2.4. Các phương pháp phân lập và xác định type virus
2.4.2. Ph−ơng pháp phân lập virus trên tế bào muỗi
2.4.2.1. Ph−ơng pháp nuôi cấy và giữ giống tế bào muỗi Aedes albopictus dòng C6/ 36
a. Nuôi tế bào muỗi Aedes albopictus dòng C6/36 Thông th−ờng cứ 6 -7 ngày phải chuyển tế bào một lần.
- Chọn chai tế bào đã nuôi cấy 5 - 7 ngày, tế bào đẹp và mọc kín 1 lớp trên thành
đáy chai nuôi.
- Đổ hết môi tr−ờng cũ, rửa tế bào bằng PBS pH 7,95.
- Để tách tế bào, cho vào 3ml trypsin tráng đều trên lớp tế bào rồi đổ đi, sau 30 giây tế bào bắt đầu bong ra.
- Dùng pipet cho vào 5 ml môi tr−ờng phát triển và sục mạnh xuống thanh chai nhiều lần để tế bào tách ra hoàn toàn.
- Tìm số l−ợng tế bào trong 1 ml bằng buồng đếm, pha loãng tế bào bằng môi trường phát triển để có 4ì105 tế bào trong 1 ml.
- Chuyển hỗn dịch tế bào vào chai ( 5 ml ) hoặc ống nghiệm ( 2 ml )
- Nuôi tế bào ở tủ ấm 28 0C, sau 3 ngày có thể dùng để gây nhiễm virus hoặc cấy bệnh phẩm.
b. Nuôi tế bào BHK - 21
- Chọn và tách tế bào giống nh− tế bào Aedes albopictus dòng C6/36.
- Đếm số l−ợng tế bào trong 1 ml, pha loãng tế bào bằng môi tr−òng phát triển có 3ì 105 tế bào trong 1 ml.
Chuyển 5 ml hỗn dịch tế bào đã pha vào chai nuôi cấy.
- Để ở tủ ấm 37 0C, sau 3 - 4 ngày tế bào mọc kín một lớp trên thành chai và có thể dùng cho phản ứng trung hoà giảm mảng hoại tử (Plaque).
2.4.2.2. Ph−ơng pháp giữ giống tế bào trong nitrogen lỏng - Rửa và tách tế bào nh− th−ờng lệ.
- Đếm tế bào trong 1 ml.
- Ly tâm 1000 vòng/ phút/ 10 phút.
- Tính và pha số lượng môi trường phát triển có 7,5% DMSO đủ để pha loãng cặn tế bào thành hỗn dịch chứa 4ì106 tế bào trong 1 ml.
- Đóng 1 ml hỗn dịch tế bào vào từng ống nhựa có nắp kín.
- Để các ống nhựa chứa tế bào ở - 20 0C/ 1 giờ, tiếp theo - 40 0C/ giờ và - 70 0C qua đêm. Sau đó chuyển vào bình nitrogen lỏng.
2.4.2.3. Ph−ơng pháp nhân giống tế bào bảo quản trong nitrogen lỏng
- Lấy ống tế bào ra khỏi bình nitrogen lỏng, tan băng nhanh bằng cách ngâm trong bÓ n−íc Êm 37 0C.
- Sát trùng ống bên ngoài bằng cồn 70 0C.
- Chuyển hỗn dịch tế bào sang 1 ống ly tâm đã có sẵn 6 ml môi trường phát triÓn.
- Ly tâm 1000 vòng/ phút/ 10phút.
- Đổ hết môi tr−ờng cũ, giữ lại cặn tế bào.
- Hoà tan cặn bằng 6 ml môi tr−ờng phát triển và chuyển vào chai nuôi tế bào.
- Nuôi ở nhiệt độ thích hợp với từng loại tế bào.
- Sau 18 giờ, thay môi tr−ờng mới.
2.4.2.4. Ph−ơng pháp phân lập virus Dengue
- Lấy bệnh phẩm sớm ngay từ mấy ngày đầu của bệnh.
