Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết khảo sát sự tạo mô sẹo xốp từ lát cắt thân cây non Xạ đen có khả năng làm nguyên liệu nuôi cấy huyền phù tế bào để thu nhận hợp chất có hoạt tính sinh học. Các yếu tố khảo sát bao gồm chất điều hoà sinh trưởng thực vật, môi trường khoáng và độ pH.
Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(2):458-467 Bài nghiên cứu Open Access Full Text Article Ảnh hưởng chất điều hoà sinh trưởng thực vật, mơi trường khống pH lên hình thành mơ sẹo từ lát cắt thân non Xạ đen (Ehretia asperula Zoll et Mor.) Phạm Thị Mỹ Trâm1,2,* , Ngô Kế Sương3 , Lê Thị Thuỷ Tiên2 TÓM TẮT Use your smartphone to scan this QR code and download this article Xạ đen (Ehretia asperula Zoll et Mor.) thuộc họ Boraginaceae, dược liệu quý, dân tộc Mường tỉnh Hồ Bình gọi ``ung thư'' Xạ đen chứng minh có hoạt tính ức chế phát triển khối u ác tính, chống oxy hố, tăng cường sức đề kháng thể người Nghiên cứu tập trung vào việc khảo sát tạo mô sẹo xốp từ lát cắt thân non Xạ đen có khả làm nguyên liệu nuôi cấy huyền phù tế bào để thu nhận hợp chất có hoạt tính sinh học Các yếu tố khảo sát bao gồm chất điều hoà sinh trưởng thực vật, mơi trường khống độ pH Kết cho thấy tất nghiệm thức khảo sát kích thích hình thành mơ sẹo từ lát cắt (0,5–1,0 mm) thân non Xạ đen Trong đó, mẫu cấy mơi trường B5 có pH 5,8 bổ sung 2,4-D 0,4 mg/L BA 0,1 mg/L hình thành mơ sẹo thứ cấp có dạng xốp với tỉ lệ cao (85%) mô sẹo tăng sinh tốt với khối lượng tươi sau tuần nuôi cấy đạt 0,054 g Nhằm đánh giá diện hợp chất tự nhiên mô sẹo so sánh với ngồi tự nhiên, dịch chiết ethanol từ lá, cành khơ mô sẹo tươi xạ đen sử dụng để phân tích định tính Kết cho thấy có diện nhóm hợp chất mơ sẹo acid hữu cơ, phenolic, tannin, alkaloid flavonoid giống thân năm tuổi trồng vườn thực nghiệm Từ khoá: Ehretia asperula Zoll et Mor., lát cắt thân non, mô sẹo xốp, Xạ đen, hợp chất hữu Trường Đại học Thủ Dầu Một, Bình Dương MỞ ĐẦU Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG-HCM, Việt Nam Viện Sinh học Nhiệt đới Tp HCM Liên hệ Phạm Thị Mỹ Trâm, Trường Đại học Thủ Dầu Một, Bình Dương Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG-HCM, Việt Nam Email: tramptm@tdmu.edu.vn Lịch sử • Ngày nhận: 05-6-2019 • Ngày chấp nhận: 16-01-2020 • Ngày đăng: 06-6-2020 DOI :10.32508/stdjns.v4i2.763 Bản quyền © ĐHQG Tp.HCM Đây báo công bố mở phát hành theo điều khoản the Creative Commons Attribution 4.0 International license E hretia asperula Zoll et Mor thuộc họ Boraginaceae, gọi Xạ đen, thường mọc hoang vùng núi cao Do có giá trị dược liệu cao nên gần Xạ đen bắt đầu trồng tỉnh Sơn La, Hòa Bình, Hà Nam Quảng Bình Theo y học cổ truyền, Xạ đen có vị thơm mát, vị thuốc đa cơng dụng Cây có tác dụng hữu hiệu điều trị mụn nhọt, tiêu ung thũng, tiêu viêm, giải độc, giảm tiết dịch, tăng cường sức đề kháng thể Năm 1997, Kuo Kuo cho biết dịch chiết cồn từ vỏ Xạ đen ức chế phân chia tế bào ung thư gan (Hepatocellular carcinoma, hep G2), ung thư mũi (nasopharynx carcinoma), ung thư ruột kết (colon carcinoma) kháng virus HIV H-9 Năm 1999, Lê Thế Trung cộng phát loại hợp chất Xạ đen flavonoid, quinore, saponin triterpenoid pyrocatechin có tác dụng hạn chế phát triển u ác tính Nhiều hợp chất từ Xạ đen ức chế tăng trưởng vi khuẩn gây bệnh, điển hình Staphylococcus aureus Với giá trị y học nên nay, Xạ đen sử dụng nhiều việc hỗ trợ điều trị ung thư việc thu nhận hợp chất có hoạt tính sinh học từ Xạ đen cần thiết Nhằm bảo tồn giống quý tạo nguồn nguyên liệu cho ngành dược, Xạ đen nghiên cứu nhân giống phương pháp in vitro 6–9 , phương pháp gieo hạt giâm hom 10 Việc tạo sinh khối thực vật in vitro có chứa chất có hoạt tính sinh học cao so với trồng tự nhiên chứng minh Panax ginseng, Lithospermum erythrorizon, Coleus blumei… 11 Vì vậy, nghiên cứu thực nhằm khảo sát ảnh hưởng auxin, cytokinin, mơi