Bài viết đánh giá mức độ phổ biến của bệnh vi rút trên thanh long ở một số vùng trồng thanh long và xác định vi rút gây bệnh thanh long dựa trên cây chỉ thị, kỹ thuật RT-PCR và giải trình tự gene.
Kết nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2019 TÀI LIỆU THAM KHẢO Ngô Vĩnh Viễn, 2007 Báo cáo dịch hại hồ tiêu biện pháp phòng trừ Hội thảo sâu bệnh hại tiêu biện pháp phòng trừ Đắc Nơng, tháng năm 2007: 1-8 Hồng Quốc Khánh, Nguyễn Bích Ngọc, 2013 Ứng dụng kỹ thuật metagenomics để nhận diện gene mã hóa laccase nấm Basidiomycetes mẫu đất rừng Nam Cát Tiên Tạp chí phát triển KH&CN, Tập 16, Số T3: 60-74 G I Robertson, 1980 The genus Pythium in New Zealand New Zealand Journal of Botany 18:1, 73-102, ISSN: 0028-825X Randy C Ploetz, 2004 Influence of temperature on Pythium splendens – induced root disease on carambola, Averrhoa carambola Mycopathologia 157: 225–231 Gallegly, M E and Hong, C 2008 Phytophthora – identifying species by morphology and DNA fingerprints St Paul, MN, USA: APS Press 158 p Caporaso JG, et al, 2010 QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data Nat Methods, 10.1038/nmeth.f.303 Magoč, Tanja, and Steven L Salzberg, 2011 FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies Bioinformatics 27.21: 2957-2963 Zhuofei Xu, Martin Asser Hansen, Lars H Hansen, Samuel Jacquiod, Søren J Sørensen, 2014 Bioinformatic Approaches Reveal Metagenomic Characterization of Soil Microbial Community PLoS ONE 9(4): e93445 Edgar, Robert C, 2013 UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads Nature methods 10.10: 996-998 10 Quast C, Pruesse E, Yilmaz P, Gerken J, Schweer T, Yarza P, Peplies J, Glöckner FO, 2013 The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools Nucl Acids Res.: D59011 D596.Luis E Castañeda and Olga Barbosa, 2017 Metagenomic analysis exploring taxonomic and functional diversity of soil microbial communities in Chilean vineyards and surrounding native forests PeerJ 5:e3098 Phản biện: TS Đặng Vũ Thị Thanh PHÁT HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH Cactus virus X (CVX) NHIỄM TRÊN CÂY THANH LONG Ở VIỆT NAM Detection and Identification of Cactus virus X (CVX) Infecting Hylocereus undulatus in Viet Nam Nguyễn Đức Huy *, Nguyễn Hồng Sơn , Nguyễn Thị Bích Ngọc Nguyễn Thành Hiếu Ngày nhận bài: 13.6.2018 Ngày chấp nhận: 02.3.2019 Abstract Hylocereus undulatus, commonly known as pitaya, is widely grown in Viet Nam but most in Binh Thuan province At present, there is no report of virus infecting H undulatus in Viet Nam During field surveys of 2016-2018, five stem samples of H undulatus showing systemic mild and severe mottling symptom were collected from Binh Thuan, Quang Ninh, Bac Giang and Ha Noi The infected samples were then mechanically inoculated by sap extraction onto leaves of indicator plants and caused necrotic local lesions on both Gomphrena globose and Chenopodium quinoa Furthermore, total RNAs was extracted from infected stem of H undulatus and amplified by RT-PCR using universal primers for detecting potexviruses Sequencing of RT-PCR 1.Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học, Học viện Nông products revealed that the virus was Cactus virus X nghiệp Việt Nam (CVX) To our knowledge, this is first report of CVX in Cục Trồng trọt, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn Viet Nam Viện Bảo vệ thực vật, Viện Khoa học Nông nghiệp Keywords: Hylocereus undulatus, mild and severe Việt Nam mottling, RT-PCR, Cactus virus X, Viet Nam Viện nghiên cứu ăn Miền Nam 37 Kết nghiên cứu Khoa học ĐẶT VẤN ĐỀ Cây long (Hylocereus undulatus) thuộc họ xương rồng (Cactaceae) có nguồn gốc vùng sa mạc thuộc Mehico Colombia Thanh long trồng phổ biến nước Đông Nam Á Thái Lan, Philippines, Indonesia, Đài Loan, miền Nam Trung Quốc (Quảng Tây) Ở Việt Nam, long trồng nhiều Bình Thuận số tỉnh Tiền Giang, Long An, Kiên Giang Hiện nay, long c ng trồng nhiều tỉnh miền Bắc Ba Vì (Hà Nội), Quảng Ninh, Hòa Bình, Cao Bằng, v.v Cây long thích hợp trồng nhiều loại đất, long có nhiều chất dinh dưỡng có giá trị xuất cao nên long long ăn quan trọng đem lại hiệu kinh tế cho nhiều nước giới Đài Loan, Thái Lan, Malaysia, Trung Quốc Việt Nam Tuy nhiên, suất long không ổn định số bệnh xuất gây hại nặng bệnh đốm nâu (Neoscytalidium dimidiatum), bệnh đốm nâu gây hại nghiêm trọng có xu hướng ngày lan rộng năm gần (2013-2018) Theo ghi nhận Viện nghiên cứu ăn miền Nam, bệnh đốm nâu xuất vào đầu năm 2008 Bình Thuận Tiền Giang Từ năm 2011 trở lại đây, bệnh gây hại nặng lây lan diện rộng Có vườn long bị trắng, thu hoạch bị nhiễm bệnh, gây thiệt hại lớn cho người trồng long Bên cạnh đó, bệnh thối nh n cành, vi khuẩn c ng bệnh vi rút gây hại long Việt Nam chưa xác định tác nhân gây bệnh c ng phòng trừ bệnh hiệu Xác định tác nhân gây bệnh thối cành vi khuẩn đốm cành vi rút s góp phần quan trọng vào việc phòng trừ bệnh hại cơng tác kiểm dịch thực vật bệnh hại long Bệnh vi rút gây hại long xác định Cactus virus X (CVX) CVX phát nghiên cứu lần Đài Loan (Liou et al., 2001) CVX thuộc chi Potexvirus, họ Alphaflexiviridae CVX truyền qua tiếp xúc học Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo 38 BVTV – Số 1/2019 thị cho thấy CVX gây vết chết hoại cục vết đốm vàng rau muối (Chenopodium amaranticolor C quinoa) cúc bách nhật (Gomphrena globose) (Liou et al., 2001; Kim et al., 2016) Hiện nay, có chuỗi gene đầy đủ (6.614 bp) CVX công bố ngân hàng gene (Liou et al., 2004) CVX c ng nghiên cứu long Brazil vào năm 2008 (Duarte et al., 2008) Tính đến thời điểm nay, chưa có cơng bố tạp chí chuyên ngành nước c ng quốc tế xác định c ng nghiên cứu mức độ phổ biến gây hại CVX Việt Nam Nghiên cứu nhằm i) đánh giá mức độ phổ biến bệnh vi rút long số vùng trồng long ii) xác định vi rút gây bệnh long dựa thị, kỹ thuật RT-PCR giải trình tự gene VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mẫu bệnh Mẫu cành long có triệu chứng điển đốm vàng khảm mức độ nhẹ nặng thu thập trì cách trồng lại chậu giữ nhà lưới để theo d i tiếp phát triển bệnh Trong nghiên cứu này, 05 mẫu cành long có triệu chứng giống vi rút (đốm vàng, khảm) thu thập Bình Thuận (Hàm Thuận Nam, Hàm Thuận Bắc), Quảng Ninh, Bắc Giang Hà Nội (bảng 1) 2.2 Xác định có mặt vi rút thị Sự có mặt vi rút mẫu bệnh thu thập xác định phương pháp thị Theo đó, dịch chiết từ cành long bị nhiễm bệnh dung dịch đệm photphatase pH 7.0 lây