- Giao nhanh bệnh phẩm đúng qui cách cho phòng thí nghiệm virus Dengue.
- Chọn ph−ơng pháp nhạy cảm với virus Dengue.
a. Phân lập virus Dengue trên muỗi.
4 loại muỗi đã đ−ợc dùng trong trong phân lập virus Dengue là: A. aegypti, A.
albopictus, T. amboinensis, T. Splenden. Virus Dengue nhân lên ở hầu hết các tổ chức muỗi. Hiện nay th−ờng dùng muỗi Toxorhynchites vì nó to nên dễ tiêm, dễ sông sau khi tiêm và cho số l−ợng virus nhiều hơn.
+ Bệnh phẩm có thể là huyết thanh, huyết t−ơng, bạch cầu, máu toàn phần.
Tr−ớc khi tiêm, pha loãng 1/5 trong dung dịch pha loãng virus.
+ Chuẩn bị muỗi, mỗi bệnh phẩm tiêm cho 5 muỗi Toxorhynchites, hút muỗi vào ống nghiệm và bất động bằng cách dìm trong đá 5 - 10 phút.
+ Kỹ thuật tiêm: hút hỗn dịch bệnh phẩm vào kim, kim có đ−ờng kính 0,4 mm thì mỗi đoạn dài 1 mm chúa khoảng 0,13 àl hỗn dịch.
Để muỗi đã bất động dưới kính lúp, tiêm vào buồng hơi phía bên lồng ngực của mỗi Toxo, sau khi đã đâm kim vào muỗi đẩy bơm tiêm để hỗn dịch chảy qua 1 - 2 mm, nh− thế sẽ bơm vào muỗi 0,13 - 0,26 àl hỗn dịch bệnh phẩm. Sau đó rút nhanh và nhẹ mũi kim để bảo đảm thể tích đ−a vào.
+ Cho muỗi ăn chế độ 5% đường. Nuôi 14 ngày ở nhiệt độ 30 0C và 75% - 80%
độ ẩm. Hàng ngày đặt thêm đường miếng vào lồng muỗi. Để tạo độ ẩm 75% - 80% có thể dùng dung dịch bão hoà muối amon sunfat. Ngày thứ 14 những muỗi chết bỏ đi, những muỗi sống sẽ giết trong đông lạnh, bảo quản ở - 70 0C có thể dùng để chẩn đoán huỳnh quang trong 9 tháng.
+ Làm tiêu bản để chẩn đoán bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang:
* Xếp đầu muỗi theo thứ tự có kèm theo biên bản ghi rõ số muỗi va đặc diểm của từng lô muỗi.
* dùng lam kính có 12 giếng tròn (mỗi hàng 6 giếng), mỗi giếng đ−ợc đánh số theo số đầu muỗi bằng bút chì đen.
* Đặt muỗi trên miếng giấy thấm, cắt lấy đầu bằng dao hoặc l−ỡi dao cạo đã lau sạch bằng cồn sau mỗi lần cắt đầu muỗi, đặt mỗi đầu muỗi vào 1 giếng của lam kính đã đánh dấu.
* Dùng nĩa kẹp đầu muỗi di quanh giếng để các tế bào đ−ợc phân bố đều trong mỗi giếng.
* Để khô trong không khí, cố định axeton lạnh 20 phút, bảo quản - 20 0C.
+ Gây nhiễm trên tế bào C6/36 để giữ chủng và xác định type.
Những lỗ muỗi đã phát hiện dương tính bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp đ−ợc nghiền thành hỗn dịch: 1 muỗi + 0,3 ml dung dịch pha loãng virus, ly tâm 1500 vòng/ phút/ 10 phút. Sau đó tiếp tục các bước như phân lập trên tế bào C6/36.
b. Ph−ơng pháp phân lập virus Dengue trên tế bào muỗi Aedes. albopictus dòng C6/36.
Gây nhiễm virus vào tế bào.
