phát hiện và xác định lebsiella pneumoniae MANG GEN BLAKPCKHANG CARBAPENEM

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN VŨ DIỆU THU PHAT HIỆN VA XAC ĐỊNH Klebsiella pneumoniae MANG GEN BLAKPC KHANG CARBAPENEM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - năm 2011 LỜI CÁM ƠN Tôi xin dành lời cám ơn chân thành gửi đến tất người bên cạnh tôi, giúp có thành công ngày hôm Lời đầu tiên, xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS.BS Phạm Hùng Vân, người thầy trực tiếp hướng dẫn khoa học, truyền đạt cho kiến thức bổ ích kinh nghiệm quý báu Thầy động viên tạo điều kiện tốt cho hoàn thành khóa luận Cũng lời tri ân này, xin gửi tới thầy cô trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên - người trang bị cho tảng kiến thức vững để tự tin bước vào đường nghiên cứu Tôi có may mắn đề nằm luận án tiến sĩ Th.S Trần Nhật Phương nên nhận nhiều hỗ trợ từ Anh Cám ơn Anh cung cấp cho chủng để tiến hành thí nghiệm theo sát bước tôi, cho góp ý chân thành, giúp đề tài đuợc hoàn thiện thời gian sớm Xin gửi lời cảm ơn đến anh chị, bạn bè công ty Nam Khoa nhiệt tình giúp đỡ tạo môi trường làm việc thân thiện giúp có động lực làm việc tốt Cảm ơn nhiều người bạn sát cánh, dõi theo tôi, người chia sẻ buồn vui năm tháng học, người mà thiếu họ khó lòng hoàn thành luận văn cách trọn vẹn Và cuối cùng, từ tận đáy lòng, biết ơn bố mẹ dành cho đời Gia đình điểm tựa vững cho lúc khó khăn nhất, giúp có thêm động lực, niềm tin vào làm, giúp nên người trưởng thành ngày hôm Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng năm 2011 Vũ Diệu Thu Trang DANH MUC CHÜ VIET TAT Trang ASTS Antibiotics Sensitivity Testing Surveillance CLSI Clinical and Laboratory Standards Insitute dNTP deoxyribonucleotide triphosphate ESBL Expanded Spectrum Beta-lactamase FDA Food and Drug Administration ICARE Intensive Care Antimicrobial Resisstance Epidemiology K pneumoniae Klebsiella pneumoniae KIA Kligler Iron Agar KPC Klebsiella pneumonia Carbapenemase MC agar Mac Conkey agar MH Mueller Hinton MHA Mueller Hinton Agar MIC Minium Inhibitory Concentration NCBI National Center for Borotechnology Information ONPG o-nitrophenyl-D-galactopyranoside PBP penicillin-binding protein PCR Polymerase Chain Reaction TBE Tris/Borate/EDTA DANH MỤC BANG Trang DANH MỤC HÌNH Hình 3.11 Kết tra cứu trình tự tương đồng với chủng K pneumoniae ATCC ® 1705 dùng thí nghiệm công cụ BLAST NCBI .75 Hình 3.12 Tìm vị trí cắt giới hạn trình tự gen blaKPC phần mềm Primer premier 5.0 77 Trang MỤC LỤC PHỤ LỤC Phu lục 1: Kết định danh IDS 14 ® GNR Phu lục 2: Kết giải trình tự gen 16S rRNA Phu lục 3: Hình ảnh kháng sinh đồ 21 chủng thí nghiệm Phu lục 4: Kết giải trình tự gen blaKPC chủng thí nghiệm Trang ĐẶT VẤN ĐỀ Trong chiến tranh người vi khuẩn, kháng sinh trợ thủ đắc lực cho người Thuốc kháng sinh không ngừng cải biến chất lượng phổ tác dụng nhằm tăng cường hiệu điều trị Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh rộng rãi dẫn tới gia tăng chủng vi khuẩn đa kháng thuốc với nhiều chế khác nhau, đáng ý chế sản xuất men ESBL (extended spectrum beta-lactamase) có khả thủy