NGHIÊN cứu đặc điểm mô BỆNH học và sự bộc lộ dấu ấn ALK TRONG UNG THƯ BIỂU mô TUYẾN của PHỔI tại BỆNH VIỆN k

DƯƠNG MINH PHƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC VÀ SỰ BỘC LỘ DẤU ẤN ALK TRONG UNG THƯ BIỂU MÔ TUYẾN CỦA PHỔI TẠI BỆNH VIỆN K Chuyên ngành : Giải phẫu bệnh Mã số : CK 62720105 ĐỀ CƯƠN

DƯƠNG MINH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC VÀ

SỰ BỘC LỘ DẤU ẤN ALK TRONG UNG THƯ BIỂU MÔ

TUYẾN CỦA PHỔI TẠI BỆNH VIỆN K

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN CHUYÊN KHOA CẤP II

HÀ NỘI – 2019

DƯƠNG MINH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC VÀ

SỰ BỘC LỘ DẤU ẤN ALK TRONG UNG THƯ BIỂU MÔ

TUYẾN CỦA PHỔI TẠI BỆNH VIỆN K

Chuyên ngành : Giải phẫu bệnh

Mã số : CK 62720105

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN CHUYÊN KHOA CẤP II

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS Lê Trung Thọ

HÀ NỘI – 2019

UTPKTBN : Ung Thư Phổi Không Tế Bào Nhỏ.

UTBMT : Ung thư biểu mô tuyến

UTBMV : Ung thư biểu mô vảy

TCYTTG : Tổ chức y tế thế giới

UTP : Ung thư phổi

KRAS : Kirsten-ras/V-ki-ras 2 kirsten rat sarcomaviral oncogene

homologEGFR : Epidermal Growth Factor Receptor

ALK : Anaplastic lymphoma kinase

EML4 : Echinoderm microtubule associated protein-like 4

FISH : Fluorescence in situ hybridization

PCR : Polymerase chain reaction

HE : Hematoxylin & Eosin

NSCLC : Non small cell lung carcinoma

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.Vai trò của gen alk trong ung thư phổi và tình hình nghiên cứu 3

1.1.1.Vai trò của gen ALK trong ung thư phổi 3

1.1.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 6

1.1.3 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 11

1.2 Một số phương pháp xác định đột biến gen ALK 12

1.2.1 Xét nghiệm lai tại chỗ gắn huỳnh quang 12

1.2.2 Nhuộm hóa mô miễn dịch 13

1.2.3 Kỹ thuật PCR 17

1.2.4 Các phương pháp phát hiện EML4-ALK khác trong NSCLC 18

1.2.5 Nghiên cứu về độ tương đồng của các phương pháp xét nghiệm ALK 18

1.3 Phân loại MBH cho UTBMT theo WHO 2015 19

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn đối tượng nghiên cứu 21

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 21

2.2.2 Cỡ mẫu và chọn mẫu nghiên cứu 22

2.2.3 Biến số nghiên cứu 22

2.2.4 Các bước tiến hành nghiên cứu 23

2.3 Xử lý và phân tích số liệu 24

2.4 Khống chế sai số 24

3.1 Kết quả chung về đặc điểm BN, vị trí mẫu u làm XN và típ MBH 26

3.1.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu 26

3.1.2 Tỷ lệ các thứ típ trong UTBM tuyến 28

3.1.3 Các vị trí sinh thiết mẫu làm xét nghiệm 28

3.2 Kết quả xét nghiệm ALK 29

3.3 Kết quả nhuộm ALK với các nhóm tuổi, giới, và típ MBH 29

3.3.1 Kết quả nhuộm ALK với đặc trưng cá nhân tuổi, giới 29

3.3.2 Kết quả nhuộm ALK với các típ MBH 30

CHƯƠNG 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN 31

DỰ KIẾN KẾT LUẬN 32

KẾ HOẠCH NGHIÊN CỨU 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 1.2: Các tiêu chí tính điểm để xác định tình trạng của ALK trong NSCLC14

Bảng 2.1 Biến số nghiên cứu 22

Bảng 3.1 Phân bố bệnh theo tuổi 26

Bảng 3.2 Phân bố bệnh nhân theo giới 27

Bảng 3.3 Tỷ lệ các bệnh nhân hút thuốc lá/không hút thuốc lá 27

Bảng 3.4 Tỷ lệ các thứ típ trong UTBM tuyến 28

Bảng 3.5 Các vị trí mẫu u làm xét nghiệm ALK 28

Bảng 3.6 Tỷ lệ mẫu xét nghiệm nguyên phát hay di căn 29

Bảng 3.7 Tỷ lệ kết quả ALK âm tính hay dương tính 29

Bảng 3.8 Tỷ lệ bộc lộ (âm tính/dương tính) trong nhóm tuổi 29

Bảng 3.9 Tỷ lệ dương tính và âm tính trong các nhóm về giới tính 30

Bảng 3.10 Tỷ lệ dương tính với ALK trong các nhóm chẩn đoán 30

Y

Biểu đồ 1.1 Tỷ lệ kháng thuốc điều trị nhắm trúng đích của bệnh nhân UTP 11Biểu đồ 3.1 Phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi 26Biểu đồ 3.2 Phân bố bệnh nhân theo giới 27