Chọn những chai tế bào tốt (mọc kín trên mặt đáy của chai), thay môi trường phát triển bằng môi tr−ờng duy trì, mỗi chai 1 ml.
Đánh dấu trên chai tế bào t−ơng đ−ơng số thứ tự của mẫu, chọn một chai làm chứng tế bào.
Gây nhiễm 0,1 ml bệnh phẩm (máu toàn phần hoặc huyết thanh), láng đều trên bề mặt tế bào, ủ 28 0C/ 60’
Thêm 6 ml môi tr−ờng duy trì vào mỗi chai tế bào, ủ 28 0C trong 7- 14 ngày.
Định type virus bằng ph−ơng pháp miễn dịch huỳnh quang.
Theo th−ờng quy của Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật (CDC- Fort Collins, Colorado, US).
2.4.3. Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (Direct ImmunoFluorescent Antibody Assay – DFA).
Sau 7 ngày ủ tại 28 oC, tế bào đ−ợc tách ra khỏi đáy chai nuôi cấy bằng que cạo tế bào (craper) hoặc vỗ nhẹ vào thành chai, tách 1 ml môi tr−ờng có chứa tế bào vào ống ly tâm.
Đánh dấu số thứ tự của mẫu trên lam kính 12 giếng theo hình “chữ chi “ dành 1 giếng cho chứng tế bào. Nhỏ 20 àl hỗn dịch tế bào của mỗi mẫu vào các giếng t−ơng ứng.
Cho 20 àl kháng thể đa dòng (pha loãng theo hiệu giá đã chuẩn độ) vào tất cả
các giếng có tế bào, ủ 37 0C/ 30 phút trong hộp giữ ẩm. Ngâm trong PBS/ 10 phút, tráng qua nước cất, để khô tự nhiên.
Cho 20 àl cộng hợp gắn Fluorescen (pha loãng theo hiệu giá đã chuẩn độ) vào tất cả các giếng trên, ủ 37 0C/ 30 phút trong hộp giữ ẩm. Ngâm trong PBS/ 10 phút, tráng qua nước cất, để khô tự nhiên.
Nhận định kết quả:
Tế bào chứng âm hoàn toàn không phát sáng.
Mẫu d−ơng tính: xuất hiện sự phát sáng của huỳnh xung quanh màng tế bào.
2.4.4. Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (Indirect InmunoFluorescent Antibody Assay– IFA).
Tất cả mẫu dương tính sẽ tiếp tục định type bằng kỹ thuật miến dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA).
Đánh dấu số thứ tự của mẫu trên lam kính 12 giếng (Mỗi bệnh phẩm đ−ợc làm trên một lam kính).
2 giếng hàng đầu nhỏ bệnh phâm dương tính đã biết.
2 giếng hàng thứ hai cho tế bào âm tính (tế bào không có virus Dengue) Nhỏ 20 àl hỗn dịch tế bào của mỗi mẫu vào 8 giếng cuối lam kính.
Nhỏ mẫu huyết thanh bệnh nhân
Cho 20 àl cộng hợp gắn Fluorescen (pha loãng theo hiệu giá đã chuẩn độ) vào tất cả các giếng trên.
Nhận định kết quả:
Chứng d−ơng: Phát sáng xanh lá mạ bao quanh tế bào Tế bào chứng âm hoàn toàn không phát sáng.
Mẫu d−ơng tính: Phát sáng của huỳnh xung quang màng tế bào giống chứng d−ơng.
Các mẫu âm tính được tiếp tục nuôi tại 28 0C/ 7 ngày tiếp, sau đó lặp lại phương pháp trên.
Sau khi lặp lại, loại bỏ toàn bộ các mẫu âm tính lần thứ 2.
2.4.5. Kỹ thuật Trung hoà giảm đám hoại tử ( Plaque Reduction Neutralization Test - PRNT ) a/ Chuẩn bị môi tr−ờng:
- Thạch 2% trong n−ớc cất (hấp 120 0C/ 30 phút) duy trì dạng dung dịch trong bÓ n−íc Êm 56 0C.