trường khống pH mơi trường lên tạo mô sẹo từ lát cắt thân non Xạ đen, bước đầu tạo nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào môi trường lỏng để thu sinh khối có chứa hoạt chất có giá trị y học VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Khúc cắt thân non Xạ đen (Ehretia asperula Zoll et Mor.) năm tuổi trồng vườn, cung cấp Vườn ươm Bắc Bộ, thôn Đồng Hội, xã Đại Đình, huyện Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc Phương pháp Trích dẫn báo này: Trâm P T M, Sương N K, Tiên L T T Ảnh hưởng chất điều hồ sinh trưởng thực vật, mơi trường khống pH lên hình thành mơ sẹo từ lát cắt thân non Xạ đen (Ehretia asperula Zoll et Mor.) Sci Tech Dev J - Nat Sci.; 4(2):458-467 458 Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(2):458-467 Chuẩn bị mẫu cấy Khúc cắt thân non tuần tuổi, có màu xanh nhạt, từ Xạ đen khử trùng phút ethanol 700 10 phút dung dịch javel 20% Rửa mẫu nước cất vô trùng (5 lần) Mẫu cấy lát cắt ngang thân non vị trí từ số đến số tính từ ngọn, khơng mang chồi bên Độ dày lát cắt 0,5–1,0 mm Tạo mô sẹo Xạ đen Môi trường tạo sẹo môi trường MS 12 B5 13 , bổ sung inositol 100 mg/L, sucrose 30 g/L, agar 7,5 g/L chất điều hoà sinh trưởng thực vật (chất ĐHSTTV) cần khảo sát Q trình tạo mơ sẹo tiến hành tối, nhiệt độ 25 ± 20 C, độ ẩm 70 ± 2% Khảo sát ảnh hưởng naphthalene acetic acid (NAA) lên hình thành mô sẹo Lát cắt thân non Xạ đen đặt môi trường MS bổ sung NAA với nồng độ 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 3,5 mg/L độ chất điều hoà sinh trưởng tốt thí nghiệm trước Xác định diện số nhóm hợp chất tự nhiên Chuẩn bị dịch chiết từ bột khơ (các từ vị trí số tính từ đến hết cành), cành khô mô sẹo tươi Xạ đen tuần tuổi, loại g, ngâm chiết lần, lần với 30 mL dung môi ethanol 96º Lọc, thu dịch đến thể tích cịn 50 mL Dịch chiết đặc dùng để định tính acid hữu cơ, phenolic tannin, alkaloid flavonoid Phương pháp định tính trình bày Bảng C hỉ tiêu theo dõi hình thành mô sẹo Kết ghi nhận tuần liên tục tuần Chỉ tiêu theo dõi gồm ngày xuất mơ sẹo, hình thái mơ sẹo, số lượng mẫu cấy tạo mô sẹo xốp khối lượng tươi mô sẹo Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo xốp X (%) xác định theo công thức sau: X(%) = Khảo sát ảnh hưởng kinetin (KIN) kết hợp với NAA lên hình thành mơ sẹo Lát cắt thân non Xạ đen đặt môi trường MS bổ sung KIN 0,1 mg/L kết hợp với NAA với nồng độ 3,5; 4,0; 4,5 5,0 mg/L Khảo sát ảnh hưởng 2,4dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) kết hợp với NAA benzyl adenine (BA) lên hình thành mô sẹo Lát cắt thân non Xạ đen đặt môi trường MS bổ sung chất ĐHSTTV theo Bảng Bảng 1: Ảnh hưởng chất điều hồ sinh trưởng lên tạo mơ sẹo 8,14,15 2,4-D (mg/L) NAA (mg/L) BA (mg/L) 0,4 0,1 1,0 0 1,5 1,0 Chất ĐHSTTV Nghiệm thức Khảo sát ảnh hưởng mơi trường khống với pH khác lên hình thành mơ sẹo Lát cắt thân non Xạ đen nuôi cấy môi trường MS B5 điều kiện pH 5,3 5,8 với nồng 459 a × 100 A Trong đó: X: Tỉ lệ mẫu cấy tạo mơ sẹo xốp (%) a: Số mẫu hình thành mơ sẹo xốp A: Số mẫu cấy ban đầu Xử lí số liệu Mỗi thí nghiệm lặp lại lần Kết xử lí thống kê phần mềm Statgraphics Centurion XV, khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,05 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng NAA lên hình thành mơ sẹo từ lát cắt thân non Xạ đen Auxin cytokinin có vai trị quan trọng cảm ứng phân chia tế bào vô trật tự để hình thành khối sẹo 18 Khối sẹo cứng hay xốp phụ thuộc nhiều vào loại chất điều hoà sinh trưởng, riêng lẻ hay kết hợp hàm lượng sử dụng Nguyên liệu thích hợp cho nuôi cấy huyền phù tế bào khối mô sẹo gồm tế bào rời nhau, dễ phân tán tăng sinh môi trường lỏng 19 Trong thí nghiệm này, lát cắt thân non Xạ đen nuôi cấy môi trường MS bổ sung NAA với nồng độ thay đổi nhằm cảm ứng hình thành mơ sẹo Sau tuần ni cấy, kết ghi nhận Bảng Ở ngày thứ tư q trình ni cấy, xuất cụm nhỏ tế bào vị trí vết thương (trừ nghiệm thức đối chứng) ghi nhận Sau tuần, mơ Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(2):458-467 Bảng 2: Phản ứng định tính nhóm hợp chất tự nhiên 16,17 Nhóm chất Phản ứng hóa học Quan sát phản ứng xảy Acid hữu mL dịch chiết + tinh thể Na2 CO3 Dung dịch sủi bọt khí Phenolic tannin mL dịch chiết + mL H2 O + vài giọt FeCl3 (1%) Dung dịch chuyển sang màu xanh đậm Alkaloid mL dịch chiết + 3-4 giọt thuốc thử Bouchardat Dung dịch kết tủa màu đỏ nâu Flavonoid mL dịch chiết + mL Pb(CH3 COO)2 (10%) Dung dịch chuyển sang màu vàng Bảng 3: Ảnh hưởng NAA lên hình thành mô sẹo từlát cắt thân non Xạ đen sau tuần nuôi cấy NAA (mg/L) Tỉ lệ mẫu cấy tạo sẹo (%) Tỉ lệ mẫu cấy tạo sẹo thứ cấp xốp (%) Khối lượng tươi mơ sẹo (g) Hình thái mô sẹo Đối chứng 0 - 1,0 60 0,010 ± 0,003a Cứng, trắng 1,5 75 0,019 ± 0,007ab Cứng, trắng đục 0,013 ± 0,005a Cứng, trắng đục 0,008bc Cứng, trắng đục 2,0 60 2,5 100 0,027 ± 3,0 100 41 0,026 ± 0,005bc Phần lớn mô sẹo cứng, trắng trong, vài chỗ mẫu cấy xuất mô sẹo xốp 3,5 100 41 0,035 ± 0,006d Phần lớn mô sẹo cứng, trắng trong, vài chỗ mẫu cấy xuất mô sẹo xốp *Các chữ khác cột thể sựkhác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 sẹo sơ cấp màu trắng đục trắng xuất nhiều sau tuần có hình thành mơ sẹo thứ cấp Ở mơi trường ni cấy có NAA nồng độ từ 1,0 đến 2,5 mg/L, mô sẹo thứ cấp cứng, màu trắng đục trắng Trên mơi trường có NAA 3,0 mg/L hay NAA 3,5 mg/L, mơ sẹo thứ cấp có dạng mềm xốp với tỷ lệ 41% (Hình 1) Như vậy, hình thái tỉ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo mô sẹo xốp khác tuỳ thuộc vào nồng độ NAA sử dụng Nhìn chung, mơ sẹo có dạng cứng hình thành mơi trường có NAA Một vài nghiên cứu trước ghi nhận hình thành mơ sẹo cứng mơi trường có NAA trường hợp sâm nam Cyclea peltata Lam mẫu thân nuôi cấy môi trường MS bổ sung NAA với nồng độ 0,1; 0,5; 1; mg/L (Bhagya Chandrashekar , 2013) 20 Ảnh hưởng KIN kết hợp với NAA lên hình thành mơ sẹo từ lát cắt thân non Xạ đen Sự tạo mô sẹo chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố, bao gồm độ tuổi, tình trạng sinh lý mẫu cấy loại nồng độ auxin cytokinin sử dụng Sự cân auxin cytokinin cần thiết cho hình thành phát triển mô sẹo Auxin sử dụng để cảm ứng tạo sẹo nhiều loài thực vật Cytokinin kích thích phân chia nhân tế bào chất có phối hợp với auxin Vì thế, kết hợp auxin với cytokinin điều kiện cần thiết để cảm ứng tạo sẹo đa số lồi thực vật thuộc nhóm song tử diệp 21 Trong số nghiên cứu, KIN ưu tiên sử dụng để cảm ứng mơ sẹo xốp Vì vậy, thí nghiệm KIN 0,1 mg/L sử dụng phối hợp với NAA có nồng độ từ 3,5 đến mg/L để kích thích tạo mơ sẹo xốp từ lát cắt thân non Xạ đen Ở ngày thứ q trình ni cấy, mơ sẹo bắt đầu hình thành bề mặt lát cắt số mẫu cấy sau tuần, mô sẹo phát triển khắp bề mặt mẫu cấy nghiệm thức khảo sát (tỉ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo đạt 100%), nhiên mơ sẹo cứng, màu trắng sữa (Hình 2) Đến tuần thứ tư, mơ sẹo thứ cấp hình thành, có màu vàng nhạt cứng ghi nhận tất mẫu cấy Như vậy, việc kết hợp KIN với NAA với nồng độ khảo sát có khả thúc đẩy nhanh hình thành mơ sẹo lại không hỗ trợ tạo mô sẹo xốp từ thân non Xạ đen Tương tự, theo Bhagya Chandrashekar (2013), mẫu cấy từ khúc cắt thân non Sâm nam Cyclea peltata Lam môi trường MS bổ sung NAA (0,1; 0,5; 1; 2; mg/L) kết hợp với KIN (0,1; 0,5; 1; 2; mg/L) hình thành mơ sẹo cứng Sự cảm ứng hình thành mơ sẹo đặc điểm hình thái mơ sẹo có 460 Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(2):458-467 Hình 1: Mơ sẹo từ lát cắt thân non Xạ đen sau tuần nuôi cấy môi trường MS bổ sung: (a) NAA mg/L (đối chứng); (b) NAA 1,0 mg/L; (c) NAA 1,5 mg/L; (d) NAA 2,0 mg/L; (e) NAA 2,5 mg/L; (f ) NAA 3,0 mg/L; (g) NAA 3,5 mg/L Hình 2: Mô sẹo từ lát cắt thân non Xạ đen sau tuần nuôi cấy môi trường MS bổ sung NAA 5,0 mg/L KIN 0,1 mg/L thể bị ảnh