Bộ Khoa học Công nghệ Chơng trình KC- 04 Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật Đề tài cấp nhà nớc Đề tài: KC 04 - 32 Nghiên cứu sản xuất Bộ sinh phẩm để chẩn đoán nhanh bƯnh sèt Dengue/ sèt xt hut Dengue vµ bƯnh Viêm đờng hô hấp cấp (SARS) Việt Nam GS.TS Trơng uyên Ninh Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng 6701 24/12/2007 Hà Nội, 9- 2007 Bản quyền thuộc VVSDTTW- Bộ Y Tế Những chữ viết tắt báo cáo ☯ ARN Axit ribonucleic ADN Axit deoxyribonucleic CID Center of Infection Diseases Trung tâm bệnh nhiễm trùng CDC Center of Diseases Control Trung tâm kiểm soát bệnh tật ELISA Enzym linked Immunosorbent Assay Thư nghiƯm miƠn dÞch men GAC- ELISA IgG Capture ELISA Kỹ thuật miễn dịch enzym phát hiÖn IgG HI Hemagglutination Inhibition test HT HuyÕt FBS IFAT Fetal Bovin Serum (Immunofluorescent indirect Antibody Technique) Kü thuËt miễn dịch huỳnh quang gián tiếp IFDT (Immunofluorescent direct Antibody Technique) Kü tht miƠn dÞch hnh quang trùc tiÕp IFA (Immunofluorescent Indirect Antibody Technique) Kü tht miƠn dÞch hnh quang gi¸n tiÕp MAC - IgM Capture ELISA ELISA Kü thuËt miễn dịch enzym phát IgM ML Maximum Likelihood Phơng pháp chắn tối đa MP Maximum Pasimony Phơng pháp chi li tối đa NJ Neighbor Joining Phơng pháp kế cận liền kề NNKHC Primer PRNT Ngăn ngng kết hồng cầu (HI) Đọan mồi ADN Plaque Assay and Plaque Reduction Neutralization tests Kü thuËt trung hoµ vµ Kü thuËt Trung hoà giảm đám hoại tử PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi Polymeraza RT- PCR Reverse transcriptase- Polymerase chain reaction Phản ứng dao chép ngợc khuếch đại chuỗi SARS Severe Acute Respiratory Syndrome Hội chứng viêm đờng hô hấp cấp tÝnh SARS-CoV Severe Acute Respiratory Syndrome associated Corona virus Virus Corona g©y bƯnh SARS SD SXHD TCYTTG VVSDTTW VCNSH WHO Sèt Dengue Sèt xuÊt huyÕt Dengue Tæ chøc Y tÕ Thế giới Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương Viện C«ng nghƯ Sinh häc World Health Organization (Tỉ chøc Y tÕ ThÕ giíi) WB Western Blot Mơc lơc Sè TT Nội dung Trang Đặt vấn đề Chơng I Tổng quan tài liệu A Nghiên cứu virus Dengue gây nên bÖnh Sèt Dengue/ Sèt xuÊt huyÕt Dengue ë ViÖt Nam 1.1 BƯnh sèt Dengue vµ sèt xt hut Dengue 1.1.1 Biểu lâm sàng 1.1.2 Tác nhân truyền bệnh 1.1.3 Tình hình dịch bệnh giới 1.1.4 Tình hình dịch bệnh Việt Nam 11 1.2 Virus Dengue 11 1.2.1 Đặc điểm hình thái cấu trúc 13 1.2.2 Genome virus 13 1.2.3 Chu trình nhân lên chế gây bệnh virus Dengue 15 1.2.4 Đặc điểm kháng nguyên 17 1.2.4.1 Phát kháng thể 18 1.2.4.2 Phân lập virus 20 B nghiên cứu virus corona gây bệnh viêm đờng hô hấp cấp SARS Việt Nam 1.1 Tình hình nghiên cứu giới 26 1.2 Các nghiên cứu Việt nam 42 Chơng II Đối tợng phơng pháp nghiên cứu A Bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh bệnh