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh bộc lộ ALK bằng kỹ thuật lai tại chỗ gắn huỳnh quang13Hình 1.2 Tiêu chuẩn đánh giá sự bộc lộ ALK bằng nhuộm HMMD [42] 15Hình 2.1 Tiêu chuẩn dánh giứa sự bộc lộ ALK bằng nhuộm HMMD [28].24

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1 Sự hình thành đột biến ALK .4

Sơ đồ 1.1 (tiếp) Sự hình thành đột biến ALK .5

Sơ đồ 1.2 Mô tả một số protein liên kết với ALK được xác định trong

UTPKTBN 8

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư phổi (UTP) là bệnh lý ác tính thường gặp và là nguyên nhân gây

tử vong do ung thư hàng đầu trên toàn thế giới Thống kê cho thấy số trườnghợp UTP trên thế giới đã tăng xấp xỉ 104% kể từ năm 1985 tới 2012 (tăng84% ở nam giới và tăng 166% ở nữ giới) Theo thống kê của AmericanCancer Society năm 2016, dự tính toàn Hoa Kỳ có khoảng 224390 trường hợpUTP mới mắc (117920 nam và 106470 nữ), trong đó có 158080 trường hợp tửvong (85920 nam và 72160 nữ) [1] Điều trị ung thư phổi có nhiều phươngpháp khác nhau Phương pháp áp dụng cho giai đoạn sớm là phẫu thuật, giaiđoạn muộn hơn là hóa-xạ trị Những thập niên gần đây, phương pháp điều trịnhắm trúng đích trở nên quan trọng vì nhờ liệu pháp này thời gian sống thêmkhông bệnh cho những bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ có đột biếnđược kéo dài Hồ sơ phân tử, đặc biệt là đột biến EGFR hoặc KRAS vàEML4-ALK dung hợp đang và đã định hướng quyết định điều trị Thuốckháng TKIs nhắm đích ở bệnh nhân có đột biến EGFR, ALK/ROS1 đã pháttriển mạnh và phổ biến trên thế giới [2] Với các thế hệ thuốc điều trị khi cóđột biến EGFR thế hệ 1,2,3 như gefitinib, afatinib, osimetinib Những bệnhnhân không có đột biến EGFR sẽ được xét nghiệm làm đột biến ALK Các thế

hệ thuốc điều trị đích cho đột biến ALK là Crizotinib, Ceritinib, Alectinib,Brigatinib, Lorlatinib đã được đánh giá có hiệu quả trên các nghiên cứu thửnghiệm lâm sàng và trên thực tế [3]

Gen anaplastic lymphoma kinase (ALK) mã hóa một loại protein thuộcmột phần của họ thụ thể insulin [4], [5] Sự thay đổi trong gen ALK xảy ra ởmột số loại ung thư như nhóm u lympho tế bào lớn bất thục sản… bao gồm cảung thư phổi không tế bào nhỏ [6] Sự tái sắp xếp gen ALK trên bệnh nhânung thư phổi không tế bào nhỏ chiếm tỷ lệ từ 4-7% Tỷ lệ cũng tương tự hoặc

cao hơn trên bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi Việc phát hiện cácđột biến gen ALK có thể được thực hiện bằng kỹ thuật lai tại chỗ (FISH) hoặchóa mô miễn dịch (HMMD) Một loạt các nghiên cứu trên thế giới so sánh giátrị giữa các phương pháp đã chỉ ra sự tương đồng của phương pháp xétnghiệm Ventana ALK (D5F3) có độ tương đồng cao với FISH [7],[8], [9],[10] Do vậy trong thực hành lâm sàng, lựa chọn kỹ thuật HMMD cho việcphát hiện xắp xếp lại gen ALK đã được y giới toàn cầu thừa nhận và áp dụng

từ vài năm trở lại đây Tại Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về mô bệnh họcUTP, nhiều nghiên cứu về đột biến gen EGFR nhưng còn rất ít nghiên cứu vềđột biến ALK trong ung thư tuyến phổi Vì vậy, chúng tôi nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu đặc điểm mô bệnh học và sự bộc lộ dấu ấn ALK trên bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi tại bệnh viện K” nhằm 2 mục tiêu:

1 Nhận xét các đặc điểm vi thể của các dưới típ ung thư biểu mô tuyến của phổi tại bệnh viện K.

2 Xác định tỷ lệ bộc lộ dấu ấn ALK trên bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi và đối chiếu với một số đặc điểm bệnh học của bệnh

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Vai trò của gen alk trong ung thư phổi và tình hình nghiên cứu

1.1.1.Vai trò của gen ALK trong ung thư phổi

Năm 1990, hai tác giả Ullrich & Schlessinger phát hiện ra enzymeALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) trong nhóm gia đình men tyrosine củareceptor insulin (Insuline Receptor Tyrosine Kinase Family: RTK) và được

mã hoá bởi gen ALK trên nhiễm sắc thể 2p23, được cấu tạo chính từ 2 intronslớn và 26 exons Đây là một trong những chuỗi biến đổi gen nằm trong nhómlymphoma tế bào lớn ALK là một glycoprotein màng tế bào type I được biểuhiện thông thường chỉ trong hệ thần kinh[11].Năm 2007, Soda và CS pháthiện ra sự hoán đổi các vị trí gen tương tự protein 4 của ngoại bì phôi(echinoderm microtubule-associated protein-like 4 (EML4) và gen ALK tạo

ra gen ALK-EML4, xuất hiện trong UTPKTBN Sự tái sắp xếp gen ALK xuấthiện ở 3-7% bệnh nhân có UTPKTBN và nhiều hơn phổ biến ở những bệnhnhân có tiền sử không hút thuốc lá, mô học ung thư biểu mô tuyến, độ tuổitrẻ, giới tính ở phụ nữ và ở các khối u có EGFR và KRAS (-) [4] Sinh bệnhhọc phân tử của ALK bắt đầu từ việc sắp xếp lại nhiễm sắc thể mà kết hợp vớichuỗi mã hóa 3’ cho miền tín hiệu nội bào với các phần tử hoạt hóa 5' vàchuỗi mã hóa của các gen khác Một sự đảo ngược trong nhiễm sắc thể 2p, kếtquả là sự hình thành một sản phẩm gen hợp nhất bao gồm các thành phần genechinoderm microtubule associated protein-like 4 (EML4) và gen ALK, đãđược phát hiện vào năm 2007 ở các dòng tế bào UTPKTBN và các mẫu bệnhphẩm lưu trữ Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng sự đảo ngược EML4-ALK baogồm ít nhất 9 biến thể hợp nhất, tất cả đều chứa cùng một phần của miềnkinase ALK C-terminal, cho chúng hoạt động xúc tác Phù hợp với điều này,biểu hiện EML4-ALK trong các tế bào biểu mô phế nang phổi ở chuột chuyểngen là một yếu tố gây ung thư mạnh

Hiện nay, ALK được ghi nhận như 1 gen chính thúc đẩy ung thư trongUTPKTBN, và dù EML4 là một gen đồng hành phức hợp nổi trội, các genphức hợp với partner khác cũng được xác định[12], [13] Tỉ lệ tái sắp xếp lạigen ALK xuất hiện trong khoảng 2-7%, nghĩa là xấp xỉ 6,000 bệnh nhân cóALK dương tính/năm tại Mỹ và xấp xỉ 40,000 bệnh nhân/năm trên toàn cầu[14], [15], [16] Tuy nhiên, có những hạn chế đối với ước tính này, bao gồmmột tập dữ liệu nhỏ (1.500 mẫu khối u) và các phương pháp ALK khác nhauđược sử dụng trong các nghiên cứu Đáng chú ý là phần lớn các sự sắp xếp lạigen ALK được quan sát thấy trong nhiều mẫu tế bào ung thư phổi tế bàotuyến khi so với tế bào vảy hoặc tế bào nhỏ Cũng có những bằng chứng chothấy rằng ALK có khuynh hướng liên quan đến những bệnh nhân ít hoặckhông bao giờ hút thuốc mặc dù điều này có thể không phải là một cofactorđáng kể [14], [15], [16], [17] Quan trọng, sự sắp xếp lại gen ALK hiếm khitrùng hợp với đột biến EGFR, HER2, hoặc KRAS, chứng minh rằng ALKdương tính là một loại phân nhóm bệnh riêng biệt

Sơ đồ 1.1 Sự hình thành đột biến ALK [12].

Sơ đồ 1.1 ( tiếp) Sự hình thành đột biến ALK [12].