phân hệ kháng sinh cephalosporin hầu hết loại beta-lactam Đối với trường hợp này, kháng sinh carbapenem xem phương án cuối Vũ khí carbapenem có nguy trở nên vô hiệu xuất vi khuẩn có khả tiết men carbapenemase, đáng lo ngại men KPC (Klebsiella pneumoniae Carbapenemase) phát chủ yếu Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae biết đến tác nhân phổ biến trường hợp viêm phổi bệnh viện nhiều bệnh nhiễm trùng nguy hiểm khác Chủng có khả tích lũy lan truyền tính kháng cao Gần đây, vi khuẩn Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem bùng phát số quốc gia giới gây đợt dịch lớn điển New York[17, 18, 20, 69], Isarel [46] Đây thực thách thức đối nhà điều trị gánh nặng cho cộng đồng việc trị liệu hạn chế, vi khuẩn mang gen xem “bất trị” Hơn nữa, gen blaKPC nằm plasmid nên khả lan truyền tính kháng nhanh cộng hợp với họ gen kháng khác plamid làm cho chủng mang gen có tính kháng mạnh Tổ chức Y tế giới lên tiếng cảnh báo lây lan vi khuẩn Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC để nước có biện pháp kiểm soát lây nhiễm tránh lạm dụng, sử dụng thuốc kháng sinh sai mục đích Tuy nhiên, Việt Nam, chưa có nghiên cứu mô hình lan truyền siêu vi khuẩn Đề tài “Phát xác định Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem” thực nhằm phát số chủng Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC số bệnh viện Việt Nam Qua giúp cho nhà lâm sàng Việt Nam kịp thời có biện pháp cách ly, ngăn chặn lây lan có nhìn thận trọng lan truyền đối tượng Nội dung thực đề tài bao gồm phần: + Định danh lại chủng nghi ngờ Klebsiella pneumoniae có tính đa kháng thu từ số bệnh viện Việt Nam + Xác định kiểu hình tiết ESBL carbapenemase Trang + Phát gen blaKPC phương pháp PCR + Xác định kiểu gen blaKPC chủng Klebsiella pneumoniae phương pháp giải trình tự Trang TỒNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae 1.1.1 Đặc điêm phân loại Năm 1884, nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (18531938) phát triển kĩ thuật nhuộm Gram để phân biệt Klebsiella pneumoniae Streptococcus pneumoniae Klebsiella đặt theo tên nhà vi khuẩn học người Đức kỉ 19, Edwin Klebs (1834-1913) [24] Dựa vào độ tương đồng di truyền, chi Klebsiella chia làm loài: Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella planticola, Klebsiella terrigena, Klebsiella mobilis (Enterobacter aerogenes), Klebsiella ornithinolytica Klebsiella variicola Klebsiella pneumoniae lại chia làm loài phụ Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenae Klebsiella rhinoscleromatis Sự phân chia dựa theo khác trình phát sinh bệnh dựa vào khoảng cách di truyền [24] Trong chi Klebsiella, Klebsiella pneumoniae thành viên quan trọng bệnh học trở thành tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện nghiêm trọng năm gần [52] Đặc điểm phân loại Klebsiella pneumoniae: Giới: Bacteria Ngành : Proteobacteria Lớp: Gammaproteobacteri a Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Klebsiella Klebsiella pneumoniae Đặc điểm hình thái, sinh hóa phân bố Loài: 1.1.2 Trang Klebsiella pneumoniae trực khuẩn Gram âm, không di động, có vỏ polysacharide đặc trưng