Sốt Dengue/ Sốt xuất huyết Dengue 2.1 Đối tợng vật liệu 2.1.1 Đối tợng 2.1.2 Vật liệu 2.1.3 Hoá chất 49 2.2 Trang thiết bị 54 2.3 Phơng pháp 55 44 Các phơng pháp sản xuất kháng nguyên Kháng huyết 2.3.1 Sản xuất kháng nguyên 55 2.3.2 Phơng pháp sản xuất kháng huyết 58 2.3.3 Phơng pháp ELISA phát IgM 59 2.3.4 Kỹ thuật trung hoà (Neutralization Test - NT) 59 2.3.5 Phơng pháp miễn dịch hấp phụ liên kết men 60 phát KT IgG (GAC- ELISA) 2.4 Các phơng pháp phân lập xác định type virus 60 2.4.1 CÊy trun trªn n·o cht ỉ (1-3 ngày tuổi) 60 2.4.2 Phơng pháp phân lập virus tế bào muỗi 61 Aedes albopictus dòng C6/36 2.4.3 Kü tht miƠn dÞch hnh quang trùc tiÕp 64 (Direct ImmunoFluorescent Antibody Assay – DFA) 2.4.4 Kü tht miƠn dÞch huúnh quang gi¸n tiÕp 65 (Indirect ImmunoFluorescent AntibodyAssay – IFA) 2.4.5 Kỹ thuật Trung hoà giảm đám hoại tử 66 ( Plaque Reduction Neutralization Test - PRNT ) 2.4.6 Ph−¬ng pháp tổng hợp dây chuyền chuỗi nhờ polymerase 68 (RT-PCR - Polymerase Chain Reaction) C Bé sinh phÈm chÈn ®ãan nhanh bệnh Viêm đờng hô hấp cấp SARS 2.1 Đối tợng nghiên cứu 73 2.2 Vật liệu 74 2.2.1 Mẫu bƯnh phÈm 74 2.2.2 TÕ bµo 74 2.2.3 Sinh phÈm khác 74 2.2.4 Môi trờng hoá chất 75 2.2.5 Trang thiết bị dụng cụ 76 2.3 Phơng pháp 78 2.3.1 Phân lập virus SARS-CoV 78 2.3.2 Tạo plasmid tái tổ hợp 78 2.3.3 Biểu lộ tinh kháng nguyên 79 2.3.4 Phơng pháp hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme tóm bắt 80 kháng thể IgM (MAC- ELISA) 2.3.5 Phơng pháp Western Blot 81 Chơng III Kết Bàn luận A Kết sản xuất bé sinh phÈm chÈn ®ãan nhanh bƯnh sèt Dengue/ sèt xuÊt huyÕt Dengue 3.1 Nu«i cÊy virus Dengue type I (D1), virus Dengue type II (D2), virus 82 Dengue type III (D3) virus Dengue type IV (D4) tế bào muỗi Aedes albopictus dòng C6/36 3.1.1 Nhân virus Dengue type I (D1), virus Dengue type II (D2), virus 82 Dengue type III (D3) vµ virus Dengue type IV (D4) vào tế bào muỗi Aedes albopictus dòng C6/36 để tách chiết ARN 3.1.2 Quan sát nhân lên virus Dengue tế bào muỗi Aedes 100 albopictus dòng C6/ 36 dới kính hiển vi điện tử 3.2 Nghiên cứu qui trình công nghệ biểu hiện, tách chiết, tinh chế kháng 106 nguyên Dengue tái tổ hợp type 3.2.1 Kháng nguyên Dengue thô 106 3.2.2 Kháng nguyên tái tổ hợp 108 3.2.3 Quy trình tách chiết tinh chế kháng nguyên tái tổ hợp virus dengue từ chủng E coli cho bốn typ virus dengue Tách dòng xác định trình tự đọan gen PreM E cđa type virus 109 3.3 117 Dengue 3.3.1 T¸ch RNA tổng số tế bào muỗi C6/36 117 3.3.2 Khuếch đại đoạn gene PreM E phơng pháp RT-PCR 118 3.3.3 Biểu kháng nguyên màng vỏ cña virus Dengue type 1, 2, 3, 148 hƯ nÊm men Pichia pastoris 3.3.4 BiĨu hiƯn gen m· hoá kháng nguyên preM-E (gen preM-env) Pichia pastoris 163 3.3.5 Kiểm tra phản ứng kháng nguyên DxME tái tổ hợp với kháng thể kháng virus Dengue tự