Bảng 1.1 Biến thể ALK trong ung thư phổi không tế bào nhỏ

(Theo Heuckmann JM, Balke-Want H, Malchers F, et al Differential protein stability and ALK inhibitor sensitivity of EML4-ALK fusion variants Clin Cancer Res 2012;18:4682–90).

E13; A20 E13; A20 (biến thể 1), E13; ins69

A20

Vị trí bào tương, protein dài hơn t 1/2 , ức chế tăng trưởng tế bào đòi hỏi nồng độ ức chế ALK mức độ vừa

33%

E6a / b;

A20 E6a / b; A20 (các biến thể 3a / b)

Vị trí bào tương và nhân, protein dài hơn t 1/2 , ức chế tăng trưởng tế bào đòi hỏi nồng độ chất ức chế ALK ở mức thấp hoặc trung bình.

9%

E14; A20 E14; ins11del49A20 (biến thể 4 '),

E14; del12A20 (biến thể 7) Không có dữ liệu 3%E18; A20 E18; A20 (biến thể 5 ') Không có dữ liệu 2% E15; A20 E15 del19; del20A20 (biến thể 4) Không có dữ liệu 2%

E 2; A20 E 2; A20 & E2; ins117A20 (biến thể

Một số điểm lưu ý:

- Phần lớn sự sắp xếp lại gen ALK được quan sát thấy ở những mẫu bệnhung thư phổi biểu mô tuyến so với mẫu mô tế bào vảy hoặc tế bào nhỏ.

- Cũng có những bằng chứng cho thấy sự sắp xếp lại gen ALK có khuynhhướng tương quan với những bệnh nhân không hoặc ít hút thuốc

- Điều quan trọng là, sự sắp xếp lại gen ALK hiếm khi xảy ra cùng với độtbiến EGFR, HER2, hoặc KRAS, chứng tỏ là ALK là một phân týp bệnh khác biệt

1.1.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

- Những nghiên cứu trong quá khứ: Thập kỷ vừa qua đã chứng kiến

một sự thay đổi lớn trong việc điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ(NSCLC) Mặc dù phân nhóm mô học rõ ràng là một yếu tố quan trọng trongviệc lựa chọn các hóa trị liệu độc tế bào tiêu chuẩn, nhưng hiện tại người tanhận ra rằng sự hiện diện của các thay đổi gây ung thư quan trọng, như kíchhoạt đột biến và sắp xếp lại nhiễm sắc thể là yếu tố quan trọng dự đoán khảnăng đáp ứng với các liệu pháp nhắm mục tiêu chọn lọc Trong UTP, mô hìnhnày lần đầu tiên được thiết lập với việc phát hiện ra các đột biến của thụ thể

yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR ) có liên quan đến sự nhạy cảm với chất ức

chế tyrosine kinase (TKI) gefitinib Gần đây, các UTPKTBN chứa chấp sự

chuyển đoạn trong anaplastic lymphoma kinase (ALK) đã chứng minh độ nhạy đáng chú ý đối với chất ức chế ALK kinase crizotinib Sự sắp xếp lại gen ALK được báo cáo lần đầu tiên trong UTPKTBN vào năm 2007 [18],[19],

những tiến bộ đáng kể trong các kết quả nghiên cứu thử nghiêm lâm sàng đãdẫn đến phê duyệt nhanh chóng gần đây cho thuốc ức chế ALK crizotinib của

Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) [20] ALK lần đầu

tiên được phát hiện cách đây hơn 17 năm dưới dạng hợp chất oncogene với

nucleophosmin ( NPM ) trong một tập hợp các tế bào u lympho tế bào lớn mất biệt hóa (ALCL) [21].NPM-ALK phát sinh từ sự chuyển đoạn liên quan đến nhiễm sắc thể 2p, chứa ALK và nhiễm sắc thể 5q, chứa NPM Các protein

tổng hợp ALK khác cũng đã được xác định trong ALCL, bao gồm

TPM3-ALK và TFG-TPM3-ALK [22],[23].TPM3-ALK được phát hiện tiếp theo khoảng 11 năm

trước trong một tập hợp các khối u nguyên bào cơ viêm (myofibroblastic IMTs) [22] Tuy nhiên, phải đến gần 5 năm sau, mối quan tâm về ALK mớităng lên sau khi một ấn phẩm quan trọng của Hiroyuki Mano và CS mô tả vềviệc phát hiện ra ALK liên kết với echinoderm microtubule-associated