Lớp áo giúp vi khuẩn tránh hàng rào phòng vệ tế bào chủ [52] Hình 1.1 Hình kính hiển vi quét khuấn lạc K pneumoniae [76] K pneumoniae sống kị khí tùy ý, có khả lên men lactose K pneumoniae có quan hệ gần với Klebsiella oxytoca, chúng phân biệt nhờ phản ứng indole, K pneumoniae có indole âm có khả tăng trưởng với melezitose 3-hydroxybutyrate [52] Một số phản ứng sinh hóa loài chi Klebsiella thống kê bảng 1.1 Vi khuấn có mặt khắp nơi tự nhiên đất, nước, nước thải, sản phấm thực vật, thức ăn có hàm lượng đường acid cao Một số loài chi Klebsilla phân lập từ bề mặt rễ số loài thực vật với vai trò cố định nitơ Klebsiella spp có phổ kí chủ động vật rộng, bao gồm côn trùng nhiều nhóm động vật khác Ở người tìm thấy chúng da, cổ họng, đường ruột, dày, nước tiểu hay vết thương vô trùng [24, 52] Nguồn phân lập phổ biến loài chi Klebsiella mô tả bảng 1.2 Bảng 3.6 Bảng tổng kết kết thu I D Định danh ESBL Biện luận dựa vào đường kính Biện luận dựa vào MIC vòng vô khuân IMI MERO K R R pneumoniae K R R pneumoniae + R R K pneumoniae R R K pneumoniae E R I asbureae K R R pneumoniae R R K pneumoniae K + S S pneumoniae Enterobac ter R R hormarch K eii + R R pneumoniae K + S S pneumoniae K R R pneumoniae K R R pneumoniae K + S S pneumoniae Shigella + S S boydii K + R R pneumoniae K + S S pneumoniae K R R pneumoniae K R R pneumoniae K + S I pneumoniae K R R pneumoniae Ghi chú: R (kháng), I (trung gian), S (nhạy) 3.4 Xác định gen blaKPC MERO DORI ERTA R R R R R R Thử nghiệm Hodge Kết điện di sản phâm PCR KPCu KPC - - - R + + + R R + + + I I R + + + R I R + - - R R R + + + R R R + + + S S R - - - R R R + + + R R R - - - S S S - - - R R R + + + I I R + + + S S S - - - S S R - - - R R R - - - S S S - - - I R R + + + R R R - - - R S R + + + R S R - - - 3.4.1 Kết PCR Vì nhiệt độ bắt cặp mồi ảnh hưởng lớn đến hiệu PCR nên thử chương trình luân nhiệt với nhiệt độ bắt cặp mồi 550C 600C để đưa nhiệt độ bắt cặp tối ưu Thí nghiệm thực chủng chứng dương chứng âm trước áp dụng cho mẫu lại Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm PCR khuy ếch đại gen KPCu KPC chủng chứng âm chứng dương Ghi chú: L: thang chuẩn 1000 bp Tm55: chương trình luân nhiệt với nhiệt độ bắt cặp Tm 55oC Tm60: chương trình luân nhiệt với nhiệt độ bắt cặp Tm 60oC 1705: chủng chứng dương K.pneumoniae ATCC ® 1705 mang gen KPC 1706: chủng chứng âm K.pneumoniae ATCC ® 1706 không mang gen KPC Kết cho thấy nhiệt độ bắt cặp 55oC có xuất băng sản phẩm khuếch đại gen KPCu (kích thước nằm khoảng 500-600 bp) KPC (kích thước khoảng 400 bp) chủng chứng dương K pneumoniae ATCC ® 1705 Các băng rõ, đậm nét, sản phẩm phụ không đặc hiệu Hơn nữa, băng lane chủng chứng âm K pneumoniae ATCC ® 1706 Ở nhiệt độ 60oC, vạch khuyếch đại sản phẩm sáng hơn, đậm lane 1705KPCu có vạch không đặc hiệu Các vạch không đặc hiệu tương tự xuất lane chủng chứng âm K pneumoniae ATCC ® 1706 (hình 3.6) Vì định chọn nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho chương trình luân nhiệt 55oC để áp dụng cho tất chủng thí nghiệm Kết điện di 21 chủng thí nghiệm thể hình 3.7 Kết khẳng định dương tính bảng điện di có vạch