- Môi tr−ờng dinh d−ỡng MEM có 20% FCS, duy trì trong bể ở 44 0C.
- MgCl2 100 mM bảo quản tại 4 0C.
- Nuôi tế bào BHK-21 trên phiến nhựa 6 giếng đáy bằng tại 37 0C và 5% CO2.
b/ Chuẩn độ virus
- Chủng virus dengue type 1 (Hawaii), dengue type 2 (Newguinea C), dengue type 3 (H-87) và dengue type 4 (H-241) đ−ợc pha loãng trong môi tr−ờng MEM có 5% FCS (từ 10 -1 đến 10-6).
- Chọn phiến nhựa tế bào BHK-21 mọc đẹp (thành 1 lớp) loại bỏ môi trường cũ.
Cấy 0,1 ml virus pha loãng ở các nồng độ khác nhau vào các giếng khác nhau trên phiến nhựa. U 37 0C/ 60 phút .
- Tính l−ợng thạch phủ cần thiết cho một phiến theo công thức MEM (10% FCS) : 10 ml
Thạch 2% : 10 ml MgCl2 100 mM : 106 àl NaHCO3 7, 5% : 0,6 ml Duy trì thạch phủ tại 44 0C.
- Phủ 3ml thạch phủ vào mỗi giếng. Để đông thạch, lật úp phiến nhựa, ủ tại 37 0C và 5% CO2.
- Sau 7 ngày (dengue 1, dengue 2) và 10 ngày (dengue 3 và dengue 4), nhuộm phiến nhựa bằng dung dịch nhuộm Violet/formalin 10 %.
- Đọc và tính kết quả: Hiệu giá tạo đám hoại tử của virus là độ pha loãng lớn nhất mà virus có khả năng tạo 1 đám hoại tử. (Ví dụ: tại độ pha loãng 10-4 virút dengue type 2 tạo đ−ợc 2 đám hoại tử , vậy hiệu giá của virút dengue type 2 sẽ là 10-4 + lg 2=10-4,2). Đó chính là 1 đơn vị đám hoại tử (Plaque Forming Unit - PFU).
c/ Tiến hành phản ứng trung hoà giảm đám hoại tử.
- Huyết thanh bệnh nhân pha loãng theo tỷ lệ 1/ 5 trong MEM có 5% FCS. Bất hoạt 30 phút ở 56 0C.
- Pha loãng virút theo hiệu giá đã chuẩn độ để đạt nồng độ 200 PFU/ 1ml trong MEM cã 5% FCS.
- Huyết thanh bệnh nhân tiếp tục đ−ợc pha loãng bậc hai (từ 1/ 5-1/ 160) bằng MEM có 5% FCS trên phiến nhựa 96 giếng đáy tròn, dành 1 hàng chỉ có MEM làm chứng virút.
- Thêm 100 àl virus đã pha loãng (200 PFU/ ml) vào tất cả các giếng (kể cả
hàng chứng virút) nh− vậy ta sẽ có nồng độ pha loãng cuối cùng với huyết thanh là 1/ 10-1/ 320 và virus là 100 PFU. ủ ở 4 0C/qua đêm.
- Chọn phiến nhựa tế bào BHK-21 mọc đẹp (thành 1 lớp), loại bỏ môi trường cũ, cấy 100 àl hỗn dịch trên ở các độ pha loãng vào các giếng khác nhau trên phiến nhựa (mỗi huyết thanh, chứng virút/ 1 phiến nhựa) .
- Phủ 3 ml thạch phủ (nh− chuẩn độ virút) vào mỗi giếng. Để đông thạch, lật úp phiến nhựa, ủ tại 37 0C và 5% CO2.
- Sau 7 ngày nhuộm phiến nhựa bằng dung dịch nhuộm Violet/formalin 10%.
- Nhận định kết quả:
+ Giếng dương tính là các giếng có số đám hoại tử đếm được ít hơn 10% tổng số PFU của virút sử dùng cho phản ứng (nếu virút chuẩn độ lại đạt 100 PFU thì
giếng (+) là giếng có số đám hoại tử đếm đ−ợc < 10).
