- Các bệnh nhân SARS: Trong tổng số 63 bệnh nhân đ−ợc xác định lâm sàng là nhiễm virus SARS-CoV chúng tôi đã thu thập đ−ợc số mẫu nh− sau
Bảng 2.5. Các loại mẫu bệnh phẩm lấy từ bệnh nhân SARS Bệnh phẩm đ−ờng hô hấp Huyết thanh Dịch họng Dịch súc
họng
Dịch tỵ hÇu
LÇn 1 LÇn 2
Sè mÉu 14 15 5 236 43
Tổng 34 279
Bảng 2.6. Số mẫu bệnh phẩm thu đ−ợc theo nhóm đối t−ợng tiếp xúc Nhóm đối t−ợng tiếp xúc với bệnh nhân SARS
Nhân viên BV Việt Pháp
Nhân viên BV YHLSCBND
Nhân viên BV
§K Ninh B×nh
Cộng đồng TP Hà nội
Sè mÉu 61 102 53 212
Tổng 428 3.6. Xác định loại bệnh phẩm phù hợp cho chẩn đoán sớm nhiễm vi rut SARS-CoV:
Bảng 2.7. Tỉ lệ d−ơng tính với RT-PCR của các loại mẫu bệnh phẩm hô hấp
Loại mẫu Số l−ợng RT-PCR (+) Tỷ lệ(%)
Dịch họng 14 0 0
Dịch súc họng 15 9 60,0
Dịch tỵ hầu 5 2 40
Tổng số 34 11 32,35
3.6. Lựa chọn ph−ơng pháp chẩn đoán sớm nhiễm virus SARS:
Bảng 2.8. So sánh độ nhạy của phương pháp RT-LAMP và RT-PCR.
RT-LAMP
RT-PCR (CDC primer) Loại mẫu
Sè l−ợng
(+) (%) (+) (%)
Dịch họng 14 0 0 0 0
Dịch súc họng 15 10 67 9 60
Dịch tỵ hầu 5 3 60 2 40
HuyÕt thanh 284 15 5,2 7 2,5
Tổng số 318 28 8,8 18 5,7
3.7. Sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể khi nhiễm virus SARS-CoV
Thông qua hệ thống miễn dịch dịch thể, cơ thể ng−ời kháng lại virus SARS - CoV thông qua sự sản sinh các kháng thể IgA, IgM, IgG đặc hiệu kháng virus SARS.
Bảng 3.4: Tỉ lệ đáp ứng miễn dịch dịch thể với virus SARS-CoV HuyÕt thanh 1 HuyÕt thanh 2 Ph−ơng
pháp Số mẫu (+) Tỷ
lệ(%)
Sè mÉu (+) Tû lệ(%)
ELISA 63 20 31,7 43 24 55,8
PRNT 43 40 93,0
Bàn luận
1. Một ph−ơng pháp chẩn đoán sớm trong phòng thí nghiệm có hiệu quả là phương pháp phải đáp ứng được các yêu cầu : nhanh , nhạy và chính xác. Đối với các căn nguyên mới, nguy hiểm yêu cầu này càng cấp thiết, vì vậy việc lựa chọn một ph−ơng pháp chẩn đoán phù hợp với khả năng của phòng thí nghiệm
đến nh− : RT-PCR, phân lập virus , IFA... đều yêu cầu phải đ−ợc đảm bảo an toàn sinh học tuyệt đối nghiêm ngặt đối với căn nguyên nguy hiểm nh− virus SARS –CoV , và hiệu quả chỉ có thể nhận định khi bệnh phẩm thu thập sớm trong những ngày đầu phát bệnh. Việc nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm MAC-ELISA phát hiện sớm nhiễm virus SARS - ph−ơng pháp có thể phát hiện nhiễm virus sau 3 ngày nhiễm bệnh (kháng thể Ig M xuất hiện sớm và tồn tại trong vòng 3 tháng) và bù đắp cho hạn chế của các phương pháp phát hiện kháng nguyên khi mẫu bệnh nhân thu thập ở giai đoạn sau 7 ngày nhiễm.