hưởng nhiều yếu tố điều kiện môi trường, kiểu gene mẫu cấy, điều kiện nuôi cấy, loại nồng độ chất điều hoà sinh trưởng thực vật 20 Ảnh hưởng 2,4-D kết hợp với NAA BA lên hình thành mơ sẹo Sự phối hợp 2,4-D với BA NAA thực để cảm ứng tạo mô sẹo từ lát cắt thân non Xạ đen Kết tạo mô sẹo ghi nhận Bảng Sau ngày nuôi cấy, mô sẹo bắt đầu xuất bề mặt mẫu cấy tất nghiệm thức khảo sát Sau ngày, mô sẹo phát triển khắp mẫu cấy (Hình 3) Sau tuần ni cấy, mô sẹo thứ cấp phát triển, xốp, mọng nước, màu trắng đục trắng xanh Trong đó, mơ sẹo môi trường chứa 2,4-D 0,4 mg/L kết hợp với BA 0,1 mg/L có khối lượng cao sau tuần tuần nuôi cấy, tương ứng 0,027 g 0,049 g (Bảng 4) 461 Việc sử dụng chất điều hồ sinh trưởng thực vật phù hợp có ảnh hưởng quan trọng đến phân chia tế bào mô quan thực vật điều kiện in vitro Việc bổ sung auxin vào môi trường ni cấy hồn tồn cần thiết 21 Auxin nhóm chất có khả thay đổi chương trình di truyền sinh lý săđ có tồn mô thực vật Tế bào phản ứng với auxin trở lại trạng thái chưa biệt hóa bắt đầu phân chia 2,4-D auxin sử dụng nhiều để cảm ứng hình thành mơ sẹo Để tạo mô sẹo từ mẫu cấy rộng, 2,4-D nồng độ từ 5-15 µ M thường sử dụng 22 Mặc dù 2,4-D thúc đẩy phát triển mô sẹo nồng độ cao, ức chế q trình 23 nồng độ cao mức cần thiết Sự kết hợp chất điều hoà sinh trưởng thành cơng việc tạo mơ sẹo xốp nhiều loài thực vật bậc cao 18 Do đó, số trường hợp, cytokinin thêm vào mơi trường nuôi cấy để phối hợp với auxin trình kích thích hình thành tăng sinh mơ sẹo Cytokinin tác động mạnh sau auxin lên tăng trưởng phân chia tế bào 21 Theo nghiên cứu Zeng cộng (2009) 24 , mô sẹo hình thành từ mẫu cấy Nhót đắng (Elaeagnus angustifolia L.) mơi trường MS có 2,4-D 1,0 mg/L BA 0,5 mg/L tốt so với mẫu cấy mơi trường có NAA hay TDZ kết hợp với BA, tỉ lệ tạo sẹo đạt 98% mơ sẹo có màu trắng, xốp Tương tự vậy, Anusha cộng (2016) 14 cho thấy hình thái mô sẹo từ Săng máu (Celastrus paniculatus) khác biệt rõ rệt sử dụng 2,4-D (0,5–2,5 mg/L) riêng rẽ 2,4-D 1,5 mg/L kết hợp với NAA (0,5–2,5 mg/L) Trong đó, mơi trường bổ sung 2,4-D 1,5 mg/L kết hợp với NAA 1,0 mg/L cảm ứng tạo mô sẹo màu kem, xốp, với tỉ lệ tạo mơ sẹo đạt 96,42% Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(2):458-467 Bảng 4: Ảnh hưởng 2,4-D kết hợp với NAA hay BA lên hình thành mơ sẹo từ lát cắt thân non Xạ đen sau tuần nuôi cấy Chất ĐHSTTV (mg/L) Tỉ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo (%) Tỉ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo xốp (%) Khối lượng tươi mô sẹo sau tuần (g) Khối lượng tươi mơ sẹo sau tuần (g) Hình thái mơ sẹo 2,4-D 1,0 - 100 60 0,026 ± 0,005b 0,042 ± 0,009ab∗ Trong, xanh 2,4-D 0,4 BA 0,1 100 75 0,027 ± 0,004b 0,049 ± 0,002b Trắng đục vàng nhạt 2,4-D 1,5 NAA 1,0 100 70 0,015 ± 0,003a 0,029 ± 0,01a Trắng, *Cácchữ khác cột thể khác biệt có ý nghĩa với p≤ 0,05 Hình 3: Mơ sẹo từ lát cắt thânnon Xạ đen sau tuần nuôi cấy môi trường MS bổ sung: (a) 2,4-D 1,0 mg/L; (b) 2,4-D 0,4 mg/L BA 0,1 mg/L; (c) 2,4-D 1,5 mg/L NAA 1,0 mg/L Ảnh hưởng môi trường khống pH lên hình thành mơ sẹo Trong ni cấy in vitro, mơi trường khống giữ vai trị quan trọng việc cảm ứng hình thành, tăng sinh phát sinh hình thái mơ sẹo 21 Mô sẹo xốp ưu tiên sử dụng để làm ngun liệu cho q trình ni cấy tế bào mơi trường lỏng 18 Ở thí nghiệm này, hai mơi trường khống MS B5 bổ sung 2,4-D 0,4 mg/L BA 0,1 mg/L với pH khác sử dụng để khảo sát hình thành mơ sẹo xốp Kết Bảng Hình cho thấy thành phần khống pH mơi trường ảnh hưởng đáng kể đến hình thành tăng sinh mơ sẹo Xạ đen Trong thí nghiệm này, mơ sẹo sơ cấp bắt đầu hình thành sau ngày ni cấy Tuy nhiên, mơi trường có pH 5,3, mẫu cấy có gia tăng kích thước tỉ lệ hình thành sẹo thấp Với pH 5,8, mẫu cấy gia tăng kích thước đáng kể sau tuần nuôi cấy Sau tuần, mẫu cấy môi trường có pH 5,8 có khối lượng tươi cao so với mơi trường có pH 5,3 Trong