KPC KPCu Như có 10/21 chủng mang gen blaKPC, có ID 02, 03, 04, 06, 07, 09, 12, 13, 18, 20 (hình 3.8, bảng 3.6) Trong chủng có chủng 09 Enterobacter hormaechei, lại định danh K pneumoniae Mặc dù vật chủ mang gen blaKPC chủ yếu K pneumoniae gen blaKPC nhận thấy số vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột khác Enterobacter cloacae [19], Enterobacter aerogens [19] Klebsiella oxytoca [54, 71], Escherichia coli [46], Salmonella spp [41], Citrobacter freundii [54], Serratica spp [73] Việc xuất Enterobacter hormaechei mang gen blaKPC Việt Nam cảnh báo lan truyền theo chiều ngang gen Hình 3.7 Kết điện di gen KPC KPCu 21 chủng thí nghiệm Ghi chú: L: thang chuẩn 1000 bp 1705: chủng chứng dương K pneumoniae ATCC ® 1705 mang gen KPC 1706: chủng chứng âm K pneumoniae ATCC ® 1706 không mang gen KPC K P 17 05 KP CU 17 06 KP C 17 06 KP C K P 17 KP CU Hình 3.7 Kết điện di gen KPC KPCu 21 chủng thí nghiệm (tiếp) 3.4.2 Kết giải trình tự Để khẳng định vạch sản phẩm khuyếch đại thu gen KPC tiến hành giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR Sản phẩm PCR trước đem giải trình tự phải tinh để có tín hiệu trình tự tốt Sản phẩm PCR sau tinh hóa chất QIAquick PCR Purification Kits (QUIAGEN, Mỹ)được nồng độ độ tinhsạch kiểm tra điện DNA chip Kết điện di DNA chip máy Aligent 2100 Analyser trình bày hình 3.8, bảng 3.7 Kết cho thấy sản phẩm đạt độ tinh cao, thu loại sản phẩm với kích thước khoảng 408-411 bp, băng phụ kèm theo Nồng độ sản phẩm sau tinh đạt từ 18,21-24,05 ng/pl Để thu kết giải trình tự tốt điều quan trọng tối ưu thành phần phản ứng PCR giải trình tự, lượng DNA giữ vai trò quan trọng Theo nhà sản xuất, với kích thước khoảng khuyến cáo từ 200-500 bp lượng DNA cần cho phản ứng PCR giải trình tự 13-18 ng Dựa vào khuyến cáo kết nồng độ DNA thu sau tinh bổ sung thể tích thích hợp vào phản ứng PCR giải trình tự m [ T 02KPC 03KPC 04KPC 06KPC 07KPC 09KPC 11KPC 15 00 lũ ũũ 7Ũ Ũ- 0 0 0 5Ũ Ũ4Ũ Ũ3Ũ 0 1 Hình 3.8 Kết điện chip sản phẩm PCR gen blaKPC tinh Bảng 3.7 Nồng độ kích thước sản phẩm PCR gen blaKPC sau tinh Kích thước Nồng độ Kích thước Nồng độ (bp) [ng/pl] (bp) [ng/pl] 1705 410 18,72 09 409 18,23 02 411 20,73 12 408 19,92 03 410 22,42 13 410 23,61 04 410 19,18 18 409 22,96 06 408 20,59 20 409 24,05 07 410 18,21 ID ID Sau có sản phản PCR tinh sạch, tiến hành phản ứng PCR giải trình tự với cặp mồi blaKPC-F blaKPC-R để thu chuỗi trình tự hoàn chỉnh có chiều dài mong muốn Sản phẩm PCR giải trình tự tủa tinh phương pháp sử dụng nồng độ muối cao ethanol tuyệt đối để loại bỏ Bigdye terminator dư thành phần dư khác trước điện di mao quản máy ABI 3130 XL Genetic Analyser Kết phân tích phần mầm Sequencing analysis xử lý phần mềm Bioedit nhằm đưa chuỗi trình tự tốt Chuỗi trình tự so sánh trình tự tham khảo ngân hàng gen NCBI Qui trình giải trình tự thực chủng chứng dương K pneumoniae ATCC ® 1705 trước áp dụng cho chủng thí nghiệm để kiểm tra ổn định qui trình Kết giải trình tự gen blaKPC-F KPC-R chủng K pneumoniae ATCC ® 1705 trình bày hình 3.10 3.11 Trình tự gen blaKPC hoàn chỉnh K pneumoniae ATCC ® 1705 thu sau xử lý với phần mềm