nhiên Western Blot Thiết kế cặp mồi xây dựng kế họach tách dòng gen mà hóa kháng 167 3.4 168 nguyên vỏ virus Dengue type I, II, III, IV 3.5 Chế tạo cộng hợp (Gold monoclonal antibodies) gắn kháng nguyên vào 173 giá thể (màng thấm Nitrocellulo membrane) 3.6 Nghiên cứu dung dịch đệm buffer tối u 179 dùng phản ứng 3.7 Hoàn thiện Bộ sinh phÈm 183 3.8 3.8.1 Thư nghiƯm Bé sinh phÈm phßng thÝ nghiƯm Th−êng qui sư dơng Bé sinh phÈm chÈn ®ãan nhanh bƯnh sèt Dengue/ 198 200 sèt xt huyết Dengue 3.8.2 So sánh kết thử nghiệm phßng thÝ nghiƯm 204 3.9 øng dơng Bé sinh phÈm thực địa 210 3.9.1 Kết kiêm tra phòng thí nghiệm Sốt xuất huyêt Arbovirus, Viện 210 Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng 3.9.2 Giá thành chất lợng Bộ sinh phẩm chẩn đóan nhanh bệnh sốt 211 Dengue/ sốt xuất huyết Dengue 3.9.3 Một số hình ảnh tiến hành thí nghiệm điểm nghiên cứu 213 B KÕt qu¶ s¶n xuÊt Bé sinh phÈm chÈn đoán nhanh bệnh viêm đờng hô hấp cấp (SARS) 3.1 Kháng nguyên tái tổ hợp protein N - SARS-CoV 217 3.2 Xác định thông số cho sinh phẩm MAC-ELISA chẩn 218 đoán nhiễm virus SARS-CoV 3.2.1 Xác định thời gian sử dụng tối u sinh phẩm 219 3.2.2 Xác định độ đặc hiệu Bộ sinh phẩm 220 3.2.3 Xác định độ nhạy sinh phẩm 220 3.3 Thành phần sinh phẩm 221 3.4 Ph¸t hiƯn kh¸ng thĨ IgM hut bƯnh nhân SARS nhân 221 viên y tế có tiếp xúc trực tiếp với bệnh nhân SARS Bàn luận Một phơng pháp chẩn đoán sớm phòng thí nghiệm có hiệu 226 Trong giai đoạn đầu dịch SARS, số phơng pháp ELISA đợc 234 giới thiƯu Bé sinh phÈm MAC- ELISA ph¸t hiƯn sím nhiễm virus SARS 236 Toàn bệnh nhân đợc xác định nhiễm virus SARS-CoV lâm 239 sàng đà đợc khẳng định lại phát đợc kháng thể IgM kháng đặc hiệu virus SARS CoV thông qua phơng pháp MAC-ELISA Sự xuất KT kháng đặc hiệu virus SARS-CoV số 239 ngời biểu lâm sàng Kết luận 241 Tài liệu tham khảo 244 Đặt vấn đề Trong vòng 15 năm gần đây, nhiều dịch bệnh nguy hiểm qui mô khu vực nh toàn cầu đà xảy lần gây ảnh hởng lớn đến kinh tế giới Tất bệnh dịch nguy hiểm (nh dịch hạnh ấn Độ vào năm 1994, dịch cúm gia cầm Hồng Kông 1997, dịch viêm nÃo Nipah Malaysia, dịch SARS hay hội chứng hô hấp cấp tính Trung Quốc từ năm 2002 đến 2003, cúm gia cầm vùng Đông Nam từ năm 2003 đến2007) có mầm bệnh từ động vật phát sinh Châu lây lan làm ảnh hởng đến kinh tế giới Với tiến trình toàn cầu hoá nay, thiết nghĩ tơng lai xảy nhiều dịch bệnh tầm mức tơng tự Hơn nữa, yếu tố xà hội, văn hoá nhân Châu có lẽ nơi tiếp tục xuất dịch bệnh bắt nguồn từ động vật Việc phát ổ dịch chơng trình chiến lợc dự phòng sớm châu giúp chủ động phát ngăn chặn kịp thời bệnh dịch đà biết đến nh bệnh dịch phát sinh Trong bệnh dịch gần đây, lên có dịch SD/ SXHD Viêm đờng hô hấp cấp SARS Sèt Dengue/ sèt xuÊt huyÕt Dengue (SD/ SXHD) lµ mét bƯnh nhiƠm trïng cÊp tÝnh virus Dengue g©y Bệnh vacxin