đó, mẫu cấy mơi trường B5 với pH 5,8 có tỉ lệ tạo sẹo xốp cao (85%) khối lượng sẹo cao (0,054 g) Mô sẹo phát triển khắp bề mặt mẫu sau tuần nuôi cấy Mơ sẹo có dạng xốp, mọng nước có màu trắng đục đến vàng nhạt Sau tuần, mẫu cấy môi trường B5 pH 5,8 phát triển tốt có màu vàng nhạt (Hình 5) Trong đó, mơ sẹo nghiệm thức khác xuất màu vàng nâu nâu đen sau tuần nuôi cấy Quan sát kính hiển vi, mơ sẹo gồm tế bào dính chặt vào mơ sẹo xốp gồm nhiều tế bào rời rạc (Hình 6) Hình thái mơ sẹo chịu ảnh hưởng khơng chất điều hoà sinh trưởng thực vật ngoại sinh mà chịu ảnh hưởng thành phần hàm lượng khoáng Theo Lê Thị Thuỷ Tiên cộng (2006), mô sẹo từ thân non Taxus wallichiana Zucc (thông đỏ Lâm Đồng) phát triển tốt môi trường B5 bổ sung 2,4-D mg/L kết hợp với KIN mg/L so với môi trường MS với thành phần hàm lượng chất điều hoà sinh trưởng thực vật tương tự 25 pH môi trường nuôi cấy yếu tố quan trọng hình thành mô sẹo, ảnh hưởng đến di chuyển ion, hấp thu dưỡng chất (đặc biệt + NH4 NO3 − ) 26 chất điều hoà sinh trưởng thực vật 18 Ở pH định, phần ion H+ xâm nhập vào thành tế bào để tạo độ pH tối ưu cho hoạt động enzyme, có tác động nới lỏng thành tế bào 27 ; Ion H+ hoạt hóa enzyme phân hủy liên kết sợi cellulose làm cho chúng lỏng lẻo tạo điều kiện cho thành tế bào giãn tác dụng áp 462 Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(2):458-467 Bảng 5: Ảnh hưởng mơi trường khống pH lên hình thành mơ sẹo từ lát cắt thân non Xạ đen sau tuần nuôi cấy Môi trường pH Tỉ lệ tạo mô sẹo xốp (%) Khối lượng tươi mô sẹo (g) Màu sắc mô sẹo MS 5,3 56 0,017 ± 0,002a Vàng đậm 78 0,044 ± Trắng đục vàng nhạt 5,3 41 0,01 ± 5,8 85 0,054 ± 0,009c 5,8 B5 0,001b 0,003a Vàng nâu Trắng đục vàng nhạt *Các chữ khác cột thể khác biệt có ý nghĩa với p ≤ 0,05 Hình 4: Mô sẹo từ lát cắtthân non Xạ đen sau tuần nuôi cấy môi trường:(a) MS; pH 5,3; (b) MS; pH 5,8; (c) B5; pH5,3; ( d) B5; pH 5,8 suất thẩm thấu không bào trung tâm, kích thích tăng trưởng tế bào 28 Vì vậy, mơi trường pH thích hợp giúp tế bào rời trở nên xốp Theo Jayaraman cộng (2014) 18 , mô sẹo từ Trầm hương (Aquilaria malaccensis) môi trường MS có pH 5,7 tăng sinh tốt so với mẫu cấy mơi trường có pH 5,0; 5,5 6,0; mô sẹo xốp xuất nhiều môi trường có pH 5,7 nguyên liệu cho ni cấy huyền phù tế bào Hình 5: Mơ sẹo từ lát cắt thân non Xạ đen sau tuầnnuôi cấy môi trường B5, pH 5,8 Xác định số nhóm hợp chất tự nhiên lá, cành mơ sẹo Xạ đen Thí nghiệm thực nhằm xác định số nhóm hợp chất tự nhiên dịch chiết EtOH từ mô sẹo xốp tuần tuổi, hình thành từ 463 Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(2):458-467 Hình 6: Tế bào mơ sẹo từ lát cắt thân non Xạ đen tuần tuổi kính hiển vi quang học vậtkính x40 (a) Mơ sẹo cứng; (b) Mô sẹo xốp lát cắt thân non Xạ đen so sánh với dịch chiết từ cành Xạ đen năm tuổi trồng vườn thực nghiệm Dịch chiết từ khô, cành khơ mơ sẹo tươi Xạ đen (Hình 7) thu nhận kết định tính hợp chất tự nhiên trình bày Bảng Bảng 6: Thành phần số nhóm hợp chất tự nhiên mô sẹo Hợp chất Kết Lá khô Cành khô Mô sẹo Acid hữu + - + Phenolic tannin + + + Alkaloid + + + Flavonoid + + + *Ghi chú: (-): không diện; (+): diện Hình 7: Dịch chiết EtOH từ (a), cành (b) mô sẹo Xạ đen (c) Kết Bảng cho thấy, dịch chiết (lá mơ sẹo), nhóm hợp chất acid hữu cơ, phenolic tannin, alkaloid, flavonoid có phản ứng dương tính với thuốc thử Riêng mẫu dịch chiết từ cành khơng có xuất phản ứng dương tính với nhóm chất acid hữu Điều hàm lượng hợp chất dịch chiết thấp ngươñg phát thuốc thử thử nghiệm Năm 2006, Ly cộng phân lập hợp chất chống oxy hóa từ dịch chiết methanol 50% từ Xạ đen khô Tám hợp chất phenolic định tính phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao cấu trúc chúng xác định phương pháp quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân Các hợp chất phenolic chứng minh có hoạt tính chống oxy hóa Tương tự, năm 