2.2. Nghiên cứu căn nguyên SARS
3.7.1. Thiết kế vector biểu hiện và tinh sạch Thioredoxin
Để có đ−ợc Thioredoxin tái tổ hợp có đuôi His-tag dùng cho việc tinh chế bằng cột sắc ký ái lực Nikel chelating Resin. Chúng tôi đã tiến hành biến đổi vector nh− sau:
Thiết kế một Adaptor sao cho một đầu có vị trí cắt của enzyme hạn chế BamHI,
đầu thứ hai có vị trí cắt của XhoI. Ngoài ra, Adaptor còn có thêm một số vị trí cắt của các enzyme hạn chế quan trọng nh− EcoRI, SacI, SalI, HindIII để tiện cho việc thao tác sau này.
Vector pET-TRX-Fus đ−ợc xử lý phối hợp với 2 enzyme BamHI và XhoI để loại bỏ vùng cắt gắn đa vị (MCS), vector đã xử lý đ−ợc gắn với Adaptor nhờ T4- ligase. Sau khi gắn, vector đ−ợc biến nạp vào E. coli chủng DH5α để chọn lọc các vector đạt yêu cầu. Các vector đạt yêu cầu phải là các vector đ−ợc thay bằng vùng cắt gắn đa vị mới sao cho có khung đọc mới để tạo ra đ−ợc Thioredoxin tái tổ hợp có gắn đuôi 6 Histidine (His-tag). Vector đ−ợc kiểm tra lại trình tự bằng cả hai mồi xuôi và ng−ợc sau đó biến nạp vào tế bào E. coli chủng BL21 DE3 Star để biểu hiện và thu nhận thioredoxin tái tổ hợp. Thioredoxin tái tổ hợp là một protein chứa 143 aa với khối l−ợng phân tử là khoảng 15,6 kDa (Hình 3.30).
Sau khi có đ−ợc Thioredoxin tái tổ hợp tinh sạch, chúng tôi đã dùng protein này gây miễn dịch cho thỏ để sản xuất kháng thể kháng Thioredoxin. Kháng thể kháng Thioredoxin sản xuất trên thỏ tr−ớc hết đ−ợc kiểm tra khả năng phản ứng với Thioredoxin, đồng thời cũng thử khả năng phản ứng với các kháng nguyên của virus Dengue cũng nh− của virus viêm gan B có lai ghép với Thioredoxin nh− các kháng nguyên DE3-TRX, HBcAg-TRX (Hình 3.35).
Hình 3.35. Western blot đánh giá kháng thể kháng Thioredoxin phản ứng với Thioredoxin tái tổ hợp, HBcAg-TRX tái tổ hợp và DE3-TRX tái tổ hợp.
M: Chỉ thị phân tử protein. 1: HBcAg-TRX tái tổ hợp. 2: Thioredoxin tái tổ hợp.
3, 4, 5, 6: D1E3-TRX, D2E3-TRX, D3E3-TRX, D4E3-TRX tái tổ hợp.
Hình 3.34. Thioredoxin tái tổ hợp biểu hiện trong E. coli. M:
Chỉ thị phân tử protein. 1: Mẫu không cảm ứng bằng IPTG. 2: Mẫu sau cảm ứng bằng IPTG 0,5mM. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9: Các phân đoạn sau khi tinh
sạch bằng cột sắc ký ái lực Nikel Resin.
Kết quả cho thấy, kháng thể kháng Thioredoxin do chúng tôi sản xuất phản ứng rất đặc hiệu không chỉ với với Thioredoxin, mà còn cả với các kháng nguyên của virus Dengue cũng nh− virus viêm gan B có lai ghép với Thioredoxin (DE3- TRX, HbcAg-TRX). Nh− vậy kháng thể này có thể đ−ợc dùng chung nh− một kháng thể 2 để chẩn đoán các virus khác nhau khi kháng nguyên của virus này
đ−ợc lai ghép với Thioredoxin. Ngoài ra, đây cũng là một kháng thể dùng để phát hiện các protein tái tổ hợp khi dùng hệ vector pPET-TRX-Fus để biểu hiện các protein này. Hiện tại, kháng thể này phải mua của các hãng với giá thành rất cao.
Các b−ớc tiến hành cụ thể nh− sau:
B−íc 1.