nhiễm tiếp xúc học lên thị Chenopodium quinoa Gomphrena globose Bột Carborundum (600 mesh) sử dụng để tạo vết thương học thị trước lây Các thị sau lây nhiễm đặt nhà lưới nhiệt độ o khoảng 25-27 C Triệu chứng theo d i sau 10, 20 30 ngày Kết nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2019 2.3 Xác định vi rút RT-PCR giải trình tự 2.4 Đánh giá truyền bệnh qua nhân giống vơ tính RNA tổng số vi rút chiết từ mẫu nhiễm bệnh CTAB theo phương pháp Doyle Doyle (1990) Phản ứng RT-PCR thực với M-MLV và DreamTaq sử dụng cặp mồi chung để phát potexvirus gồm potex (CAY CAR CAR GCX AAR GAY SA) potex (TCD GTR TTD GCR TCR AAD GT) (Duarte et al., 2008) Sản phẩm PCR tinh chiết từ 0,7% agarose gel dùng kít tinh chiết thương mại theo hướng dẫn nhà sản xuất Hàm lượng DNA ước lượng nồng độ điện di agarose Sản phẩm PCR giải trình tự trực tiếp chiều dùng mồi potex (CAY CAR CAR GCX AAR GAY SA) hãng Macrogen Hàn Quốc Trình tự nucleotide so sánh với sở liệu Genbank phần mềm tuyến BLAST NCBI (the National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) Tiếp theo, phả hệ mối quan hệ chuỗi nucleotide xây dựng phương pháp Neighbor-Joining (Saitou Nei, 1987) sẵn có phần mềm MEGA 7.0 (Kumar et al., 2016) Trong nghiên cứu này, 30 mẫu cành long bị nhiễm vi rút thu thập Ba Vì - Hà Nội, Bắc Giang Quảng Ninh trồng trì chậu, cành/chậu chăm sóc nhà o lưới với nhiệt độ 25-28 C thời gian tháng để theo d i nhiễm bệnh mầm/cành mọc KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Mức độ thu thập mẫu bệnh virus gây hại long Trong lần điều tra đồng ruộng mức độ thu mẫu bệnh vi rút long ruột đỏ ruột trắng Bình Thuận, long ruột đỏ Ba Vì – Hà Nội, Bắc Giang Quảng Ninh có triệu chứng nhiễm vi rút Triệu chứng điển hình đốm vàng (hình 1b), đơi dạng vòng (hình 1a) khảm (hình 1c), toàn bị nhiễm với triệu chứng từ nhẹ (systemic mild mottling) đến nặng (systemic severe mottling) với tỷ lệ bệnh 8-10% Bình Thuận, 15-20% Quảng Ninh Bắc Giang, 51-55% Ba Vì – Hà Nội (bảng 1, hình 1) Trên giới, ghi nhận Cactus virus X (CVX) gây hại long Bảng Mức độ triệu chứng bệnh vi rút long Thời Địa điểm thu thập Giống gian thu thập Hàm Thuận Nam- Bộ phận bị bệnh ruột đỏ, trắng 2016 cành ruột đỏ, trắng 2016 cành ruột đỏ 2017 cành Bắc Giang ruột đỏ 2017 cành Ba Vì – Hà Nội ruột đỏ 2018 cành Bình Thuận Hàm Thuận Bắc – Bình Thuận Quảng YênQuảng Ninh Triệu chứng đốm biến vàng nhẹ đốm biến vàng r đốm biến vàng r đốm vàng, khảm nhẹ đốm biến vàng nhẹ Mức độ phổ biến + + ++ ++ +++ Ghi chú: +: Tỷ lệ bệnh ≤10%; ++: Tỷ lệ bệnh 11 - ≤25%; +++: Tỷ lệ bệnh 25 - < 50% 39 Kết nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2019 a) b) c) Hình Triệu chứng bệnh vi rút long ruột đỏ a-b) Triệu chứng đốm vàng điển hình (systemic severe mottling) Bình Thuận Quảng Ninh c) Triệu chứng đốm vàng/ hảm nhẹ (systemic mild mottling) Ba Vì – Hà Nội Tuy nhiên, đến chưa có đánh giá ảnh hưởng bệnh vi rút tới suất trồng long Quan sát triệu chứng đồng ruộng ghi nhận đa số có triệu chứng bị nhiễm vi rút long c ng bình thường giống khơng có triệu chứng Tuy nhiên, có triệu chứng nặng cho nhỏ Đặc biệt, long nhiễm bệnh vi rút, tỷ lệ nhiễm bệnh đốm nâu (Neoscytalidium dimidiatum) giảm r rệt so với khơng