- Các bệnh nhân SARS: Trong tổng số 63 bệnh nhân đ−ợc xác định lâm sàng là nhiễm virus SARS-CoV chúng tôi đã thu thập đ−ợc số mẫu nh− sau (Bảng 3):
Bảng 2.5. Các loại mẫu bệnh phẩm lấy từ bệnh nhân SARS Bệnh phẩm đ−ờng hô hấp Huyết thanh Dịch họng Dịch súc
họng
Dịch tỵ hÇu
LÇn 1 LÇn 2
Sè mÉu 14 15 5 236 43
Tổng 34 279
Với tổng số 34 mẫu thu thập tại đ−ờng hô hấp trên cùng với 279 mẫu huyết thanh thu thập trong giai đoạn cấp tính ( 236 mẫu) và hồi phục (43 mẫu) các phương pháp nghiên cứu được áp dụng một cách toàn diện nhằm mục đích phát hiện căn nguyên, tìm hiểu cấu trúc phân tử của virus SARS-CoV( RT-PCR; RT- LAMP). Thông qua kết quả nghiên cứu đó nhằm lựa chọn phương pháp tối ưu trong chẩn đoán sớm nhiễm virus SARS trong phòng thí nghiệm đồng thời đánh giá được khả năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể người với căn nguyên virus mới (ELISA; PRNT). Cũng thông qua bệnh phẩm này, virus SARS đã đ−ợc khuyếch
đại (phân lập, nuôi cấy trên tế bào cảm nhiễm) và nhận diện hình thái (hiền vi
địên tử -EM).
- Đối t−ợng ng−ời liên quan dịch tễ với bệnh nhân SARS ( Bảng 2.6):
Bảng 2.6. Số mẫu bệnh phẩm thu đ−ợc theo nhóm đối t−ợng tiếp xúc Nhóm đối t−ợng tiếp xúc với bệnh nhân SARS
Nhân viên BV Việt Pháp
Nhân viên BV YHLSCBND
Nhân viên BV
§K Ninh B×nh
Cộng đồng TP Hà nội
Sè mÉu 61 102 53 212
Tổng 428 Sử dụng phương pháp ELISA phát hiện kháng thể IgA, IgM, IgG kháng đặc hiệu virus SARS-CoV trong huyết thanh của những ng−ời có tiền sử tiếp xúc trực tiếp với bệnh nhân SARS trong nghiên cứu này cho phép chúng ta tìm hiểu đ−ợc sự lây truyền của virus SARS-CoV trong cộng đồng.
3.2. Xác định loại bệnh phẩm phù hợp cho chẩn đoán sớm nhiễm vi rut SARS-CoV:
Số mẫu 3 loại bệnh phẩm cho kết quả d−ơng tính với RT-PCR đ−ợc trình bày ở Bảng 2.7:
Bảng 2.7. Tỉ lệ d−ơng tính với RT-PCR của các loại mẫu bệnh phẩm hô hấp
Loại mẫu Số l−ợng RT-PCR (+) Tỷ lệ(%)
Dịch họng 14 0 0
Dịch súc họng 15 9 60,0
Dịch tỵ hầu 5 2 40
Tổng số 34 11 32,35
Kết quả trên cho thấy dịch súc họng là bệnh phẩm tối −u để phát hiện sớm sự hiện diện của virus SARS-CoV, tuy nhiên quy trình thu thập loại mẫu bệnh phẩm nguy hiểm này rất phức tạp và nguy cơ lây nhiễm cao, vì vậy hiện tại mẫu dịch tỵ hầu đ−ợc xác định là mẫu bệnh phẩm phù hợp cho chẩn đoán sớm và các nghiên cứu về virus SARS-CoV trong phòng thí nghiệm.
3.3. Lựa chọn ph−ơng pháp chẩn đoán sớm nhiễm virus SARS:
Phương pháp chẩn đoán sớm nhiễm virus hiện nay được đề cập nhiều đó là ph−ơng pháp di truyền phân tử (RT-PCR) nhằm phát hiện sự hiện diện vật liệu di truyền của virus (RNA hoặc DNA) trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng. Tuy nhiên, độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp này phụ thuộc nhiều vào cấu trúc mồi (primer) một phần quan trọng của phản ứng khuyếch đại chuỗi (PCR).