2018, Trần Thị Mỹ Trâm cộng ghi nhận dịch chiết methanol từ xạ đen in vitro có diện nhóm alkaloid, phenolic tannin KẾT LUẬN Từ kết trên, rút số kết luận sau: (i) Môi trường B5 với pH 5,8 bổ sung 2,4-D 0,4 mg/L BA 0,1 mg/L thích hợp cho tạo mô sẹo từ lát cắt thân non Xạ đen với tỉ lệ mô sẹo xốp đạt 85%, khối lượng tươi mô sẹo sau tuần nuôi cấy 0,054 g (ii) Mô sẹo Xạ đen tươi tuần tuổi chứa hợp chất tự nhiên tương tự cành Xạ đen năm tuổi trồng vườn thực nghiệm, acid hữu cơ, phenolic tannin, alkaloid flavonoid LỜI CẢM ƠN Nhóm tác giả xin chân thành cảm ơn Trường ĐH Thủ Dầu Một Trường ĐH Bách Khoa, Đại học Quốc 464 Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(2):458-467 gia, Tp HCM tạo điều kiện sở vật chất để thực nghiên cứu XUNG ĐỘT LỢI ÍCH Các tác giả tun bố khơng có xung đột lợi ích ĐĨNG GĨP CỦA CÁC TÁC GIẢ Tác giả Phạm Thị Mỹ Trâm: tiến hành thí nghiệm, phân tích liệu viết thảo Tác giả Lê Thị Thuỷ Tiên: cung cấp mẫu, hướng dẫn thiết kế thí nghiệm, đóng góp giải thích liệu chỉnh sửa thảo Tác giả Ngơ Kế Sương: đóng góp giải thích liệu chỉnh sửa thảo Tất tác giả đọc tán thành thảo cuối 10 11 12 TỪ VIẾT TẮT 2,4-D: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) BA: benzyl adenine B5: Gamborg medium ĐHSTTV: Điều hoà sinh trưởng thực vật KIN: kinetin MS: Murashige and Skoog medium NAA: naphthalene acetic acid WPM: Woody Plant Medium 13 14 15 TÀI LIỆU THAM KHẢO Thủy TT, Cường NH, Ninh PT, Sung TV Phân lập xác định cấu trúc hợp chất triterpene từ Xạ đen Tạp chí Hóa Học 2008;46(4):456–461 Available from: http://vjs.ac.vn/ index.php/vjchem/article/view/4457 Ly TN, Shimoyamada M, Yamauchi R Isolation and characterization of rosmarinic acid oligomers in Celastrus hindsii Benth leaves and their antioxidative activity Agricultural and Food Chemistry 2006;54(11):3786–3793 Available from: DOI:10.1021/jf052743f Kuo YH, Kuo LMY Antitumour and anti_AIDS triterpenes from Celastrus hindsii Phytochemistry 1997;44(7):1275– 1281 Available from: DOI:10.1016/S0031-9422(96)00719-4 Trung LT, Liêm N, Hanh TV Kết nghiên cứu bước đầu chiết xuất K10 từ Celastrus hindsii Benth họ Celastreae Kỷ yếu cơng trình nghiên cứu Y học quân sự, Tạp chí Y dược học Quân 1999;3:3–7 Cường NH Nghiên cứu thành phần hóa học thăm dị hoạt tính sinh học Xạ đen (Celastrus hindsii Benth and Hook.) cùm rụm (Ehretia dentata Courch.) [Luận án tiến sĩ] Hà Nội: Viện Hóa học, Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam 2008;p 117 Available from: http://luanan.nlv.gov.vn/ luanan?a=cl&cl=CL1&sp=TTbGQyXGNwSO Nam VQ, Thắng BV, Thơ NT Nhân giống Xạ đen (Celastrus hindsii Benth) phương pháp ni cấy mơ Tạp chí Khoa học Công nghệ Lâm nghiệp 2013;2:11–16 Available from: http://vnuf.edu.vn/documents/454250/1795798/2.B\ char”00F9\relaxi%20V{\char”0103\relax}n%20Thắng%2C% 20V{~{u}}%20Quang%20Nam.pdf Trâm TTM, Hương TT, Loan LQ, ung NHD, Tuấn TT Khảo sát sinh trưởng, khả kháng oxy hoá hàm lượng phenolic Xạ đen Ehretia asperula Zollinger et Moritzi in vitro tác động đèn led Tạp 465 16 17 18 19 20 21 22 chí Khoa học cơng nghệ Thực phẩm 2018;16(1):38– 48 Available from: http://jstf.hufi.edu.vn/uploads/files/so-tapchi/nam-2018/tap-16-so-01/5_38-48.pdf Tien LTT, Minh TV Tissue cultures of xa den Ehretia asperula Zollinger et Moritzi Tap chi khoa hoc (Journal of Science, An Giang University,Viet Nam) 2015;3(3):113–123 Available from: http://sj.agu.edu.vn/?q=node/253 Tuan TT, Loan NTK, Thuy PTT, Hang NTT, Trang NTH, Thao NVT, et al Quanlitative rosmarinic acid content in ex vitro plant and initial micropropagation of Celastrus hindsii Vietnamese Journal of Biotechnology 2016;14:283–290 Loan PT, Triển ND, Viên NTX Khả nhân giống sinh trưởng loài Xạ đen (Celastrus hindsii Benth) giai đoạn vườn ươm Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 2015;1(1):105– 108 Available from: http://vnuf.edu.vn/documents/454250/ 1795798/2.B\char”00F9\relaxi%20V{\char”0103\relax}n% 20Thắng%2C%20V{~{u}}%20Quang%20Nam.pdf Misawa M Plant tissue culture: An alternative for production of useful metabolites Food and Agriculture Organization of the United Nations 1994;Available from: http://www.fao.org/ docrep/t0831e/t0831e00.htm Murashige T, Skoog FA A revised medium for a rapid growth and bioassays with tobacco tissues cultures Physiology Plantarum 1962;15:473–497 Available from: https://doi.org/10 1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x Gamborg OL, Miller RA, Ojima K Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells Experimental Cell Research 1968;50:151–158 Available from: DOI:10.1016/00144827(68)90403-5 Anusha TS, Joseph MV, Elyas KK Callus induction and elicitation of total phenolics in callus cell suspension culture of Celastrus paniculatus - willd, an endangered medicinal plant in India Pharmacogn 2016;8(5):471–475 Available from: DOI:10.5530/pj.2016.5.10 Billore V, Khatediya L, Jain M Sink - Source system of in vitro suspension culture of Celastrus paniculatus under regulation of monochromatic lights Plant Tissue Culture and Biotechnology 2016;26(1):175–185 Available from: DOI:10.3329/ptcb v26i2.30567 Bộ môn Thực vật – Dược liệu Giáo trình thực hành dược liệu Tp HCM: Cao đẳng Nguyễn Tất Thành 2009;p 48 Phương NTN, Phương PT, Tài NHT, Đức TH, Độ ND Khảo sát hàm lượng flavonoid, alkaloid khả kháng khuẩn cao chiết cỏ mần trầu (Eleusine indica) Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 2017;53B:54–60 Available from: DOI:10.22144/ctu.jvn.2017.157 Jayaraman S, Daud NH, Halis R, Mohamed M Effects of plant growth regulators, carbon sources and pH values on callus induction in Aquilaria malaccensis leaf explants and characteristics of the resultant calli Journal of Forestry Research 2014;25(3):535–540 Available from: DOI:10.1007/s11676014-0492-8 Cương LK, Chiến HX, Nam NB, Hương TT, Nhựt DT Ảnh hưởng số yếu tố lên khả tăng sinh mô sẹo ”xốp” bước đầu nuôi cấy huyền phù tế bào sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Tạp chí Sinh học 2012;34(3):265–276 Available from: vjs.ac.vn/index.php/ vjbio/article/download/1792/2378 Bhagya N, Chandrashekar KR Effect of growth regulators on callus induction from Cyclea peltata (lam.) Hook f Thoms Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research 2013;6(4):85–88 Available from: https://innovareacademics in/journals/index.php/ajpcr/article/view/497 Lượng ND, Tiên LTT Công nghệ tế bào Tp HCM: Đại học Quốc gia 2006;p 376 Chất TN, Trí BM, Tồn PD Ảnh hưởng 2,4D kiểu cắt lớp mỏng tế bào đến hình thành phát triển mơ sẹo gấc (Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng) Tạp chí Khoa học Công nghệ Việt Nam 2017;16(5):22–26 Available from: http://www.vjol.info/index.php/khcn/article/view/36878 Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 4(2):458-467 23 Behbahani M, Shanehsazzadeh M, Hessami MJ Optimization of callus and cell suspension cultures of Barringtonia racemosa (Lecythidaceae family) for lycopene production Sci Agric (Piracicaba, Braz) 2011;68(1):69–76 Available from: DOI:10.1590/S0103-90162011000100011 24 Zeng FS, Wang WW, Zhan YG, Xin Y Establishment of the callus and cell suspension culture of Elaeagnus angustifolia for the production of condensed tannins African Journal of Biotechnology 2009;8(19):5005–5010 Available from: https://academicjournals.org/journal/AJB/articleabstract/90296AA8445 25 Tiên LTT, Việt BT, Lượng ND Tìm hiểu tăng trưởng dịch treo tế bào Taxus wallichiana Zucc Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ ĐHQG, Tp HCM 2006;9(5):47– 51 Available from: http://vjol.info.vn/index.php/JSTD/article/ download/28973/24711 26 Ikeda T, Taji A, Hirai M, Yamashita I, Enomoto S, Noguchi M Association between water status