có triệu chứng vi rút 3.2 Kiểm tra xuất vi rút mẫu bệnh thị Triệu chứng vi rút gây nhầm lẫn với triệu chứng sinh lý côn trùng gây hại Tuy nhiên, lây nhiễm mẫu bệnh lên thị rau muối (Chenopodium quinoa, C amaranticolor), cúc bách nhật (Gomphrena globose) thuốc cảnh (Nicotiana benthamiana) mẫu nhiễm vi rút có biểu triệu chứng vết đốm chết hoại, đốm màu vàng rau muối triệu chứng khảm thuốc cảnh Ngược lại, triệu chứng sinh lý côn trùng gây hại giống với vi rút s khơng có triệu chứng lây thị Vì vậy, mẫu long có triệu chứng giống vi rút thu thập nghiên cứu bước đầu kiểm tra xuất vi rút lây nhiễm lên thị rau muối (C quinoa) cúc bách nhật (G globose) (bảng 2) Bảng Kết iểm tra mẫu long nhiễm vi rút thị Triệu chứng thị Ngày sau lây Cây rau muối (Chenopodium quinoa) Cây cúc bách nhật (Gomphrena globosa) - - 10 Các vết đốm vàng mờ - 15 Các vết đốm vàng mờ Đốm chết hoại có viền đỏ, r 20 Các vết đốm vàng r Đốm chết hoại có viền đỏ, r Ghi chú: - (chưa xuất triệu chứng 40 Kết nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2019 a) b) Hình Lây bệnh nhân tạo mẫu long nhiễm bệnh vi rút thu thập Bình Thuận lên rau muối với biểu triệu chứng đốm vàng (a) đốm chết hoại có quầng màu đỏ cúc bách nhật (b) Lây nhiễm nhân tạo mẫu long nhiễm vi rút lên rau muối cúc bách nhật cho triệu chứng đốm vàng đốm chết hoại giống nghiên cứu công bố vi rút gây (Liou, 2001; 2004; Kim et al, 2016) Kết minh chứng mẫu cành long thu thập vi rút 3.4 Phát xác định vi rút RTPCR giải trình tự gene Với kết thí nghiệm khẳng định có mặt vi rút mẫu long, dựa kết công bố triệu chứng c ng xác định vi rút gây bệnh long nghiên cứu trước (Liou, 2001; 2004; Kim et al, 2016) c ng giống triệu chứng từ mẫu long thu thập Trong phạm vi nghiên cứu này, tập trung xác định potexvirus kỹ thuật RT-PCR giải trình tự gene cặp mồi chung potex1 potex2 Sản phẩm RT-PCR thu có kích thước khoảng 700 bp Trình tự nucleotide thu khoảng 650 bp đọc r nét, chất lượng tốt, không nhiễu Kết tìm kiếm chuỗi gần Genebank xác định Cactus virus X (CVX) với % đoạn so sánh 100% mức đồng trình tự 96-97% (bảng 3) Bảng Kết tìm iếm chuỗi gẫn gũi ngân hàng gene (GeneBan ) mẫu vi rút long Việt Nam Mã trình tự Lồi xác định Quốc gia % đoạn so Mẫu đồng sánh trình tự (%) KX883791 Cactus virus X Trung Quốc 100 97,0 JF937699 Cactus virus X Đài Loan 100 96,0 AJ270895 Cactus virus X Hà Lan 77,0 95,0 AY727533 Caladium virus X Braxin 7,0 90,0 Dựa vào kết tìm kiếm chuỗi ngân hàng gene, từ xây dựng phả hệ với mẫu CVX (Trung Quốc, Hà Lan Đài Loan) sẵn có Genebank, mẫu đối chứng (outgroup) sử dụng Caladium virus X (hình 3) Căn vào kết nghiên cứu cơng bố tạp chí nước quốc tế, CVX vi rút xác nhận lần nhiễm long Việt Nam 41 Kết nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2019 KX883791-Cactus virus X -China 54 Cactus virus X-Viet Nam (Bình Thuận) AJ270985-Cactus virus X-Nertherlands JF937699-Cactus virus X-Taiwan Outgroup (AY727533-Caladium virus X) 0.1 Hình Cây phả hệ đƣ c xây dựng phƣơng pháp Neighbor-Joining MEGA 7.0 Giá trị nốt phả hệ giá trị thống ê bootstrap dƣới dạng % (1000 lần lặp) Thanh bar (0.1) thể hoảng cách di truyền 3.3 Đánh giá lan truyền bệnh qua nhân giống vô tính Cactus virus X Vi rút thực