Nghiên cứu này của chúng tôi cho thấy cặp mồi đ−ợc các nhà khoa học CDC thiết kế có độ nhạy cao hơn hẳn (11 dương tín ) so với cặp mồi của viện BNI -
Đức (4 dương tính) trên cùng một số bệnh phẩm (34). Cặp mồi của CDC đã
đ−ợc áp dụng trong th−ờng quy chẩn đoán sớm nhiễm virus SARS tại Viện VSDTTU hiện tại. Cũng trong nghiên cứu này của chúng tôi, 1 ph−ơng pháp mới (Phương pháp khuyếch đại vòng giới hạn đẳng nhiệt-RT-LAMP) cũng được phát triển, ph−ơng pháp này cho thấy có thể áp dụng trên nhiều loại mẫu bệnh phẩm khác nhau ( bệnh phẩm đường hô hấp, huyết thanh) , có độ nhạy cao hơn so vơi RT-PCR thông th−ờng, tuy nhiên ph−ơng pháp này còn đang hoàn thiện vì vậy RT-PCR vẫn được xác định là phương pháp có hiệu quả trong chẩn đoán sớm nhiễm virus SARS-CoV hiện nay.
Bảng 2.8. So sánh độ nhạy của phương pháp RT-LAMP và RT-PCR.
RT-LAMP
RT-PCR (CDC primer) Loại mẫu
Sè l−ợng
(+) (%) (+) (%)
Dịch họng 14 0 0 0 0
Dịch súc họng 15 10 67 9 60
Dịch tỵ hầu 5 3 60 2 40
HuyÕt thanh 284 15 5,2 7 2,5
Tổng số 318 28 8,8 18 5,7
3.4. Sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể khi nhiễm virus SARS-CoV
Thông qua hệ thống miễn dịch dịch thể, cơ thể ng−ời kháng lại virus SARS - CoV thông qua sự sản sinh các kháng thể IgA, IgM, IgG đặc hiệu kháng virus SARS. Do đây là virus hoàn toàn mới vì vậy việc nhận diện kháng nguyên, bộc lộ và trình bày các yếu tố kháng nguyên và tạo trí nhớ miễn dịch của virus SARS-CoV tại hệ thống miễn dịch của cơ thể d−ờng nh− chậm hơn so với các virus thông thường khác (31,7% số người được xác định có kháng thể kháng SARS trong huyết thanh 1), tuy nhiên theo đúng quy luật miễn dịch, các kháng thể kháng đặc hiệu của virus SARS- CoV đã hiện diện trong hầu hết bệnh nhân đ−ợc xác định nhiễm virus SARS-CoV trên lâm sàng(
93%). Kết quả nghiên cứu này cũng cho thấy sự khó khăn của các ph−ơng pháp huyết thanh học chẩn đoán nhiễm virus SASR-CoV hiện nay, do vậy yêu cầu nghiên cứu và hoàn thiện 1 loại kháng nguyên SARS có độ an toàn cao là hết sức cần thiết trong giai đoạn tiếp sau.
Bảng 3.4: Tỉ lệ đáp ứng miễn dịch dịch thể với virus SARS-CoV HuyÕt thanh 1 HuyÕt thanh 2 Ph−ơng
pháp Số mẫu (+) Tỷ
lệ(%)
Sè mÉu (+) Tû lệ(%) ELISA 63 20 31,7 43 24 55,8
PRNT 43 40 93,0
Bàn luận
1. Một ph−ơng pháp chẩn đoán sớm trong phòng thí nghiệm có hiệu quả là phương pháp phải đáp ứng được các yêu cầu : nhanh , nhạy và chính xác. Đối với các căn nguyên mới, nguy hiểm yêu cầu này càng cấp thiết, vì vậy việc lựa chọn một ph−ơng pháp chẩn đoán phù hợp với khả năng của phòng thí nghiệm là hết sức quan trọng. Các ph−ơng pháp phát hiện kháng nguyên có thể kể
đến nh− : RT-PCR, phân lập virus , IFA... đều yêu cầu phải đ−ợc đảm bảo an toàn sinh học tuyệt đối nghiêm ngặt đối với căn nguyên nguy hiểm nh− virus SARS –CoV , và hiệu quả chỉ có thể nhận định khi bệnh phẩm thu thập sớm trong những ngày đầu phát bệnh. Việc nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm MAC-ELISA phát hiện sớm nhiễm virus SARS - ph−ơng pháp có thể phát hiện nhiễm virus sau 3 ngày nhiễm bệnh (kháng thể Ig M xuất hiện sớm và tồn tại trong vòng 3 tháng) và bù đắp cho hạn chế của các phương pháp phát hiện kháng nguyên khi mẫu bệnh nhân thu thập ở giai đoạn muộn (sau 7 ngày nhiÔm).