Chọn màng nền là một lọai giấy thấm đặc biệt, có khả năng hấp phụ dung dịch và chuyển dịch theo một hướng nhất định. Giấy thấm này vừa bảo đảm độ trung tính và vô trùng...Cấu trúc phân tử của giấy vừa bảo đảm tính hấp phụ cao lại có khả năng phân tán các phân tử dung dịch hóa chất theo chiều dọc.
Màng nền
Hình 3. 36. A. Màng nền
B−íc 2.
Màng hấp phụ miễn dịch kháng thể.
Màng này đ−ợc tẩm các kháng thể IgM, IgG và Đối chứng lên các khu vực có vị trí khác nhau đ−ợc gọi là các thang phát hiện:
- Thang phát hiện kháng thể sớm: IgM - Thang phát hiện kháng thể IgG - Thang đối chứng.
Màng hấp phụmiễn dịch kháng thể -Thang phát hiện IgM -Thang phát hiện IgG - Thangđối chứng
Hình 3. 36. B. Màng hấp phụ miễn dịch kháng thể
B−íc 3.
Trên màng hấp phụ miễn dịch kháng thể đ−ợc gắn các thụ thể để dễ phát hiện các kháng thể IgM, IgG của huyết thanh bệnh nhân
Thang phát hiện IgM
Thang phát hiện IgG Thangđối chứng
Hình 3. 36. C. Màng hấp phụ miễn dịch kháng thể đ−ợc gắn các thụ thể
B−íc 4.
Đệm gắn vàng. Bản giấy thấm lọai đặc biệt trong phân tử có thành phần vàng.
Bản này có kháng thể đơn dòng đặc hiệu nhóm Flavivirus gắn phân tử vàng và kháng nguyên Dengue 4 type virus tái tổ hợp
Đệm gắn vàng
• Kháng thể đơn dòngđặc hiệu nhóm Flavivirus gắn vàng.
• Kháng nguyên Dengue 1-4 tái tổhợp
Hình 3. 36. D. Màng hấp phụ đệm gắn vàng
B−íc 5.
Bản hấp phụ huyết thanh hay máu toàn phần
•Bản hấp phụmáu
Hình 3. 36. E. Bản hấp phụ bệnh phẩm
B−íc 6.
Bản hấp phụ trung tâm điều khiển hướng. Đậy là lọai giấy them đặc biệt, các phân tử giấy có độ hút dung dịch cao theo một hướng từ dưới lên trên theo chiều ngang.
Bản hấp phụTrung tâm
Hình 3. 36.G. Bản hấp phụ trung tâm
B−íc 7.
Tấm điều khiển là một bản giấy có một chiều điện cực để có thể them, hấp phụ dung dich pha loãng và nhanh chóng dịch chuyển các thanh phần nguyên liệu lên các trung tâm phản ứng. Tại đấy diễn ra các quá trình kết hợp và phân tích
để phát hiện kháng thể trong thành phần của bệnh phẩm định xét nghiệm.
Tấmđiều khiển
H×nh 3. 36.H. TÊm ®iÒu khiÓn
B−íc 8.
Đóng thành phẩm trong một hộp nhựa lọai đặc biệt có các cửa sổ chức năng
Bao trong hộp nhựa
Hình 3. 36.I. Bao bọc trong hộp nhựa
Thành phần Bộ sinh phẩm chẩn đóan nhanh bệnh sốt Dengue/ Sốt xuất huyết Dengue đã sẵn sàng trong hộp nhựa
Add 10àL of blood or serum Màng hấp phụkháng thể
miễn dịch
• Thang phát hiện IgM
• Thang phát hiện IgG
• Thangđối chứng
Bản hấp phụmáuce Wicking Material
•Bản hấp phụ trg tâm
Màng nền
Thang phát hiện IgM
Thang phát hiệnIgG Thangđối chứng
Add 2 drops of running buffer
Vỏnhựa bao bọc
Phân giải các thành phần huyết thanh
Tấmđiều khiển quả trình xét nghiệm
Phức hợp kháng thể Đệm gắn vàng
• Kháng thể đơn dòngđặc hiệu nhóm Flavivirus gắn vàng
• Kháng nguyên Dengue 1-4 tái tổhợp
Hình 3. 36.J. Thành phần hoàn chỉnh của một bản xét nghiệm trong Bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh bệnh sốt Dengue/ sốt xuất huyết Dengue
3.8. Thử nghiệm Bộ sinh phẩm trong phòng thí nghiệm
Hình ảnh thành phẩm các bản xét nghiệm nhanh kháng thể IgM và IgG kháng virus Dengue của Bộ sinh phẩm chẩn đóan nhanh bệnh Sốt Dengue/ Sốt xuất huyÕt Dengue
ảnh 3.11. Bản xét nghiệm nhanh kháng thể IgM và IgG kháng virus Dengue
ảnh 3.12. Bộ sinh phẩm chẩn đóan nhanh bệnh Sèt Dengue/ Sèt xuÊt huyÕt Dengue
3.8.1. Th−ờng qui sử dụng Bộ sinh phẩm chẩn đóan nhanh bệnh sốt Dengue/
sèt xuÊt huyÕt Dengue
3.8.1. Kỹ thuật sử dụng Bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh (Quick test) để phát hiện IgM và IgG kháng virus Dengue
Nguyên tắc.
Bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh phát hiện kháng thể IgM và IgG kháng virus Dengue ở máu toàn phần và huyết thanh ng−ời nghi mắc SD/ SXHD ở giai đoạn sơ nhiễm và tái nhiễm. Kết quả xét nghiệm chỉ chính xác khi bệnh nhân có biểu hiện triệu chứng lâm sang mắc bệnh SD/ SXHD tương đối rõ ràng. Kết quả của kỹ thuật này chỉ đ−ợc khẳng định sau khi phân lập hoặc làm tiếp các kỹ thuật phát hiện Axit Nucleic.
Giới thiệu Bộ sinh phẩm
Virus Dengue thuộc họ Flavivius, được phát hiện ở nhiều nước nhiệt đới và cận nhiệt đới. Bệnh lan truyền do hai loài muỗi chính: Aedes aegypti và Aedes albopictus. Việc nhiễm virus Dengue gây nên một loạt các biểu hiện từ không có triệu chứng đến sốt cao dẫn đến tử vong.
Bộ sinh phẩm Quick tets có thể phát hiện nhanh kháng thể IgM và IgG của bệnh nhân mắc SD/ SXHD trong 3- 5 ngày.
Cơ sở lý luận.
Các Immunoglobin đặc hiệu Dengue của nhóm IgM hoặc IgG sẽ gắn với kháng thể IgM hoặc IgG không phải của người được cố định trong hai thang ngang của màng thấm celluloza. Các phức hệ vàng dạng keo chứa các kháng nguyên Dengue type I, type II, type III và Dengue type IV sẽ phát hiện IgM và IgG của bệnh nhân để tạo nên các băng màu hồng thông qua các cửa số mà mắt thường có thể nhìn thấy đ−ợc.
Điều kiện bảo quản.
Bộ sinh phẩm phải đ−ợc bảo quản từ 2 0C đến 30 0C Bộ sinh phẩm chỉ dùng đúng hạn trên nhãn của sản phẩm.
Chống chỉ định
1. Các sản phẩm là máu phải xử lý ở mức độ an toàn sinh học cấp II.
2. Không sử dụng pipette bằng mồm hoặc cho tiếp xúc với da.
3. Các chất trong phản ứng phải thực hiện đúng và chính xác.
4. Bảo đảm thời gian và nhiệt độ trong khi tiến hành thí nghiệm 5. Bô sinh phẩm phải đ−ợc bảo quản đúng qui định
Bệnh phẩm (Máu) 1. Lấy từ tĩnh mạch - Tách huyết thanh
- Cất trong lạnh 2- 8 0C hoặc – 20 0C.
2. Máu lấy từ đầu ngón tay thì tiến hành làm xét nghiệm luôn.
Thành phần Bộ sinh phẩm
- Trong mỗi bộ sinh phẩm có 25 bản thí nghiệm (túi nhỏ) - Túi nhỏ: một tets thử và túi chống ẩm
- Tờ h−ớng dẫn sử dụng
- Một lọ Buffer (chứa 0,1% Proclin)
Qui trình thí nghiệm Chú ý khi dùng pipette.
- Giữ pipette nằm ngang
- Tất cả các chất phản ứng cân bằng với nhiệt độ phòng thí nghiệm (20-250C) tr−ớc khi bắt đầu thí nghiệm
- Đầu pipette không chạm vào mẫu kiểm tra - Nhả mẫu từ từ vào giếng
Các b−ớc tiến hành:
B−ớc 1. Cho 10 àl (bằng micropipet) bệnh phẩm (Huyết thanh hay máu toàn phần) vào giếng tròn
Cho bệnh phẩm thấm tràn bên trong giếng tròn
Bước 2. Giữ lọ dung dịch thẳng đứng cách mặt giếng hình chữ nhật độ 1,0 cm Thêm 02 giọt dung dịch vào vào giếng này.