2. Trong giai đoạn đầu của dịch SARS, một số ph−ơng pháp ELISA đ−ợc giới thiệu, tuy nhiên kháng nguyên sử dụng trong ph−ơng pháp này là kháng nguyên virus SARS –CoV bất hoạt thu hoạch từ dịch nuôi cấy tế bào. Để sản xuất kháng nguyên này, một l−ợng virus SARS lớn phải đ−ợc khuyếch đaị thông qua nuôi cấy trên tế bào, yêu cầu về đảm bảo an toàn sinh học phải đ−ợcthực hiện nghiêm ngặt (phòng thí nghiệm an toàn sinh học mức độ 3) đồng thời hiệu giá của KN sẽ bị giảm đáng kể thông qua quá trình bất hoạt, độ đặc hiệu của kháng nguyên cũng không cao do ảnh h−ởng của môi tr−ờng nuôi cấy...Vì vậy yêu cầu 1 kháng nguyên tái tổ hợp cấu tạo từ protein N là điều cần thiết.
3. Bộ sinh phẩm MAC- ELISA phát hiện sớm nhiễm virus SARS đ−ợc phát triển trên cơ sở thành công của tổng hợp kháng nguyên SARS-CoV tái tổ hợp.
Xác định nồng độ tối −u của các thành phần trong bộ sinh phẩm cũng nh− thời hạn sử dụng bộ sinh phẩm là 6 tháng.
Độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm đạt 100%.
H−ớng dẫn sử dụng Bộ sinh phẩm MAC-ELISA chẩn đoán sớm nhiễm virút SARS-CoV
Pha loãng mẫu huyết thanh (chứng d−ơng, chứng âm, mẫu bệnh phẩm) theo tỉ lệ 1/100 trong dung dịch pha loãng huyết thanh.
a/ Phủ bản ELSIA bằng 100 àl/ giếng kháng thể dê kháng IgM ng−ời (KPL- Mỹ) vói nồng độ 1/250 trong dung dịch đệm PBS pH 7,4 trên phiến nhựa 96 giếng đáy bằng. Để qua đêm ở 4 0C.
b/ Cho 100àl huyết thanh bệnh nhân đã pha loãng, huyết thanh chứng d−ơng và huyết thanh chứng âm vào mỗi giếng của phiến nhựa.
Phiến nhựa đ−ợc ủ tại 37 0C/ 60 phút.
c/ Cho 100àl kháng nguyên SARS tái tổ hợp có nồng độ 0,2àg vào mỗi giếng của phiến nhựa, ủ 37 0C/ 60 phút.
d/ Cho 100 àl kháng thể đa dòng kháng SARS-CoV (KT dê kháng SARS-CoV pha loãng 1:4000- ) vào mỗi giếng của phiến nhựa, ủ 37 0C/ 60’.
e/ Cho 100 àl cộng hợp gắn enzyme horseradish peroxidase (HRPO) (KT chuột khángdê gắn enzyme HRPO- Biosource- CA-Mỹ) pha loãng 1/4000. ủ 370C/ 60 phút.
g/ Cho 100 àl cơ chất đ−ợc pha loãng theo tỉ lệ 1/1: ABTS (2,2’-azino-di- (3-ethlybenzthiazoline-6-sulfonate- Kirkegaar & Perry Laboratory) và hydrogen peroxide vào mỗi giếng. ủ 37 0C/ 30 phút, tối.
f/ Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA tại bước sóng 410 nm và 490 nm.
Thành phần bộ sinh phẩm
Thành phần Đóng gói Số l−ợng
Dung dịch đệm phốt phát (PBS)x10 Sữa tách bơ
Huyết thanh chứng d−ơng Huyết thanh chứng âm
Kháng nguyên SARS-CoV tái tổ hợp (0,2 àg/
100àl)
Kháng thể đa dòng kháng SARS-CoV (1/4000) Cộng hợp HRPO (1/5000)
Cơ chất ABTS
Phiến nhựa 96 giếng gắn kháng thể kháng IgM ng−êi
Dung dịch Bét
Đông khô
Đông khô
Dung dịch Dung dich Dung dịch Dung dịch
50ml 5g 100àl 100àl 10ml 10ml 10ml 10ml 1 phiÕn
4. Toàn bộ bệnh nhân đ−ợc xác định nhiễm virus SARS-CoV trên lâm sàn
virus SARS –CoV thông qua ph−ơng pháp MAC-ELISA. Kết quả này cho thấy sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể người với virus SARS giống như
nhiễm các virus khác, IgM sẽ là lớp kháng thể dịch đầu tiên xuất hiện và sẽ dễ dàng phát hiện nếu sử dụng ph−ơng pháp phù hợp.