vật nói chung lan truyền qua đường tiếp xúc học, gặp tự nhiên, chủ yếu lan truyền qua côn trùng môi giới rầy, rệp qua nhân giống vơ tính Thanh long trồng nhân giống vơ tính chủ yếu, nên nhân giống khơng kiểm sốt mẹ nhiễm bệnh s làm gia tăng bệnh sản xuất Theo trang Plant Virus Online (http:// sdb.im.ac.cn/vide/descr132.htm), CVX truyền qua tiếp xúc học, ghép tiếp xúc trồng Trong nghiên cứu này, 30 mẫu bị nhiễm CVX trồng chậu theo d i thời gian tháng (bảng 4) Bảng Đánh giá truyền Cactus virus X qua nhân giống vơ tính Thời gian Số cành nhiễm bệnh Số chồi mọc sau trồng trồng nhiễm vi rút 15 30 n 30 30 - 45 30 25 đốm vàng mờ 60 30 27 đốm vàng r 75 30 27 đốm vàng r 90 30 27 đốm vàng r Triệu chứng Ghi chú: n (chưa mọc cành , - cành nhú 5cm chưa quan sát thấy triệu chứng vi rút 42 Kết nghiên cứu Khoa học a) BVTV – Số 1/2019 b) Hình Duy trì cành long nhiễm Cactus virus X chậu để theo dõi truyền bệnh virus (a) triệu chứng đốm biến vàng ban đầu cành long (b) Kết theo d i cho thấy, hình thành chồi non từ đoạn thân làm giống, chồi non chưa biểu triệu chứng sau 30 ngày trồng Triệu chứng bắt đầu xuất chồi sau 45 ngày r sau 60 ngày trồng, triệu chứng điển hình thí nghiệm giống với triệu chứng đồng ruộng Tỷ lệ chồi nhiễm bệnh cao (27/30 cành bị nhiễm bệnh) Như vậy, sản xuất nhân giống vơ tính long giâm cành cần quản lý mẹ nghiêm ngặt, phải bệnh phải kiểm tra trước dùng để nhân giống KẾT LUẬN Triệu chứng khảm cành long xác định Cactus virus X (CVX) thuộc chi Potexvirus Lần phát hiện, xác định ghi nhận vi rút Việt Nam CVX nhiễm thị rau muối (Chenopodium quinoa) cúc bách nhật (Gomphrena globosa) Phát góp phần vào kiểm sốt bệnh vi rút hại long qua đường nhân giống vơ tính Lời cảm ơn Nghiên cứu hỗ trợ đề tài “Nghiên cứu phòng chống bệnh đốm nâu số bệnh hại khác long thuộc đề tài nghiên cứu khoa học cấp giai đoạn 2015-2017 TÀI LIỆU THAM KHẢO Doyle J.J and Doyle J.L, 1990 A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochem Bull., 19: pp 11–15 Duarte L.M.L., Alexandre M.A.V., Rivas E.B., Harakava R., Galleti S.R and Barradas M.M, 2008 Potexvirus diversity in Cactaceae from Sao Paulo State in Brazil Journal of Plant Pathology 90: pp 545-551 Kim J.S., Park C.Y., Nam M., Kim H.G and Lee S.H, 2016 First Report of Cactus virus X Infecting Hylocereus undatus in Korea Plant Disease, 100 (12): p 2544 Kumar S., Stecher G., and Tamura K, 2016 MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets Molecular Biology and Evolution 33: pp.1870-1874 Lin W., Liao F., Chen X, 2015 Isolation and identification of the pathogen causing soft rot 43 ... CVX vi rút x c nhận lần nhiễm long Việt Nam 41 Kết nghiên cứu Khoa học BVTV – Số 1/2019 KX883791 -Cactus virus X -China 54 Cactus virus X- Viet Nam (Bình Thuận) AJ270985 -Cactus virus X- Nertherlands... x c định Cactus virus X (CVX) với % đoạn so sánh 100% mức đồng trình tự 96-97% (bảng 3) Bảng Kết tìm iếm chuỗi gẫn gũi ngân hàng gene (GeneBan ) mẫu vi rút long Việt Nam Mã trình tự Lồi x c định. .. trình tự (%) KX883791 Cactus virus X Trung Quốc 100 97,0 JF937699 Cactus virus X Đài Loan 100 96,0 AJ270895 Cactus virus X Hà Lan 77,0 95,0 AY727533 Caladium virus X Braxin 7,0 90,0 Dựa vào kết tìm