Thiết kế primer trên đoạn gen mã hóa protein nucleocapsid của SARS cov 2

Họ tên: Nguyễn Minh Anh MSSV: 20174394 Lớp: KTSH.02-K62 Nhóm: Thứ BÁO CÁO TIỂU LUẬN Thực hành: Tin sinh học Thiết kế Primer đoạn gen mã hóa Protein nucleocapsid SARS-CoV-2 I - - Tổng quan: SARS-CoV-2 virus gây đại dịch viêm phổi cấp COVID-19 Tính đến ngày 28/6/2020, số ca mắc COVID-19 tồn giới vượt ngưỡng 10 triệu người, 500.000 ca tử vong Yêu cầu cấp bách đặt tìm cách phát triển phương pháp xét nghiệm chẩn đốn tìm vaccine đặc hiệu, ngăn chặn lây lan virus nguy hiểm Mục tiêu tiểu luận thiết kế mồi cho phản ứng PCR phát gen SARS-CoV-2 đoạn gen mã hóa nucleocapsid SARS-CoV-2 - Các bước tiến hành SARS-CoV-2 có họ hàng gần với SARS-CoV (cùng coronavirus chủng SARS), nên tiến hành xây dựng phương án thiết kế mồi dựa trình tự gen báo công bố Thu thập liệu gen nucleocapsid Database Truy cập trang web NCBI/ Nucleotide/ Nhập từ khóa NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Tìm gen với từ khóa SARS - Tìm gen mã hóa nucleocapsid genome SARS-CoV, nằm vùng gen N Lấy trình tự FASTA II >NC_004718.3:28120-29388 SARS coronavirus, complete genome ATGTCTGATAATGGACCCCAATCAAACCAACGTAGTGCCCCCCGCATTACATTTGGTGGACCCACAGATTCAACTGA CAATAACCAGAATGGAGGACGCAATGGGGCAAGGCCAAAACAGCGCCGACCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGT CTTGGTTCACAGCTCTCACTCAGCATGGCAAGGAGGAACTTAGATTCCCTCGAGGCCAGGGCGTTCCAATCAACACC AATAGTGGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCCGACGAGTTCGTGGTGGTGACGGCAAAATGAA AGAGCTCAGCCCCAGATGGTACTTCTATTACCTAGGAACTGGCCCAGAAGCTTCACTTCCCTACGGCGCTAACAAAG AAGGCATCGTATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCCAAAGACCACATTGGCACCCGCAATCCTAATAAC AATGCTGCCACCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAGGGAAGCAGAGGCGG CAGTCAAGCCTCTTCTCGCTCCTCATCACGTAGTCGCGGTAATTCAAGAAATTCAACTCCTGGCAGCAGTAGGGGAA ATTCTCCTGCTCGAATGGCTAGCGGAGGTGGTGAAACTGCCCTCGCGCTATTGCTGCTAGACAGATTGAACCAGCTT GAGAGCAAAGTTTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCATCTAA AAAGCCTCGCCAAAAACGTACTGCCACAAAACAGTACAACGTCACTCAAGCATTTGGGAGACGTGGTCCAGAACAAA CCCAAGGAAATTTCGGGGACCAAGACCTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTT GCTCCAAGTGCCTCTGCATTCTTTGGAATGTCACGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACATGGCTGACTTA TCATGGAGCCATTAAATTGGATGACAAAGATCCACAATTCAAAGACAACGTCATACTGCTGAACAAGCACATTGACG CATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAAAAGACTGATGAAGCTCAGCCTTTGCCGCAG AGACAAAAGAAGCAGCCCACTGTGACTCTTCTTCCTGCGGCTGACATGGATGATTTCTCCAGACAACTTCAAAATTC CATGAGTGGAGCTTCTGCTGATTCAACTCAGGCATAA - - Thực Blast ngân hàng liệu NCBI (có thể thực EMBL sở liệu khác) để tìm kiếm trình tự gen tương tự báo khoa học gen SARS-CoV công bố https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/BLASTn - Tìm trình tự mã hóa gen báo nguồn nơi khác nhau, để mong đợi có độ sai khác định trình tự gen (do virus biến đổi gen q trình vận động tiến hóa), từ tìm vùng bảo thủ 2 Đưa trình tự tìm vào cơng cụ Clustal W để so sánh cấu trúc gen ………………… Chọn khuôn thiết kế mồi 3.1 Chọn khuôn - - - Dựa thời điểm nghiên cứu công bố báo, chọn khuôn đoạn