5. Sự xuất hiện của KT kháng đặc hiệu virus SARS-CoV trên một số người không có biểu hiện lâm sàng (2 người) đã cho thấy có khả năng nhiễm virus SARS- CoV thÓ Èn, v× vËy rÊt nguy hiÓm.
KÕt luËn
Để có đ−ợc bộ Kit chẩn đoán nhanh, phát hiện sớm, chính xác virus Dengue và virus SARS với giá thành hạ, dưới sự chỉ đạo của Bộ Khoa học và Công nghệ, sự hỗ trợ về tài chính của Bộ Tài chính, sự lãnh đạo của Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung −ơng và Viện Công nghệ Sinh học , với sự nỗ lực của tập thể cán bộ khoa học tham gia thực hiện đề tài KC.04-32, chúng tôi đã hoàn thành các chỉ tiêu
đăng ký ban đầu với Bộ Khoa học Công nghệ và Ban chủ nhiệm ch−ơng trình KC.04 và đã thu đ−ợc các kết quả sau:
1. Nuôi cấy virus Dengue trên tế bào muỗi Aedes albopictus dòng C6/36
2. Nghiên cứu qui trình công nghệ biểu hiện, tách chiết, tinh chế kháng nguyên Dengue tái tổ hợp các type.
Đã sản xuất đ−ợc kháng nguyên tái tổ hợp của virus Dengue các type D1, D2, D3, D4 dạng chimeric (lai ghép hai protein), một protein phản ứng đặc hiệu với kháng thể kháng virus Dengue, protein thứ hai phản ứng với một kháng thể chung làm tăng tính đặc hiệu và rất tiện ích trong sử dụng.
3. Tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên vỏ (kháng nguyên E) của virus Dengue các type I, II, III, IV.
Đã tạo dòng, xác định trình tự, đăng ký trong Ngân hàng gen quốc tế và lưu giữ
nh− một tài sản quí 4 trình tự gen mã hoá kháng nguyên màng (M) và vỏ (E) của virus Dengue các type D1, D2, D3, D4 từ các chủng virus Dengue phân lập
và chọn lọc tại Việt Nam để phục cho nghiên cứu chế tạo các Kit chẩn đoán cũng nh− nghiên cứu vắc xin phòng chống SD/SXHD trong t−ơng lai.
4. Thiết kế các cặp mồi và xây dựng kế hoạch tách dòng gen mã hóa kháng nguyên vỏ của virus Dengue các type I, II, III, IV.
5. Chế tạo cộng hợp. Gắn kháng nguyên vào giá thể
6. Chế tạo cộng hợp (Gold mônclonal antibodíe) gắn kháng nguyên vào giá thể (màng thấm Nitrocellulo membrane)
7. Nghiên cứu dung dịch đệm bufer tối −u, chạy phản ứng 8. Hoàn thiện Bộ sinh phẩm
- 100 Bộ sinh phẩm chẩn dóan nhanh bệnh sốt Dengue/ sốt xuất huyết Dengue - 100 Bô sinh phẩm chẩn đoán SARS đ−ợc phát triển trên cơ sở thành công của tổng hợp kháng nguyên SARS-CoV tái tổ hợp. Xác định nồng độ tối −u của các thành phần trong Bộ sinh phẩm cũng nh− thời hạn sử dụng Bộ sinh phẩm (6 tháng) đã hạn chế tối đa sự sai số của kết quả, tăng độ tin cậy và giúp việc sử dụng thuận tiện hơn trong điều kiện Việt nam. Cả hai Bộ sinh phẩm đều đạt:
- Độ đặc hiệu: 78% đến 85%.
- Độ nhạy: 80% đến 90%.
(Tiêu chuẩn CDC và Các n−ớc Đông Nam A)
9. Thử nghiệm Bộ sinh phẩm trong phòng thí nghiệm
Độ nhạy của Bộ sinh phẩm do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung −ơng sản xuất đạt 87,1% trong khi đó của hãng PANBIO là 95,7%
Độ đặc hiệu của Bộ sinh phẩm do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung −ơng sản xuất đạt 82,5% trong khi đó của hãng PANBIO là 92,9%
10. Sử dụng Bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh bệnh sốt Dengue/ sốt xuất huyết Dengue để chẩn đóan dịch SD/ SXHD cho 212 bệnh phẩm tại Nam Định, Thanh Hóa, Phú Yên và Kiên Giang và 148 mẫu huyết thanh bệnh nhân mắc SARS (Riêng Bô sinh phẩm ELISA chẩn đóan bệnh SARS không triển khai thực nghiêm tại địa phương vì không có dịch, hơn nữa do căn bệnh nguy hiểm nên đã
đ−ợc Bộ khoa học và công nghệ cho phép bỏ yêu cầu này (chỉ tiêu đề ra ban đầu
Bộ sinh phẩm đ−ợc sự ủng hộ nhiệt tình và sự quan tâm của các nhà Dịch tễ học tại các Trung tâm Y học D− phòng các tỉnh trên
11. 06 bài báo đã đ−ợc đăng (Chỉ tiêu 02 bài) trong Tạp chí Công nghệ Sinh học (Trung tâm KHTN và CN cao), Tạp chí Y học (Bộ Y tế), Báo cao Khoa học (Procedings), Tạp chí nghiên cứu Y học(Đại học Y hà Nội) và Virology (ELSEVIER).