-protein-like 4 (EML4)-ALK-, một sự sắp xếp lại gen soma được tìm thấy trong một tỷ lệ nhỏ bệnh nhân UTP của Nhật Bản được công bố [18] EML4-ALK

là kết quả của sự đảo ngược nhỏ trong nhiễm sắc thể 2p, hợp nhất các phần

khác nhau của gen EML4 với một phần của gen ALK EML4-ALK là phản

ứng tổng hợp ALK chiếm ưu thế trong bệnh UTP, mặc dù hiện tại đã có một

số phản ứng tổng hợp ALK khác, bao gồm KIF5B-ALK, TFG-ALK vàKLC1-ALK (hình 1.1.) [19],[24],[25] Trong hầu hết tất cả các sắp xếp

lại ALK đã biết, bao gồm EML4-ALK , điểm chuyển đoạn bộ gen trong gen ALK được bảo tồn Gen ALK kiểu hoang dã (hoặc không được sắp

xếp) mã hóa một thụ thể -receptor tyrosine kinase (RTK) đơn độc được cho là

có vai trò trong sự phát triển của hệ thần kinh [26] Ở người trưởng thành,

biểu hiện của ALK bị hạn chế ở một số tế bào thần kinh nhất định Ở cấp độ

tế bào, ALK điều chỉnh các con đường truyền tín hiệu chính thống được chia

sẻ với các RTK khác, bao gồm protein kinase hoạt hóa mitogen (MAPK),phosphoinositide 3-kinase (PI3K) và AKAK STAT Trong trường hợp sắp

xếp lại ALK, chuỗi kết thúc như NPM và EML4 được hợp nhất với miền tyrosine kinase nội bào của ALK, dẫn đến biểu hiện bất thường của các liên

kết ALK trong bào tương tế bào, dẫn đến sự tăng sinh tế bào không kiểm soátđược Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng protein tổng hợp bởi ALK lànguyên nhân gây ung thư cả in vitro và in vivo Trong báo cáo ban đầu mô

tả sự sắp xếp lại ALK trong UTPKTBN, các tế bào 3T3 của chuột được thay thế bằng một đoạn mã hóa plasmid EML4-ALK đã hình thành khối u trong

môi trường thạch nuôi cấy và khối u lớn dưới da ở chuột Ngược lại, phiênbản chết của kinase của EML4-ALK, K589M đã thất bại trong việc tạo ra cáckhối u, điều này cho thấy hoạt động kinase của EML4-ALK rất quan trọngđối với tiềm năng gây ung thư của nó [18] Trong các báo cáo tiếp theo, các

nhà nghiên cứu đã tạo ra chuột biến đổi gen biểu hiện EML4-ALK dưới sự

kiểm soát của một đoạn khởi đầu (promoter) đặc hiệu phổi Kết cục, tất cả cácđộng vật chuyển gen đã hình thành nhiều ung thư biểu mô tuyến phổi có biểuhiện protein liên kết ALK [27],[28] Điều đó đã chứng minh EML4-ALK là đủ

để gây ra khối u phổi trong cơ thể Các nghiên cứu tiền lâm sàng đã chứng minh

rằng các bệnh ung thư với chuyển đoạn ALK là yếu tố liên quan tăng trưởng và

sống thêm [29] Sự phụ thuộc này thường được gọi là phụ thuộc oncogene vàtrong hình thành phụ thuộc RTK, điều này xảy ra khi tín hiệu RAS-MAPK vàPI3K-AKT được điều khiển bởi RTK như ALK hoặc EGFR Sự ức chế RTKdẫn đến việc ngăn chặn các con đường truyền tín hiệu này, dẫn đến việc ngừngtăng trưởng tế bào và tế bào sẽ chết theo chương trình

Sơ đồ 1.2 Mô tả một số protein liên kết với ALK được xác định trong

UTPKTBN [20].

- Những nghiên cứu trong thời điểm hiện tại: Các nghiên cứu về

crizotinib giai đoạn đầu đã xác nhận ALK là mục tiêu điều trị Hầu hết các kếtquả lâm sàng với crizotinib trong nghiên cứu của Alice và CS (2013) bắt

nguồn từ những bệnh nhân bị UTP tiến triển có đột biến ALK Những bệnh

nhân này chiếm khoảng 4% tổng số bệnh nhân mắc UTPKTBN, đại diện cho

40.000 trường hợp mới trên toàn thế giới mỗi năm [20] Sắp xếp lại ALK đã

được liên kết với một số đặc điểm lâm sàng đặc biệt [30],[31] Một trongnhững điều quan trọng nhất là không có tiền sử hút thuốc Tại Bệnh viện Đakhoa Massachusetts, gần 15% bệnh nhân UTP từ bệnh nhân có tiền sử khôngbao giờ hút thuốc có ALK dương tính Trong số những bệnh nhân có tiền sửhút thuốc, chỉ có 2% dương tính với ALK Ngược lại, trong số những bệnh