+ Hiệu giá KT trung hoà của huyết thanh là độ pha loãng huyết thanh cuối cùng có số đám hoại tử đếm đ−ợc giảm 90% so với nồng độ virus sử dụng.
2.4.6. Ph−ơng pháp tổng hợp dây chuyền chuỗi nhờ polymerase (RT-PCR - Polymerase Chain Reaction)- Karl Mullis và CS - 1985 1. Nguyên tắc.
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những
đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR được hình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase. Để khuếch đại một trình tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó để đủ tạo ra các mồi bổ xung chuyên biệt; Các mồi này gồm một mồi xuôi (sens primer hay F) và một mồi ng−ợc (antisera primer hay R) theo chiều phiên mã của gen.
2. Các b−ớc cơ bản.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba b−íc:
- B−ớc 1: Giai đoạn biến tính (Denaturation)
Trong dung dịch cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA đ−ợc biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử (thường 94-95 0C) trong 30giây - 1 phút - Bước 2: Giai đoạn lai (Hybridization) Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hon mồi Tm) cho phép các mồi bắt cặp với khuôn (khoảng 40-70 0C tuỳ thuộc Tm của mồi sử dụng) kéo dài trong 30 giây - 1 phút.
- Bước 3: Giai đoạn tổng hợp (hay kéo dài) Elongation. Nhiệt độ tăng.
72 0C giúp cho DNA polymerase sử dụng (Polymera se này chịu nhiệt hoạt
động tổng hợp tốt nhất). Thời gian tuỳ thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuyếch đại, thường từ 30 giây đến nhiều phút.
Một chu kỳ gồm ba b−ớc trên sẽ đ−ợc lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần sẽ tăng gấp đôi lượng mẫu lần trước (khuyếch đại theo cấp số nhân). Theo tính toán sau 30 chu kỳ sự khuyếch đại sẽ là 106 so với l−ợng mẫu ban đầu.
3. Th−ờng quy tổng hợp dây chuyền chuỗi nhờ polymerase Ph−ơng pháp này đ−ợc tiến hành qua 3 giai đoạn
a/ Tách chiết ARN.
Sử dụng bộ sinh phẩm của hãng Qiagen (Mỹ) dựa vào sự gắn chọn lọc các phân tử nhỏ (ARN) vào màng silicagen phối hợp với kỹ thuật quay tròn vi cấp (microspin). Đây là phương pháp lý tưởng nhất để tách chiết ARN hiện nay.
Toàn bộ các bước tiến hành ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Qui trình được tiến hành qua các b−ớc sau:
- Trộn đều 140 àl mẫu thử (dịch nổi nuôi tế bào, huyết thanh,huyết tương...) với 560 àl đệm AVL. Để 10 phút. (1)
- Thêm 560 àl ethanol (100%) vào hỗn dịch trên, trộn đều.(2)
- Đặt cột QIA amp spin vào ống ly tâm sạch. Tách 630 àl hỗn dịch vào cột QIA amp spin.
- Ly tâm 3000 vòng /phút/ phút. Loại bỏ ống ly tâm.(3) - Lặp lại (3).
- Đặt cột QIA amp spin vào ống ly tâm sạch, rửa cột QIA amp spin bằng 500 àl
đệm AV, ly tâm tại 3000 vòng/ phút/ phút. Loại bỏ ống ly tâm.(4) - Lặp lại (4) nh−ng ly tâm ở tốc độ cao 14000 vòng/ phút/ 3 phút.
- Đặt lại cột QIA amp spin vào ống ly tâm sạch (có nắp bảo quản tốt). Cho 50 àl nước cất tinh khiết (đã làm nóng tại 80 0C) vào cột, ủ tại 80 0C/ 5 phút, ly tâm 8000 vòng / phút. Loại bỏ cột QIA amp spin, giữ lại nước trong ống ly tâm (đó chính là ARN của virus).