Về các biện pháp giám sát và phòng chống dịch đã áp dụng:
Với việc nhanh chóng xác định dịch, thoong báo cho TCYTTG và thành lập Ban đặc nhiệm phòng chống dịch và sau đó là Ban chỉ đạo Quốc gia phòng chống dịch viêm đường hoo hấp cấp, Việt Nam đã chứng tỏ được khả năng và quyết tâm trong c”ng tác phòng chống dịch bảo vệ sức khoẻ nhân dân.
So với nhiều nước khác, thời gian từ khi dịch bắt đầu cho tới khi đạt được
đỉnh điểm và đi đến ổn định tại nước ta là tương đối ngắn, điều đó cho thấy r”ng những biện pháp đ−ợc áp dụng tại Việt Nam là hợp lý và mang lại hiệu quả cao.
Từ Trung −ơng đến cơ sở, các c”ng tác giám sát phát hiện bệnh, tổ chức cách ly và điều trị, giáo dục truyền thoong, kiểm dịch các sân bay cửa khẩu…đã
thể hiện một hệ thống các biện pháp đồng bộ và toàn diện trong c”ng tác phòng chống dịch của Bộ Y Tế và Nhà n−ớc ta. Tuy nhiên trong quá trình phòng chống dịch cũng còn bộc lộ một số khó khăn, tồn tại nh− những thiếu thốn về mặt nhân lực, trang thiết bị…
Việt Nam là nơi đầu tiên bệnh dịch SARS đ−ợc phát hiện và thông báo trên toàn thế giới nh−ng cũng là n−ớc đầu tiên khống chế dịch thành c”ng trong khi nhiều n−ớc trong khu vực và trên thế giới (trong thời gian này và nhiều tháng sau đó) vẫn đang phải chịu những hậu quả nặng nề của bệnh dịch tối nguy hiểm này; vì vậy có thể nhìn nhận đó là một thành công hết sức có ý nghĩa và trong sự thành công này đã có phần giúp đỡ to lớn từ TCYTTG cũng nh− cộng đồng quốc tế . Và một trong những người có đóng góp lớn nhất giúp cho Việt Nam sớm ngăn chặn đ−ợc dịch SARS chính là bác sỹ Carlo Urbani, ng−ời đầu tiên phát hiện ra ca bệnh lạ tại BVVP, sau đó cũng bị nhiễm bệnh và chết vì
SARS).
Tính cho đến thời điểm cuối tháng 5-2003, dịch bệnh Viêm đường hoo hấp cấp trên thế giới đã có chiều hướng giảm dần, nhưng ở nước ta vẫn còn những nguy cơ bị xâm nhập bệnh SARS từ bên ngoài. Vì vậy các biện pháp giám sát phòng ngừa sự quay trở lại của dịch SARS (theo dự báo của TCYTTG) vẫn cần phải tiếp tục duy trì với hiệu quả cao để bảo vệ thành quả đã đạt đ−ợc.
Bàn luận về ph−ơng pháp chẩn đoán SARS.