Bioedit sau: TTTGGCCTTGGACGCCTCACATACCGTGCCGTTTACTGATCGGCAGCAG ACCGGGTGACCCGCGCGTGGATAAACGGGCAACCTCGGGTTAGGGAG CTCGCGCTCAGATCGGCGTCGCCGCTACTGCCGGAGCGACACGAACAG TAGGAACAATCCGCGGGCCCACATCTGCCGGTTGTGTTATCCACGCGC GGGTCACCCGGTCTGCTGCCGTATCAGTAAACGGCACGGTATGTGAGG CGTCCAAGGCCAAAACAGAGGCTGACGGGTCAGACGGCCGTGGCGGC GCGCCTACGCCACCAACGGCCAGCACAAAGGGAAATCGGTTAGTTGTT TGACGACGGCGACGCCGCGTCGGTCACGTCTCGGGTCACAGTCAAAAA CATTCGAAAGGCAGTGCCGCGCGCCGCTACTCCATAGCGCGCGTAGCG GACCCTACCGCCTCAAGTCGAGGTCGAGGGTCGCCAGGTCTT So sánh trình tự với trình tự tham khảo ngân hàng NCBI, kết giải trình tự có độ tương đồng 99% so với trình tự K pneumoniae ATCC ® 1705 gửi lên ngân hàng NCBI trước với mã số GI 224384176 (hình 3.12) Như qui trình giải trình tự ổn định, dùng để áp dụng cho chủng lại Kết cho thấy trình tự sản phẩm PCR chủng thí nghiệm trình tự gen blaKPC với độ tương đồng với trình tự tham khảo từ 98-100% Kết giải trình tự trình bày phần phụ lục ỊIIỊ^IỊỊỊỊIỊỊỊỊỊỊI ÃÃTÃ GGTGCGCGCC CAGTGGGI A Trình tự giải Hình 3.9 Kết giải trình tự gen blaKPC chủng K pneumoniae ATCC ® 1705 với cặp mồi blaKPC-F B Hình ảnh liệu thô Hình 3.10 Kết giải trình tự gen blaKPC chủng K pneumoniae ATCC ® 1705 với cặp mồi blaKPC-R Accession >r gị|224384176|gblFJ665695.11 Klebsiella pneumoniae strain ATCC BAA- 1705 carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase (blaKPC-2) gene, partial cds Length=842 Sort alignments for this subject sequence by: E value Score Percent identity Query start position Subject start position Score = 726 bits (393), Expect = 0.0 Identities = 398/400 (99%), Gaps = 2/400 (1%) Strand=Plus/Plus QueryGGACCGCTGGGAGCT GGAGCT GAACTCCGCCATC CCAGGC GAT GCGCGC GATACCTC 61 TCT TCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAGGCGATGCGCGCGATACCTC 471 ATCGCCGCGCGCCGT 121 GAC GGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGGGCTCT GCACTGGCTGC ATCGCCGCGCGCCGT GAC GGAAAGC T TACAAAAAC TGACAC TGGGCTCT GCAC TGGCTGC 531 GCC GCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGACCGGCAAC CAC CGCAT 181 GCC GCAGCGGCAGCAGT T TGT T GAT TGGC TAAAGGGAAACACGACCGGCAAC CAC C GCAT 91 CCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCGGAACCTGCGGAGTGTA CCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAAACCGGAACCTGCGGAGTGTA 651 41 TGGCAC GGCAAATGACTATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGC GCACCTATTGTGTTGGC 301 TGGCAC GGCAAAT GAC TATGCCGTCGTCTGGCCCACTGGGCGC TAACAAGGATGACAAGCACAGC TAACAAGGAT GCACCTATTGTGTTGGC GAGGCCGTCATCGCCGCTGC GACAAGCACAGC 711 61 CGTCTACAC CGTC GAGGCCGTCATCGCCGCTGC TACAC CCGGGCGCC CCGGGCGCC 71 GGC TAGACTCGCGCTCGAGGGATTGGGC-TC CAACGGGCA 0 GGC TAGACTCGCGCTC GAGGGAT TGGGCGTC -AACGGGCA 810 Kết tra cứu trình tự tương đồng với chủng K pneumoniae ATCC 1705 dùng thí nghiệm công cụ BLAST NCBI Xác định kiểu gen blaKPC Việc xác định kiểu gen blaKPC giúp nhà dịch tễ học đánh giá mức độ lan truyền loại blaKPC dự đoán nguồn gốc của chủng mang gen blaKPC Tuy có nhiều biến thể gen blaKPC (từ đến 11) có loại thông thường nhận thấy K pneumoniae blaKPC-1, blaKPC-2 blaKPC-3 Các isozyme khác nu trình tự dẫn đến thay đổi axít amin Các nghiên cứu