- Bảo quản tại -20 0C hoặc -70 0C trong 1 năm.
b/ PCR giai đoạn 1(RT-PCR).
(Tổng hợp cADN đặc hiệu cho nhóm Flavivirus từ ARN) Hình 7. Phản ứng Polymerasa sao chép ng−ợc
- Tính l−ợng hỗn dịch sinh phẩm cần dụng cho 1 mẫu theo công thức sau : + N−ớc cất tinh khiết 28 àl
+ 5x đệm PCR 10 àl + d NTP 1 àl + DTT 100 mM 2,5 àl + RNAza Inhibitor 0,5 àl + Primer D1 (100 àM) 1 àl + Primer D2 (100 àM) 1 àl + Enzym phiên mã ng−ợc
(Reverse Transcriptase) 1 àl + Enzym chịu nhiệt
(Taq- Polymeraza) 1 àl
- Trộn 45 àl hỗn hợp PCR với 5 àl ARN đã tách chiết.
- Cài đặt các chu kỳ nhiệt vào máy PCR 45 0C 70 phót
94 0C 03 phót 94 0C 30 gi©y 50 0C 1 phót 68 0C 8 phót Giữ tại 4 0C.
- Điện di trên thạch: Sử dụng thạch 1,3 % có thêm ethidium bromid, điện di trong 30 phút.
Trong giai đoạn RT-PCR này phản ứng PCR đã diễn ra qua 2 quá trình: phiên mã ng−ợc ARN thành cADN đặc hiệu của Flavivirus với sự tham gia của primer D1 kết hợp ARN của virus (đóng vai trò primer bổ trợ) kết hợp với enzym phiên mã ng−ợc (RT); Tiếp là thực hiện khuyếch đại chuỗi ADN với sự tham gia của primer D1 và D2 (primer đặc hiêụ của Flavivirus). Kết thúc giai đoạn này các virus trong nhóm Flavivirus được xác định là các băng dương tính có độ dài 511 cặp bazơ (bp). Tất cả các mẫu d−ơng tính sẽ đ−ợc tiến hành PCR ở giai đoạn 2.
c/ PCR giai đoạn 2 (Nested PCR) Xác định type của virút Dengue.
+ Tính l−ợng hỗn hợp sinh phẩm PCR cần cho 1 mẫu theo công thức sau:
- N−ớc tinh khiết 68 àl - 5x đệm PCR 20 àl - d NTP 2 àl - Primer D1 1 àl - Primer TS 1 1 àl - Primer TS 2 1 àl - Primer TS 3 1 àl - Primer TS 4 1 àl - Taq -polymeraza 0,5 àl
+ Trộn đều 5 àl cADN tổng hợp đ−ợc tại PCR giai đoạn 1 (đã pha loãng 1/
100 trong n−ớc tinh khiết) với 50 àl hỗn hợp PCR.
+ Cài đặt chu kỳ nhiệt vào máy PCR 20 chu kú 94 0C/ 1phót 50 0C/ 2 phót 72 0C/ 3 phót 1 chu kú 72 0C/ 7 phót Giữ tại 4 0C
Phản ứng PCR giai đoạn 2 với sự tham gia của các primer đặc hiệu của 4 type virút dengue (đóng vai trò bổ trợ) kết hợp với primer D1, sau 20 chu kỳ nhiệt sản phẩm ADN đặc hiệu cho 4 type virút dengue sẽ đ−ợc nhìn thấy sau khi điện di đó là các băng dương tính với độ dài khác nhau ở các type khác nhau
ADN đặc hiệu của virút dengue type 1 có độ dài 482 bp ADN đặc hiệu của virút dengue type 2 có độ dài 119 bp ADN đặc hiệu của virút dengue type 3 có độ dài 290 bp ADN đặc hiệu của virút dengue type 4 có độ dài 392 bp
B. Bộ sinh phẩm chẩn đóan bệnh Viêm đường hô hấp cấp SARS