Ph−ơng pháp chẩn đoán sớm trong phòng thí nghiệm có hiệu quả là ph−ơng pháp phải đáp ứng đ−ợc các yêu cầu : nhanh , nhạy và chính xác. Đối với các căn nguyên mới, nguy hiểm yêu cầu này càng cấp thiết, vì vậy việc lựa chọn một ph−ơng pháp chẩn đoán phù hợp với khả năng của phòng thí nghiệm là hết sức
quan trọng. Kết quả thu đ−ợc từ ph−ơng pháp RT-PCR thực hiện tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã đáp ứng được yêu cầu trên. Phương pháp RT-PCR là phương pháp phổ biến hiện nay, có khả năng xác định được sự hiện diện của virus thoong qua vật liệu di truyền
(ARN hoặc ADN) của mình, phương pháp này được xác định là phương pháp an toàn do mẫu sử dụng hoàn toàn không có khả năng lây nhiễm . Hiệu quả của ph−ơng pháp này phụ thuộc chủ yếu vào cấu trúc của primer dùng trong phản ứng. Vào giai đoạn đầu của dịch SARS do yêu cầu cấp thiết của việc chẩn đoán nhanh, phòng thí nghiệm thuộc mạng l−ới giám sát bệnh SARS của TCYTTG (WHO) tại Viện Bernhard-Nocht ( BNI), Hamburg, Cộng hoà liên bang Đức đã
thiết kế 1 cặp mồi (BNI) dùng cho ph−ơng pháp RT-PCR, tuy nhiên do thoong tin về virus SARS-CoV lúc đó còn rất hạn chế, cùng với điều kiện thử nghiệm khó khăn vì vậy cặp mồi BNI có độ nhạy kém, tỷ lệ dương tính chỉ đạt 12% so với 32% khi sử dụng primer theo thiết kế của CDC phân tích trên cùng 1 số bệnh phẩm. Đồng thời do cấu tạo là primer biến tính nên đòi hỏi các chu kỳ nhiệt trong phản ứng PCR phức tạp hơn vì vậy khả năng sử dụng cặp mồi này là khoong rộng rãi và thời gian thực hiện phản ứng sẽ kéo dài hơn so với PCR thông thường. Cùng với việc xác định hình dạng của virus SARS-CoV, các nhà khoa học tại Trung tâm Kiểm soát và phòng chống bệnh dịch(CDC-Mỹ) đã dựa vào vật liệu di truyền của 2 virus thuộc họ Corona gây bệnh cho người đã
từng biết là HCV-229E và HCV-OC43 tại vùng gen P để thiết kế 1 cặp mồi thích ứng cho ph−ơng pháp RT-PCR chẩn đoán SARS. Với tỷ lệ phát hiện 60%
d−ơng tính trên bệnh phẩm súc họng và 40% d−ơng tính trên bệnh phẩm tỵ hầu cho thấy cặp primer này phù hợp với yêu cầu chẩn đoán sớm nhiễm virus SARS- CoV,và đây là cặp mồi thích hợp mà WHO khuyến cáo sử dụng cho các phòng thí nghiệm trên thế giới hiện nay. Tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung −ơng cặp primer này đã đ−ợc áp dụng và bổ sung một số điều kiện nhiệt phù hợp để hoàn thiện ph−ơng pháp RT- PCR. Trong giai đoạn dịch SARS bùng nổ tại Ninh Bình (tháng 4/2003), RT-PCR đã đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán sớm
tr−ờng hợp nhiễm SARS-CoV đầu tiên ( BN.K) giúp cho các biện pháp điều trị và phòng chống dịch hoạt động có kết quả tốt.
Một phương pháp khác cũng cho những kết quả đáng tin cậy trong chẩn đoán sớm nhiễm virus SARS-CoV đó là RT-LAMP. Các primer sử dụng trong ph−ơng pháp này đ−ợc thiết kế dựa trên trình tự nucleotide của chủng virus NC- 004718 đ−ợc công bố trên Genbank và đ−ợc sắp xếp lại sau khi so sánh với trình tự nucleotid của virus Corona khác phân lập từ ng−ời, bò, gia cầm...Những primer này thiết kế tại các vùng gen bảo tồn vì vậy khả năng bắt cặp với khuôn ADN rất tốt đảm bảo cho sự thành công của phương pháp. Thêm vào đó chỉ trên 1 đoạn ADN cần khuyếch đại, không giống với phương pháp RT- PCR thông th−ờng, các primer sử dụng bao gồm 1 cặp primer, 1 primer đi thẳng (Forward), 1 primer đi lùi (backward) khuyếch đại từ ngoài vào (outer primer), tương tự vậy 1 căp primer khác khuyếch đại từ trong (inner primer) và 1 cặp primer khác (Loop primer) kết nối 2 cặp primer trên tạo vòng kích thích hoạt động khuyếch
đại của primer liên tục khoong cần đến tác động của sự thay đổi về nhiệt độ.