trước thường phân biệt loại isozyme dựa vào kết điện di sản phẩm PCR gen blaKPC sau ủ với enzyme cắt giới hạn BstNI Rsal (hình 1.3), bảng điện di có vạch blaKPC-1, có vạch trình tự có vị trí cắt giới hạn BstNI blaKPC-2 blaKPC-3 bảng điện di có vạch trình tự có vị trí cắt giới hạn BstNI Rsal Dựa vào sở đó, sử dụng phần mềm Primer premier 5.0 tìm vị trí cắt giới hạn enzyme trình tự gen blaKPC thu để xác định kiểu gen blaKPC Kết cho thấy chủng chứng dương K pneumoniae ATCC ®1705 có trình tự enzyme cắt giới hạn BstNI, tức chủng mang gen blaKPC-2, kết phù hợp với với công bố trình tự gen ngân hàng NCBI Trình tự 10 chủng thí nghiệm có trình tự enzyme cắt giới hạn BstNI (hình 3.12) Như tất chủng mang gen blaKPC loại blaKPC-2 Kiểu gen blaKPC-2 lần phát chủng K pneumoniae phân lập Maryland [62] sau bùng phát sang bang khác Mỹ [16, 19, 31] Isarel [37], năm xuất rải rác Pháp [44], Hy Lạp gần [23], Anh [70], Brazil [61], đáng lưu ý nước láng giềng Trung Quốc [68] Gen blaKPC-2 có khả lây lan nhanh blaKPC-1 lan truyền qua dung hợp plasmid [62] Sự xuất chủng mang gen blaKPC- Việt Nam điều đáng báo động Header 90%) để phát carbapenemase loại KPC, metallo-betalactamase chưa rõ [67] Vì vậy, tính kháng carbapenem chủng 01, 19, 21 tiết loại carbapenemase khác với KPC (ví dụ: metallo-carbapenemase) chế đặc biệt khác chế sản xuất AmpC cephalosporinase cộng thêm giảm tính thấm màng nghiên cứu trước [72] Nhóm 4: bao gồm chủng 08, 10, 15, 16 không mang gen blaKPC, MHT âm tính, ESBL dương kháng với loại carbapenem Ở K pneumoniae, kênh porin màng OmpK35và OmpK36 giữ vai trò quan trọng, thiếu hay thay hai protein đóng góp vào tính kháng carbapenem [36] Như tính kháng chủng tăng cường tính kháng khả tiết ESBL với với thay đổi kênh porin làm thay đổi tính thấm qua màng làm cho kháng sinh carbapenem không vào bên tế bào vi khuẩn Để khẳng định giả thiết cần phải tiến hành phương pháp phân tử kiểm tra diện protein màng OmpK35, OmpK36 phân tích trình tự gen để phát biến đổi bên trình tự - Nhóm 5: gồm chủng 05, 10 có kết đặc biệt Chủng 05 không mang gen blaKPC lại có kết thử nghiệm MHT dương ESBL âm Tính kháng chủng với carbapenem tiết loại carbapenemase khác metallo-carbapenemase (ví dụ: VIM, IPM, NDM, ) Còn chủng 10 không mang gen blaKPC Công cụ phân tử phát gen nói cần phải thực để tìm hiểu tính kháng chủng .2 Đánh giá thử nghiệm Hodge cải biên Dựa vào bảng so sánh kết thử nghiệm MHT với kết PCR giải trình tự gen blaKPC thống kê bảng 3.8, đánh giá độ đặc hiệu thử nghiệm Hodge cải biên (MHT) để phát gen blaKPC công thức: Bảng 3.8 Đánh giá kết thử nghiệm Hodge cải biên (MHT) Kết PCR giải trình tự (tiêu chuẩn vàng) Kết thử nghiệm MHT Có mang gen blaKPC Dương tính thật (10) Dương tính (11) Âm tính giả (0) Âm tính (10) Không mang gen blaKPC Dương tính giả (1) Âm tính thật (10) Như vậy, thử nghiệm MHT phát men KPC nghiên cứu đạt độ nhạy 100% độ đặc hiệu 90,91% Kết thu phù hợp với đánh giá MHT thử nghiệm có độ nhạy độ đặc hiệu cao (>90%) để phát vi khuẩn tiết men KPC Tuy nhiên, CLSI từ năm 2010 không khuyến cáo phòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng