal phenomena Keywords: Abscission, browning, contamination, in vitro culture, necrosis explant, vitrification 39 ... khơng xác định khắc phục tất tác nhân, tượng bất thường, xác định nhiều tượng có nhiều khả kiểm sốt tốt trình vi nhân giống thực vật Từ đó, hạn chế, khắc phục, loại bỏ tượng bất thường không mong... mg/L AA 50 mg/L acid citric (Çưrdük, Aki, 2011) Hình Một số tượng bất thường nhân giống in vitro thực vật (tiếp theo) Hiện tượng nhiễm vi sinh vật (A), hóa nâu hoại tử rễ hoa hồng (B), hoại tử chồi... 2012) Hình Một số tượng bất thường nhân giống in vitro thực vật Thủy tinh thể chồi cẩm chướng (A), chồi hoa hồng (B) chồi đồng tiền (C) Hiện tượng vàng rụng chồi hoa hồng nuôi cấy in vitro (D)