and sucrose metabolism in cell suspension culture of carrot Plant Biotechnology 1999;16(5):375–379 Available from: DOI:10.5511/ plantbiotechnology.16.375 27 Skirvin RM, Chu MC, Mary L, Heather Y, Thomas F Stability of tissue culture medium pH as a function of autoclaving, time and cultured plant material Plant Cell Reports 1986;5:292– 294 Available from: DOI:10.1007/BF00269825 28 Nhựt DT, Hà TTT, Hương TT, Cương HV, Huy NP Nghiên cứu hình thành mơ sẹo tế bào đơn kiwi (Actinidia deliciosa) Tạp chí Sinh học 2012;34(4):505–514 Available from: http://vjs.ac.vn/index.php/vjbio/article/download/2690/ pdf%28Vietnamese%29 466 Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Natural Sciences, 4(2):458-467 Research Article Open Access Full Text Article Effects of plant growth regulators, mineral medium and pH values on the callus induction of young stem cutting slices of Ehretia asperula Zoll et Mor Pham Thi My Tram1,2,* , Ngo Ke Suong3 , Le Thi Thuy Tien2 TÓM TẮT Use your smartphone to scan this QR code and download this article Xa den (Ehretia asperula Zoll et Mor.) belongs to the Boraginaceae family, is a precious medicine, called ``cancer'' tree in Muong at Hoa Binh province traditional medicine Xa den was shown to inhibit the development of malignant tumors, reduce oxidation, enhance resistance In this study, we investigated the induction of friable callus in Xa den young stem section that coud be further used to culture cell suspension and produce bioactive compounds In that, we focussed on the effects of the plant growth regulators, mineral media and pH on the formation of friable callus of Xa den The results showed that all treatments stimulated the formation of callus from Xa den thin stem (0.5-1.0 mm) In particular, samples which were cultured in B5 medium supplemented with 0.4 mg/L 2,4-D and 0.1 mg/L BA, at pH 5.8 produced highest percentage of secondary callus in friable (85%) and this callus also had highest fresh weight after weeks of culture (0.054 g) To evaluate the presence of natural compounds in the callus and compared to those in caltivated plants, the ethanol extract of dry leaves, branches and fresh callus were used The results showed the presence of natural compounds in the callus such as organic acid, phenolic, tannin, alkaloid and flavonoid was similiar to the one in 2-year-old plant Từ khoá: Ehretia asperula Zoll et Mor., friable callus, Xa den, young stem section, natural compounds Thu Dau Mot University, Binh Duong Ho Chi Minh City University of Technology, VNU-HCM, Vietnam Institute of Tropical Biology, VAST Liên hệ Pham Thi My Tram, Thu Dau Mot University, Binh Duong Ho Chi Minh City University of Technology, VNU-HCM, Vietnam Email: tramptm@tdmu.edu.vn Lịch sử • Ngày nhận: 05-6-2019 • Ngày chấp nhận: 16-01-2020 • Ngày đăng: 06-6-2020 DOI :10.32508/stdjns.v4i2.763 Bản quyền © ĐHQG Tp.HCM Đây báo công bố mở phát hành theo điều khoản the Creative Commons Attribution 4.0 International license Trích dẫn báo này: Tram P T M, Suong N K, Tien L T T Effects of plant growth regulators, mineral medium and pH values on the callus induction of young stem cutting slices of Ehretia asperula Zoll et Mor Sci Tech Dev J - Nat Sci.; 4(2):458-467 467 ... độ chất điều hồ sinh trưởng thực vật 20 Ảnh hưởng 2,4-D kết hợp với NAA BA lên hình thành mô sẹo Sự ph? ??i hợp 2,4-D với BA NAA thực để cảm ứng tạo mô sẹo từ lát cắt thân non Xạ đen Kết tạo mô sẹo. .. 0,1 1,0 0 1,5 1,0 Chất ĐHSTTV Nghiệm thức Khảo sát ảnh hưởng môi trường khống với pH khác lên hình thành mơ sẹo Lát cắt thân non Xạ đen nuôi cấy môi trường MS B5 điều kiện pH 5,3 5,8 với nồng... NAA benzyl adenine (BA) lên hình thành mơ sẹo Lát cắt thân non Xạ đen đặt môi trường MS bổ sung chất ĐHSTTV theo Bảng Bảng 1: Ảnh hưởng chất điều hồ sinh trưởng lên tạo mơ sẹo 8,14,15 2,4-D (mg/L)