nhân mắc ung thư phổi do ALK , hơn 90% là những người không bao giờ hút

thuốc hoặc hút rất ít (hút thuốc ít được định nghĩa là ≤ 10 gói/năm) Các đặc

điểm quan trọng khác liên quan đến ung thư phổi do ALK bao gồm tuổi trẻ

hơn trong chẩn đoán, tip ung thư biểu mô tuyến và không có các đột biến gây

ung thư khác.Vai trò của crizotinib trong ung thư phổi do đột biến ALK lần

đầu tiên được đánh giá trong một nghiên cứu quốc tế, đa trung tâm [32].Crizotinib ban đầu được sản xuất tại Pfizer dưới dạng phân tử nhỏ TKI nhắmmục tiêu c-MET [33].Sau đó, Crizotinib được phát hiện là tác dụng mạnh nhấtđối với c-MET nhưng cũng hoạt động chống lại một số RTK khác bao gồmALK và ROS1 Một cách ngẫu nhiên, phần tăng liều trong giai đoạn nghiêncứu về crizotinib đã được tiến hành ở bệnh nhân UTP có đột biến EML4-ALK và đã được báo cáo lần đầu tiên Trong vòng vài tháng, phương pháp laitại chỗ (FISH) đã được phát triển và ngay sau đó, hai bệnh nhân đầu tiên

bị UTP do ALK đã được ghi danh vào việc tăng liều Cả hai bệnh nhân đều có

một sự cải thiện đáng kể về các triệu chứng liên quan đến bệnh Tiếp theo

nhiều bệnh nhân khác bị UTP do ALK sau đó đã được ghi danh vào một

nghiên cứu mở rộng liều với liều dung nạp tối đa [32] Trong số 143 bệnhnhân được đánh giá, tỷ lệ đáp ứng khách quan (ORR) là 60,8% Thời gian đápứng trung bình là 49,1 tuần và thời gian sống thêm không tiến triển trung bình(PFS) là 9,7 tháng [34] trong khi những bệnh nhân được sử dụng phác đồ hóachất tiêu chuẩn đơn thuần thì tỷ lệ đáp ứng khách quan chỉ <10% và PFStrung bình từ 2 đến 3 tháng [35],[36].Nhiều nghiên cứu thử nghiệm lâm sàngcho thấy hiệu quả điều trị của crizotinib có thời gian đáp ứng khách quantrung bình là 59,8% và PFS trung vị là 8,1 tháng [37] Trong các nghiên cứucho thấy crizotinib được dung nạp tốt, các tác dụng không mong muốn là nhẹ,chủ yếu là độ 1, bao gồm rối loạn thị giác, buồn nôn/nôn, tiêu chảy, táo bón,mệt mỏi và phù ngoại biên Trên cơ sở tỷ lệ đáp ứng được thể hiện trong cácnghiên cứu pha I và II, cùng với tính an toàn của nó, crizotinib đã được FDAchấp thuận vào tháng 8 /2012, 4 năm sau báo cáo đầu tiên về vai trò của sắp

xếp lại gen ALK trong ung thư phổi [30].

- Tương lai: Mặc dù crizotinib có hoạt tính chống ung thư rõ rệt nhưng

các bệnh ung thư do xắp xếp lại ALK luôn luôn trở nên kháng với

crizotinib Trong trường hợp UTP do ALK , cũng như UTP đột biến EGFR ,

thời gian hình thành kháng thuốc xuất hiện trung bình trong vòng một hoặchai năm đầu của liệu pháp TKI và đó là những thách thức cấp bách nhất tronglĩnh vực trị liệu nhắm mục tiêu

Biểu đồ 1.1 Tỷ lệ kháng thuốc điều trị nhắm trúng đích của bệnh nhân

UTP [20].

(Dấu hỏi là chưa biết rõ cơ chế kháng thuốc/dấu * là bệnh nhân có nhiều hơn 1 cơ chế kháng thuốc)

Điều này thúc đẩy nghiên cứu các chất ức chế ALK thế hệ tiếp theo cócấu trúc khác biệt với crizotinib, nói chung mạnh hơn crizotinib và hiện đangđược thử nghiệm để khắc phục tình trạng kháng crizotinib Cho đến nay, ítnhất bốn chất ức chế ALK mới hiện đang được nghiên cứu, bao gồm LDK378(Novartis, Thụy Sĩ), AP26113 (ARIAD, Cambridge, MA), AF802 (Chugai,Nhật Bản) và ASP3026 (Astellas Pharma, Nhật Bản) [20].Các thử nghiệmlâm sàng về các thuốc ức chế ALK thế hệ tiếp theo cũng như các liệu phápnhắm mục tiêu ALK khác là bước đầu tiên trong việc khắc phục tình trạngkháng crizotinib, nhưng liệu pháp tác nhân đơn lẻ không có khả năng làmthay đổi tiến trình bệnh cho phần lớn bệnh nhân bị tái phát với crizotinib Một

số nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhiều cơ chế kháng thuốc có thể hoạt động ở mộtbệnh nhân và đó là những thách thức thực sự trong điều trị UTP do ALK