Việc 3 cặp primer cùng phối hơp trong 1 phản ứng khuyếch đại ADN đã làm cho độ nhạy của phản ứng tăng lên rất nhiều, mặt khác duy trì một nhiệt độ duy nhất (60 0C) trong toàn bộ phản ứng đã rút ngắn thời gian thực hiện phản ứng - 60 phút so với 120 hoặc 180 phút. khi thực hiện RT- PCR thông th−ờng. Độ nhanh và nhạy của RT LAMP đã tăng tỷ lệ dương tính từ 60% (RT-PCR) lên 67%(bảng 3) khi thực hiện trên cùng một số bệnh phẩm. Tuy nhiên đây là phương pháp mới nên việc đánh giá hiệu quả của phương pháp cần phải thử nghiệm trên một số mẫu lớn hơn, và việc hoàn thiện ph−ơng pháp này là hết sức cÇn thiÕt.
Tỷ lệ xác định sớm nhiễm virus SARS -CoV bằng các phương pháp di truyền phân tử (RT- PCR và RT- LAMP) đạt từ 60-67% (bảng 3) tuy đáp ứng đ−ợc nhu cầu chẩn đoán sớm nh−ng việc khẳng định lại chẩn đoán lâm sàng vẫn cần phải bổ sung bằng một số ph−ơng pháp huyết thanh học khác. Ph−ơng pháp ELISA
thiết kế cho nghiên cứu này có khả năng phát hiện kháng thể IgA,IgM và IgG kháng virus SARS-CoV trong cùng 1 phản ứng, với mục đích làm tăng độ nhạy của phản ứng và có thể áp dụng cho các mẫu huyết thanh thu thập trong các giai đoạn cấp, hồi phục và cả cho nghiên cứu hồi cứu. Tuy nhiên virus SARS - CoV là virus nguy hiểm vì vậy kháng nguyên an toàn là yêu cầu hết sức cần thiết. Trong giai đoạn đầu của dịch, KN sử dụng cho ph−ơng pháp ELISA là virus SARS bất hoạt, do vậy tính kháng nguyên của virus bị mất nhiều làm cho
độ nhạy của phản ứng bị giảm, mặt khác việc phát hiện trong 1 phản ứng cả 3 loại KT ( IgA, IgM, IgG) cũng ảnh hưởng ít nhiều đến độ đặc hiệu của phương pháp. Kết quả so sánh với phương pháp PRNT đã nói lên điều đó (Bảng 4). Tuy
độ nhạy và độ đặc hiệu đạt tới 93% nhưng phương pháp PRNT không được áp dụng rộng rãi,do phải sử dụng virus sống nên phương pháp này đòi hỏi phải thực hiện trong phòng thí nghiệm an toàn cao (P3),và tuân thủ nghiêm ngặt các quy
định về an toàn sinh học khi tiến hành thử nghiệm.Vì vậy yêu cầu cần thiết có một kháng nguyên tái tổ hợp phục vụ cho các ph−ơng pháp huyết thanh học chẩn đoán nhiễm virus SARS-CoV là hết sức cần thiết.
Phuơng thức thâm nhập và nhân lên của virus SARS-CoV tế bào cảm nhiễm đã
biểu hiện rõ ràng khi tiến hành theo dỡi th−ờng xuyên ảnh h−ởng của virus trên tế bào Vero –E6 gây nhiễm (Cyto patho effect-CPE). Sự ảnh h−ởng này xuất hiện sau khi gây nhiễm 2-4 ngày và lan rộng nhanh trong vòng 24- 48 giờ sau
đó. Quan sát dưới kính hiển vi điện tử cho thấy hình ảnh của rất nhiều các hạt dạng virus với các hình dáng khác nhau (hình vòng, hình trứng, hình cầu, l−ỡi liềm, hình trục quay, hình trục quay, hình gậy….) đặc điểm nổi bật của tế bào Vero còn lại sau 80 giờ gây nhiễm là sự xuất hiện một cách phổ biến các hạt virus hình liềm, hình trứng và hình trụ. Đặc điểm này cũng phù hợp với nghiên cứu của các phòng thí nghiệm khác trên thế giới. Phát triển nghiên cứu dựa trên ph−ơng pháp miễn dịch gắn vàng cho thấy những hạt virion trong các hốc nội bào (endosomal vacuoles) cũng có đáp ứng miễn dịch đánh dấu với một kháng thể đặc hiệu kháng trực tiếp màng liên hợp lysosome (Lysosome asociated