Bước 3. Để yên trên bàn, sau 15 phút đọc kết quả
Đọc kết quả
C M G
Có kháng thể IgM
Vạch hồng xuất hiện ở vùng C (vạch đối chứng- Control) và vạch M (IgM), chứng tỏ bệnh nhân đã có kháng thể IgM kháng virus Dengue.
Đây là giai đọan thích hợp để phân lập virus Dengue và phát hiện Aixit Nucleic của nó.
C M G
Có kháng thể IgG and IgM
Vạch hồng xuất hiện ở vạch C (Control), M (IgM) và G (IgG): Bệnh nhân mắc bệnh ở dạng tái nhiễm vì
trong máu có cả kháng thể IgM và IgG. Đây là giai
đọan có thể phân lập virus Dengue và phát hiện Aixit Nucleic của nó.
C M G
Có kháng thể IgG
Vạch hồng xuất hiện ở vạch C (Control) và G (IgG):
Tái nhiễm; Có thể phát hiện Aixit Nucleic của virus
C M G
©m tÝnh
Vạch hồng chỉ xuất hiện ở vạch C (Control): Âm tính;
Không có kháng thể IgM và IgG. Hãy lấy lại máu sau 3-4 ngày để làm xét nghiệm lại. nếu nghi ngờ
Chó ý:
Không thấy vạch màu hồng xuất hiện: Phép thử sai, nên làm lại
Chó ý:
- Nếu bệnh nhân mắc ở giai đoạn Sơ nhiễm thì kháng thể IgM đ−ợc phát hiện trong 3- 5 ngày đầu khởi bệnh.
- Bệnh nhân mắc ở giai đọan tái nhiễm thì kháng thể IgG đ−ợc phát hiện trong 1- 2 ngày đầu khởi bệnh. Nh−ng th−ờng kèm với sự tăng lên của kháng thể sớm IgM.
- Một số bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng khá diển hình nh−ng kết quả thí nghiêm vẫn âm tính thì cần phải lấy máu và kiểm tra lại vì có thể kháng thể của bệnh nhân này xuất hiện muộn
- Virus Dengue nằm trong nhóm Flvivirus (bao gồm cả: St.louis, Viêm não Tây sông Nile, Viêm não Nhật Bản, virus bệnh vàng da...) Kết quả th−ờng có hiện t−ợng chéo...Bởi vậy kết quả chỉ đ−ợc khẳng định sau khi có phân lập hoặc các nghiên cứu về Axit nucleic
Nhận định kết quả:
3.8.2. So sánh kết quả thử nghiệm trong phòng thí nghiệm
Để đơn giản hoá việc chẩn đoán bệnh sốt Dengue/ sốt xuất huyết Dengue hơn nữa, nhiều test chẩn đoán huyết thanh nhiễm virus dengue trên thị tr−ờng hiện nay cũng đ−ợc sử dụng (từ PanBio Ltd.; Cortez Diagnostics, Calabasas, Calif.;
Glysby, Arcore, Italy; và AmeriTek, Scattle, Wash.). Các kỹ thuật này đ−a đến
một tiện ích là thời gian ủ khá ngắn (từ 5 đến 30 phút) và khả năng đ−ợc ứng dụng trong các thực nghiệm hay trong các phòng thí nghiệm mà không cần đòi hỏi phải đầy đủ các trang thiết bị hoặc điện. PanBio Dengue Duo Rapid Strip Test là test chẩn đoán đầu tiên trên thị tr−ờng có sử dụng các protein tái tổ hợp.
Bốn loại protein đ−ợc sử dụng (từ các virus dengue 1, 2, 3 và 4), mỗi loại đặc tr−ng cho 80% đầu N của các glycoprotein tái tổ hợp, theo thứ tự. Sự biểu hiện và tiết ra của các phần dưới đơn vị trong các tế bào S2 đã tạo ra các phân tử được giữ lại đ−ợc những đặc điểm giống với phân tử tự nhiên.
Bảng 3. 12. Kết quả so sánh Bộ sinh phẩm chẩn đóan nhanh của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung −ơng và của h∙ng PANBIO (CDC)
ThÝ nghiệm 1
Bộ sinh phẩm chẩn đóan nhanh-VSDTT¦
Tổng số (TN.1) ThÝ
nghiệm 2
Âm tính Sơ nhiễm Tái nhiễm
¢m tÝnh 81 2 10 93
Sơ nhiễm 2 25 6 33