gen mã hóa nucleocapsid Genbank MK211374.1 có thời gian cơng bố gần (2019), gen giải trình tự từ chủng SARS lây sang người 3.2 Thiết kế mồi Sử dụng công cụ Primer-BLAST https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ Khuôn: >MK211374.1:28076-29341 Coronavirus BtRl-BetaCoV/SC2018, complete genome ATGTCTGATAATGGACCCCAAAACCAGCGTAGTGCCCCCCGCATTACATTTGGTGGACCCACAGATTCAAC TGACAATAACCAGGATGGAGGACGCAGTGGTGCACGGCCAAAGCAGCGCCGACCCCAAGGTTTACCCAATA ATACTGCGTCTTGGTTCACAGCTCTCACTCAGCATGGCAAGGAGGAACTTAAATTCCCTCGAGGCCAGGGC GTTCCAATCAACACCAATAGTGGTAAAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCCGACGAGTTCG TGGTGGTGATGGTAAAATGAAAGAGCTCAGCCCCAGATGGTACTTCTATTACCTAGGTACTGGCCCAGAAG CTTCACTTCCCTACGGCGCTAACAAAGAAGGCATCGTATGGGTCGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCT AAAGATCACATTGGCACCCGCAATCCTAATAACAATGCTGCCATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAAC ATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAGGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGCTCTTCATCACGTA GTCGCGGTAATTCAAGAAATTCAACTCCTGGCAGCAGTAGGGGAAATTCTCCTGCTCGAATGGCTAGCGGA GGTGGTGAAACTGCCCTCGCGCTATTGCTGCTAGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAGTTTCTGGTAA AGGCCAACAACAGCAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCATCCAAAAAGCCTCGCCAAA AACGTACTGCCACAAAACAGTACAACGTCACTCAAGCATTTGGGAGGCGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGA AACTTTGGTGACCAAGAATTAATCAGACAAGGGACTGATTACAAACATTGGCCACAAATTGCACAATTTGC TCCGAGTGCCTCTGCATTTTTCGGAATGTCACGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACATGGCTGA CTTATCATGGAGCCATTAAATTGGATGATAAAGATCCACAATTCAAAGACAACGTCATGCTGTTGAATAAG CACATTGACGCATACAAAGCATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAAAAGACTGATGAAGC TCAGCCTTTACCGCAGAGACAAAAGAAGCAGCCTACTGTGACTCTTCTTCCTGCGGCTGACATGGATGATT TCTCCAGACAACTTCAAAATTCCATGAGTGGAGCTTCTGCTGATTCAACTCAGGCATAA Kết thiết kế mồi: Kết cho 15 cặp mồi ảo: - - Dựa vào đặc điểm nhiệt độ bắt cặp mồi, tỉ lệ %G-C (trong khoảng 40-60%), khả tự bắt cặp,… ta tiến hành chọn mồi thử chạy PCR ảo với cặp mồi Chạy PCR ảo Trang https://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_products.html Nhận thấy đặc điểm cặp mồi số có nhiều đặc tính tốt: Nhiệt độ bắt cặp xấp xỉ nhau, tỉ lệ GC% 40%, khả tự bổ sung tự bổ sung kéo dài mạch đầu 3’ thấp so với cặp mồi khác => Chọn cặp mồi làm mồi để tiến hành chạy PCR ảo - Kết quả: PCR Products results >973 bp product from linear template MK211374.1:28076-29341 Coronavirus BtRl-BetaCoV/SC2018, complete genome, base 136 to base 1108 (BNN2 N2) CCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACAGCTCTCACTCAGCATGGCAAGGAGGAACTTAAATTCCCTCGAGG CCAGGGCGTTCCAATCAACACCAATAGTGGTAAAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCCGAC GAGTTCGTGGTGGTGATGGTAAAATGAAAGAGCTCAGCCCCAGATGGTACTTCTATTACCTAGGTACTGGC CCAGAAGCTTCACTTCCCTACGGCGCTAACAAAGAAGGCATCGTATGGGTCGCAACTGAGGGAGCCTTGAA TACACCTAAAGATCACATTGGCACCCGCAATCCTAATAACAATGCTGCCATCGTGCTACAACTTCCTCAAG GAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAGGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGCTCTTCA TCACGTAGTCGCGGTAATTCAAGAAATTCAACTCCTGGCAGCAGTAGGGGAAATTCTCCTGCTCGAATGGC TAGCGGAGGTGGTGAAACTGCCCTCGCGCTATTGCTGCTAGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAGTTT CTGGTAAAGGCCAACAACAGCAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCATCCAAAAAGCCT CGCCAAAAACGTACTGCCACAAAACAGTACAACGTCACTCAAGCATTTGGGAGGCGTGGTCCAGAACAAAC CCAAGGAAACTTTGGTGACCAAGAATTAATCAGACAAGGGACTGATTACAAACATTGGCCACAAATTGCAC AATTTGCTCCGAGTGCCTCTGCATTTTTCGGAATGTCACGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACA TGGCTGACTTATCATGGAGCCATTAAATTGGATGATAAAGATCCACAATTCAAAGACAACGTCATGCTGTT GAATAAGCACATTGACGCATACAAAGCATTCCCACCAACAGAGCCTAAAA - Tương tự chạy thử với mồi khác kết • Trên thực tế, gen cần tách có sai khác trình tự gen đoạn mồi Ta phải tiến hành so sánh với nhiều gen tìm được, tìm nhiều đoạn bảo thủ, làm việc với nhiều mồi để chạy PCR khuôn thực - Kiểm tra trình tự sản phẩm PCR Kiểm tra trình tự kết BLAST, xem kết BLAST có trình tự tương đồng với gen ban đầu làm khn khơng • Tiến hành chạy thử với gen mã hóa nucleocapsid SARS-CoV-2 (trình tự cơng bố), cho kết quả: >973 bp product from linear template NC_045512.2:28274-29533 Severe acute respiratory syndrome coronavirus isolate Wuhan-Hu-1, complete genome, base 136 to base 1108 (BNN2 - N2) CCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACCGCTCTCACTCAACATGGCAAGGAAGACCTTAAATTCCCTCGAGGACAAGG CGTTCCAATTAACACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTGGTG GTGACGGTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTTCCC TATGGTGCTAACAAAGACGGCATCATATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCAC CCGCAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAG AAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCA GGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGA CAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTG CTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGA CGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCC GCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGG GAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCAAAGATCAAGTCATTTTGCTG AATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAA Một số đặc điểm Major capsid protein (MCP) SARS-CoV-2 - Protein nucleocapsid (N) (SARS-CoV) bốn protein cấu trúc virus pI = 10,11 Mw = 45052,14 Da - Protein vỏ capsid tế bào chất, hình thành vỏ virus, góp phần định kháng nguyên virus ... báo, chọn khuôn đoạn gen mã hóa nucleocapsid Genbank MK211374.1 có thời gian cơng bố gần (20 19), gen giải trình tự từ chủng SARS lây sang người 3 .2 Thiết kế mồi Sử dụng công cụ Primer- BLAST https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools /primer- blast/... Kiểm tra trình tự kết BLAST, xem kết BLAST có trình tự tương đồng với gen ban đầu làm khn khơng • Tiến hành chạy thử với gen mã hóa nucleocapsid SARS- CoV- 2 (trình tự cơng bố), cho kết quả: >973 bp... AATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAA Một số đặc điểm Major capsid protein (MCP) SARS- CoV- 2 - Protein nucleocapsid (N) (SARS- CoV) bốn protein cấu trúc virus pI = 10,11 Mw = 450 52, 14 Da - Protein vỏ capsid tế bào chất, hình