thuốc điều trị Biểu lâm sàng SD/ SXHD đa dạng từ sốt cao đột ngột kéo dài 2-7 ngày kèm theo triệu chứng đau đầu, đau cơ, đau xơng, đau khớp, đau bụng buồn nôn, phát ban Sau ®ã cã thĨ cã biĨu hiƯn xt hut d−íi da, xuất huyết nội tạng (chảy máu cam, chảy máu lợi, nôn máu, máu ) Ngoài có thêm dấu hiệu khác nh gan to, sốc, huyết áp hạ dẫn tíi tư vong (Barnes W J S vµ Rosen L., 1974) Bệnh SD/ SXHD bệnh muỗi (Aedes aegypti, Aedes albopictus) [33] truyền bệnh thờng dễ dàng phát triển thành dịch Virus Dengue đợc Sabin phân lập Calcuta, ấn độ, New-Guinea Hawaii (Sabin A cs, 1952) Sau đợc xác định virus Dengue type 1-Hawaii virus Dengue type 2-New-Guinea Các type virus Dengue virus Dengue đợc Hammon W.M cs phân lập Philippines vào năm 1956 (Hammon W.M cs 1960) Tiếp nhiều chủng virus Dengue đà đợc phân lập từ nhiều vùng khác giới nhng đợc xác định thuộc type huyết nêu (Anonymous, 1986) Tới năm 1997 bệnh SD/ SXHD đà lan rộng phạm vi toàn giới Theo Gubler, D.J (1997) có tới 2,5 tỷ ngời sống khu vùc cã l−u hµnh SD/ SXHD vµ hµng năm có khoảng 100 triệu ngời mắc bệnh Để phòng chống bệnh cách hiệu việc chủ động giám sát huyết học, dịch tễ học, côn trùng học virus Dengue gây nên bệnh sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue cần thiết Các phơng pháp chủ yếu chẩn đoán huyết học virus Dengue bao gồm: Phản ứng Ngăn ngng kết hồng cầu (HI), phản ứng kết hợp bổ thể (CF), phản ứng trung hòa giảm đám hoại tử (PRNT), phản ứng miễn dịch hấp phụ gắn enzym phát kháng thể IgM (MAC-ELISA) phản ứng miễn dịch hấp phụ gắn enzym ph¸t hiƯn kh¸ng thĨ IgG (GAC-ELISA), kü tht RT- PCR Ngoài bệnh SD/ SXHD, Hội chứng viêm đờng hô hấp cấp tính nặng (SARS) bệnh dịch xuất phạm vi toàn cầu SARS đà xuất 23 Quốc gia: Trung Quốc, Hồng Kông, Singapore, Canada, Hoa Kỳ, Việt Nam, Malaysia, Thái Land Tính đến tháng 04 năm 2004 toàn giới đà có tổng số mắc/ tổng số chết là: 3169/ 144 ngời (Theo Tổ chức Y tế Thế giớiWHO) [39] Tác nhân gây bệnh SARS biến thể họ Corona (Coronaviridae); Một nhóm virus gây bệnh cho ngời động vật [41] Trên ngời, Corona thờng gây viêm đờng hô hấp trên, chủ yếu ngời trởng thành Ngoµi ... nhân đ? ??n muộn đ? ??c chẩn đoán sau nhập viện Tuy nhiên đ? ??nh nghĩa đ? ??c bổ sung thêm tiêu chuẩn đ? ?? phát sớm ngời bệnh tuần đ? ??u trớc đ? ??n bệnh viện, đ? ?? nhạy đ? ??t mức 25% Sở dĩ đ? ?? nhạy tiêu chuẩn đ? ??t thấp... Xác đ? ??nh thông số cho sinh phẩm MAC-ELISA chẩn 218 đoán nhiễm virus SARS-CoV 3.2.1 Xác đ? ??nh thời gian sư dơng tèi −u cđa bé sinh phÈm 219 3.2.2 Xác đ? ??nh đ? ?? đ? ??c hiệu Bộ sinh phẩm 220 3.2.3 Xác đ? ??nh... protein màng (M), protein vỏ (E) Đoạn gen đ? ? đ? ??c hiểu rõ đ? ? đ? ??c giải trình tự Đoạn chứa nhiều vùng đ? ??c hiệu loài đ? ??c hiệu type Ngời ta dựa vào vùng đ? ??c biệt đ? ?? phân biệt cấu trúc gen virus nhóm