12. Đào tạo (Chỉ tiêu 02 sinh viên) đ−ợc 02 Thạc sĩ, 01 cử nhân vi sinh
Đề nghị:
Tiếp tục hoàn thiện bộ Kit chẩn đoán nhanh bệnh sốt Dengue và sốt xuất huyết Dengue. Triển khai thử nghiệm rộng rãi trong các bệnh viện để dần dần sẽ thay thế các kit nhập ngoại có giá thành cao hơn.
Tài liệu tham khảo
1 Bach Thi,Q.N., Bui Hoang,A., Truong Uyen,N., Truong Thua,T., Le Thi,M.Q., Nguyen Thi,H.H. and Dinh Duy,K. (2003), Cloning and expression of the gene coding for preM and Eelope protein of Dengue virus type 2. EMBL GenBank Database, ACCESSION AJ574886
2 David W. Vaughn, Anada Nislak. 1998.
Evaluation of a rapid Immunochromatographic test for diagnosis of Dengue virus infection
J. of clinical Microbiology, Jan. 1998, p. 234-238
3 Guzman MG, Kouri G (2004), Dengue diagosis, advances and challenges. Int J Infect Dis, Vol 8, No 2, pp. 69-80.
4 Đỗ Quang Hà, Trần Văn Tiến. 1984.
Dịch Dengue xuất huyết tại Việt Nam từ 1975 - 1983.
Tạp chí Y học Việt Nam số 3. Tr. 28 - 40.
5 Kuhn RJ, Zhang W, Rossman MG, Pletnev SV, Corver J, Lenches E, Jones CT, Mukhopadhyay S, Chipman PR, Strauss EG. (2002), Structure of Dengue virus: Implications for flavivivirus organization, maturation, and fusion, Cell: Vol 108, No 5, pp. 717-25.
6 Lin CF, Lei HY, et al. Antibodies from Dengue patient sera cross-react with endothelial cells and induce damage. J Med Virol, No 69, pp. 82-90.
7 Mirosky. J, F. Vymola, Hoang Thuc Thuy, 1965:
Dengue fever in Vietnam.
J. of hygiene Epidemiology microbiology and immunology, 12: 356- 62.
8 Truong Uyen Ninh, 2000
Virological Surveillance of Dengue Haemorrhagic Fever in Vietnam, 1987- 1999; Dengue Bulletin, 24: 18- 23
9 Tr−ơng Uyên Ninh, Lê Quỳnh Mai va Tr−ơng Thừa Thắng, 2002 Trình tự sắp xếp nucleotide vùng vỏ (E protein) của virus Dengue type 2 tại miền Bắc Việt Nam,
Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, 964- 967 10 Tr−ơng Uyên Ninh, 2003
Các type Virus Dengue lưu hành từ 1987 đến 2002 tại Việt Nam Tạp chí Y học thực hành, 442 + 443: 102- 104
11 Tr−ơng Uyên Ninh, 2003
Kết quả sử dụng Bộ sinh phẩm MAC- ELISA để chẩn đoán bệnh Sốt Dengue/ Sốt xuất huyết Dengue tại Hà Nội, Nam Định, Thanh Hoá và Nghệ An, 2001- 2002. Tạp chí Y học thực hành, 467: 3- 6
12 Okabe. N. 1994:
Situation of Dengue fever and Dengue haemorrhagic fever and Japanese Encephalitis in Western Pacific region.
Trop. Med. 36(4): 122 - 130.
13 Suxiang Tong, Jairam R, Lingappa, Qi chen, Ashley C, laMonte, et al. Direct sequencing of SARS-coronavirus S and N genes from clinical