sử dụng MHT xét nghiệm thường qui để xác định vi khuẩn kháng carbapenem theo chế tiết carbapenemase Hơn nữa, số lượng mẫu nghiên cứu đề tài thấp (n = 21) chủng Việt Nam gặp, cần phải tiến hành nghiên cứu số lượng mẫu lớn để đánh giá xác Mặt khác thử nghiệm MHT thử nghiệm kiểu hình nên kết phụ thuộc vào chủ quan người đọc kết xem KPC thử nghiệm thử nghiệm nhạy để phát men MHT không phân biệt kiểu gen blaKPC Hơn nữa, công cụ không đủ giúp nhà nghiên cứu tìm hiểu chế kháng thuốc Vì vậy, phương pháp phân tử “công cụ vàng” nghiên cứu Trang KÉT LUẬN ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Trong 21 chủng nghi ngờ K pneumoniae có tính đa kháng đưa vào thí nghiệm có 18 chủng định danh lại K pneumoniae, chủng Enterobacter asbureae, chủng Enterobacter hormaecheii, chủng Shigella boydii Có 11/21 chủng có thử nghiệm Hodge dương tính, chủng kháng trung gian với tất loại carbapenem thử nghiệm (imipenem, meropenem, doripenem, ertapenem) Đánh giá thử nghiệm Hodge cải biên thực 21 chủng thí nghiệm cho thấy thử nghiệm có độ nhạy 100% độ đặc hiệu 90,91% để phát chủng mang gen blaKPC Khẳng định diện gen blaKPC 10 chủng thông qua phương pháp PCR giải trình tự, có chủng K pneumoniae, chủng Enterobacter hormaechei, tất khẳng định mang gen blaKPC-2 Phương pháp PCR giải trình tự “công cụ vàng” để xác định phát có mặt gen blaKPC kiểu gen blaKPC Đây nghiên cứu Việt Nam phát gen blaKPC K pneumoniae, vật chủ có khả tích lũy lan truyền tác nhân kháng cao Khả lan truyền diện rộng đối tượng trở thành mối đe dọa cho cộng đồng gen blaKPC định vị yếu tố di truyền di động plasmid Sự xuất 10 chủng mang gen blaKPC chủng K pneumoniae chủng Enterobacter hormaechei Việt Nam nghiên cứu tiếng chuông cảnh tỉnh nhà điều trị lâm sàng Chủ quan vi khuẩn mang gen blaKPC phân bố chủ yếu vùng bờ biển phía Đông, Việt Nam chưa có nghiên cứu tìm hiểu phân bố lan truyền chủng kháng thuốc Nghiên cứu giúp nhà điều trị lâm sàng Việt Nam có nhìn thực tế mô hình lan truyền tính kháng carbapenem gen blaKPC Việt Nam nói riêng mà góp phần minh chứng cho bùng phát Trang qui mô toàn cầu chủng mang gen blaKPC, K pneumoniae mang gen blaKPC 4.2 Đề nghị Những “siêu vi khuẩn” kháng thuốc mang gen blaKPC gần trở thành bất trị lại thêm khả lây truyền nhanh Cho đến nay, việc kiểm soát phát chủng vi khuẩn mang gen blaKPC thách thức Từ nghiên cứu thực hiện, đề nghị: - Mở rộng nghiên cứu có mặt gen blaKPC tất địa bàn dịch tễ khác để kiểm soát nhiễm khuẩn, quản lý kháng sinh ngăn chặn kịp thời lây lan chủng - Tìm hiểu chế kháng carbapenem chủng không mang gen blaKPC cách nghiên cứu có mặt gen kháng khác gen đặc trưng (ví dụ: thay đổi kênh porin màng, protein gắn penicillin PBPs) - Tiến hành khảo sát nhiều chủng để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu thử nghiệm Hodge cải biên - Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu thử nghiệm Hodge cải biên để phát loại carbapenemase khác - Ứng dụng qui trình PCR với điều kiện tối ưu để phát nhanh chủng mang gen blaKPC đơn vị nghiên cứu [...]