1.1.3 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Tại Việt nam hiện xét nghiệm về ALK bằng HMMD đang bắt đầu đượctriển khai trên các bệnh viện đầu ngành Bước đầu có những nghiên cứu vềALK nhưng về công bố số liệu chưa có

1.2 Một số phương pháp xác định đột biến gen ALK

Kể từ khi giới thiệu trị liệu UTP bằng crizotinib, xét nghiệm đột biếnALK được khuyến nghị cho tất cả các UTPKTBN [38] Có một số phươngpháp kiểm tra đột biến phân tử ALK; phổ biến nhất là nhuộm hóa mô miễndịch (HMMD), lai tại chỗ gắn huỳnh quang (FISH) và kỹ thuật dựa trên phảnứng chuỗi polymerase (PCR)

1.2.1 Xét nghiệm lai tại chỗ gắn huỳnh quang (FISH)

Kỹ thuật FISH được coi là Tiêu chuẩn Vàng cho thử nghiệm đột biến

ALK của các UTPKTBN Năm 2011, FDA đã phê duyệt bộ kit xét nghiệmFISH cho chẩn đoán đột biến ALK của Abbot Vysis ALK Break Apart [39],[40] Đối với quy trình Vysis ALK, mô không nhuộm được lai qua đêm vớiđầu dò ALK và được đánh giá bằng kính hiển vi huỳnh quang [39],[41] Xácđịnh một sự chuyển vị ALK có mặt khi đầu dò ALK cho thấy các điểm phátquang- fluorophores màu đỏ và màu xanh lá cây tách biệt hoặc mất tín hiệumàu xanh lá cây trong 15% hoặc nhiều hơn các tế bào được kiểmtra Fluorophore màu xanh lá cây liên kết vùng 5 'với ALK, trong khi màu đỏliên kết với vùng mã hóa 3' ALK kinase [39],[40] Phân tích FISH cho cácchuyển đoạn EML4-ALK có thể khó khăn vì: 1) Nó có chi phí cao, 2) Việcgiải thích chính xác đòi hỏi phải có chuyên môn và kinh nghiệm, 3) Nó khôngxác định các loại chuyển đoạn cụ thể và 4) Thường cần thời gian dài [39],[41],[42] Ưu điểm của FISH là nó sẽ phát hiện tất cả các sắp xếp lại ALK bất

kể phần liên kết, đạt độ chính xác và đáng tin cậy cao

Yêu cầu kỹ thuật giải phẫu bệnh cho kỹ thuật nhuộm FISH chẩn đoánALK

Thời gian tới khi bệnh phẩm được cố định Ngắn nhất có thể, không vượt quá 1 giờ

Sự chuẩn bị mẫu Các lát cắt từ khối nến, độ dày 5±1 µmLưu trữ mẫu Mô vùi trong nến (lý tưởng nhất)

Thời gian lưu trữ các nến Trong thời lượng thích hợp

Điều kiện lưu trữ nến Tránh ánh sáng, nhiệt độ cao, độ ẩm

Thời gian lưu trữ các lát cắt 4-6 tuần, các tiêu bản cũ hơn tùy chỉnh

Hình 1.1 Hình ảnh bộc lộ ALK bằng kỹ thuật lai tại chỗ gắn huỳnh quang

[26].

1.2.2 Nhuộm hóa mô miễn dịch

Hóa mô miễn dịch dễ dàng xác định ALK trong u lympho tế bào lớnmất biệt hóa [43],[44] Tuy nhiên, mức protein ALK trong các UTPKTBN cóxắp xếp lại gen ALK là tương đối thấp, khiến các phương pháp phát hiệnALK bằng HMMD được sử dụng như cho u lympho tế bào lớn mất biệt hóa làkhông đầy đủ [45] Ngoài ra, hiện tại không có quy trình chuẩn nhuộmHMMD để phát hiện ALK trong NSCLC [46] Các kháng thể được sử dụngtrong nhuộm HMMD đã đạt được thành công là D5F3 (Cell SignalingTechnology, Danvers, MA, USA), 5A4 (Novocastra, Newcastle, UK) và ALKđơn dòng ZAL4 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)[47],[48] Thunnissen và CS[49] chỉ ra rằng những thách thức hiện tại trong việc phát triển HMMD đểphát hiện ALK trong UTPKTBN là: 1) Việc chuẩn bị mô, 2) Việc lựa chọnkháng thể, 3) Hệ thống tăng cường tín hiệu và 4) Hệ thống tính điểm tối

ưu Những ưu điểm chính của HMMD là: 1) Chi phí thấp, 2) Dễ thực hiện, 3)

Dễ giải thích bởi nhà nghiên cứu bệnh học nói chung, 4) Có khả năng lưu giữthông tin mô học và 5) Thời gian có kết quả ngắn Hiện tại ứng dụng lâm sàng

nhuộm HMMD phát hiện ALK trong NSCLC vẫn cần yêu cầu phân tích vàxác nhận thêm[41],[42],[46],[50].

Bảng 1.2: Các tiêu chí tính điểm để xác định tình trạng của ALK trong NSCLC

Dương

tính với

ALK

Có sự hiện diện của bắt màu mạnh hạt tế bào chất trong các tế bào

u (bất kỳ tỷ lệ phần trăm của các tế bào khối u dương tính) Một

số yếu tố nhuộm cần được loại trừ, bao gồm:

- Các chấm nhạt tế bào chất trong các đại bào phế nang,

- Tế bào có nguồn gốc thần kinh (tế bào thần kinh và hạch), biểu

mô tuyến, tế bào lympho rải rác trong các phần thâm nhiễm tếbào lympho

- Nhuộm nền (bao gồm chất nhầy và trong các khu vực khối uhoại tử)

Âm tính

với ALK

Không hiện diện bắt màu mạnh tế bào chất trong các tế bào bướu

Âm tính -Không bắt màu Âm tính khi bắt màu khuếch tán không đặc hiệu

Dương tính khi một số tế bào

u bắt mầu mạnh ở bào tương

Dương tính khi tất cả tế bào u bắt mầu mạnh ở bào tương

Hình 1.2 Tiêu chuẩn đánh giá sự bộc lộ ALK bằng nhuộm HMMD [42].

Quy trình phân tích mẫu mô và phân tích kết quả xét nghiệm

1.2.3 Kỹ thuật PCR

Các kỹ thuật dựa trên PCR có thể phát hiện biểu hiện ALK trongNSCLC với các phương pháp bao gồm PCR ghép đa phiên mã ngược và phântích biểu hiện tương đối của các phần 5 'và 3' của bản sao gen ALK bằng RT-PCR [41],[42]

a PCR sao chép ngược (RT-PRC)

RT-PCR là một kỹ thuật chính xác, độ nhạy cao và có thể tái tạo, có thểphát hiện các bản sao hợp nhất EML4-ALK Ngoài ra, các bộ khuếch đại cóthể được giải trình tự để xác định các biến thể hợp nhất cụ thể [41],[42].Trongsản phẩm này, RNA được chuyển đổi thành cDNA bằng cách sao chép ngược

và cDNA được khuếch đại PCR với các đoạn mồi cụ thể Kỹ thuật khuếch đạiyêu cầu các bộ mồi cụ thể cho từng chuyển vị [41],[42],[51].Các bộ kitthương mại có sẵn thường có các đoạn mồi cho hầu hết hoặc tất cả các bảnsao hợp nhất EML4-ALK[51],[52],[53] Các bộ khuếch đại được xác địnhbằng nhiều phương pháp, bao gồm giải trình tự, suy giảm đầu dò huỳnhquang, điện di và công nghệ chụp NanoString nCount [39],[42],[51],[54]

b Khuếch đại nhanh 5'- của cDNA đầu cuối (RACE)

Tất cả các protein tổng hợp EML4-ALK đều mang miền tyrosinekinase được mã hóa bởi exon 20 và theo sau 3'exon [55] Wang và CS [56] đã

sử dụng phân tích RACE để định lượng mức mRNA tương đối 5 'và 3' ALKtrong các NSCLC mRNA EML4-ALK được sao chép ngược thành cDNA vàcác phần khác nhau của cDNA được khuếch đại với các bộ mồi đặc trưng chocác exon giữa E13-E18 và E22-E27 Các miền E22-E27 tăng 22,6% (40/177)trong các NSCLC, mức tăng dao động từ 32,2 đến 1573,7 lần khi được chuẩnhóa thành mRNA 5’ ALK Ưu điểm của phân tích PCR ALK trong NSCLC:1) Đặc hiệu và độ nhạy cao 2) Có thể phát hiện bản phiên mã EML4-ALKđược pha loãng trong hơn 90% RNA loại hoang dại và 3) Ít tốn kém hơn