... KPC3 K pneumoniae Số chủ ng phát hiện 1 Klebsiella aeruginosa oxytoca Pseudomonas 13 Citrobacter freundii Enterobacter spp 41 K pneumoniae Enterobacter cloacae Citrobacter freundii Enterobacter aerogens Klebsiella oxytoca K pneumoniae K pneumoniae K pneumoniae K pneumoniae K pneumoniae Pseudomonas aeruginosa K pneumoniae K pneumoniae K pneumoniae K pneumoniae 1 1 1 1 1 29 1 95 3 59 1 1 6 1 24 K pneumoniae. .. pháp khuếch đại PCR nhằm xác định chính xác kiểu gen blaKPC [25] Trang Nhìn chung, việc phát hiện vi khuẩn mang gen blaKPC kháng carbapenem rất khó khăn vì giá trị MIC carbapenem có thể rất cao nhưng vẫn nằm trong khoảng xác định là trung gian được xác định theo CLSI Những nghiên cứu trước đây cho thấy có tình trạng “kháng giả” đối với imipenem do có sự phân hủy của thuốc Một vài nghiên cứu gần đây... kháng sinh tự động và không tự động phát hiện tính kháng carbapenem thông qua phát hiện KPC ở các chủng K pneumoniae [64] - Năm 2008, Hindiyeh và cộng sự đã tối ưu hóa qui trình realtime-PCR để phát hiện nhanh chóng gen blaKPC [30] - Samra và cộng sự kết luận môi trường CHROMagar KPC có khả năng chọn lọc những vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem (2008) [57] - Năm 2009, Vered Schechner và cộng sự đánh... là K pneumoniae mang gen blaKPC có nguy cơ trở thành hiện thực Bảng 1.5 Phân bố của gen blaKPC theo thời gian và vùng địa lý Loại KPC Năm phát hiện KPC1 1996 Vùng Bắc Carolina Chủng Trang Italy K pneumoniae 1 [13 ] 1998-1999 Maryland K pneumoniae 4 [62] Salmonella entertica K pneumoniae 13 [41] [38] New York Israel Klebsiella oxytoca Escherichia coli 14 [71] [46] Trung Quốc New York Medellin, K pneumoniae. .. phương pháp phát hiện vi khuẩn mang gen blaKPC thông qua việc phát hiện carbarpenemase đã được sử dụng bao gồm: - Sử dụng môi trường chọn lọc CHROMagar KPC có bổ sung tác nhân ức chế vi khuẩn Gram âm và dương nhạy carbapenem [57] - Phương pháp đĩa khuyếch tán kháng sinh dựa trên sự xác định đường kính vòng vô khuẩn quanh đĩa carbapenem [67] Trang - Phương pháp vi pha loãng dựa trên sự xác định giá trị... và cộng sự đã nghiên cứu vai trò của beta- lactamase và porin ở K pneumoniae kháng carbapenem và cephalosporin [39] - Năm 2007, cấu trúc tinh thể của gen blaKPC-2 được đưa ra bởi Ke, W và cộng sự [33] - Năm 2008, Thierry Naas và cộng sự đã xác định cấu trúc gen blaKPC từ các chủng K pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa thu được từ các bệnh viện ở Mỹ, Colombia, Hy Lạp [45] - Năm 2006, Fred C Tenover và. .. baumannii phát hiện ở Puerto Rico năm 2010 [55] Tệ hại hơn, ở Hy Lạp đã ghi nhận một trường hợp nhiễm khuẩn K pneumoniae mang đồng thời 2 loại carbapenemase KPC-1 và VIM-1 [26] Sự phân bố gen blaKPC theo thời gian và vùng địa lý được thống kê trong bảng 1.6, hình 1.4 Nếu không có biện pháp phát hiện nhanh để kiểm soát quá trình lây lan, sự bùng phát trên qui mô toàn cầu của các chủng vi khuẩn mang gen blaKPC,... carbapenemase nằm trên plasmid, phát hiện ở K pneumoniae và E coli, phân lập từ mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân người Thụy Điển nhập viện tại New Delhi, Ân Độ - Lớp D: bao gồm oxacilinase, chủ yếu tìm thấy ở Acinetobacter baumanii 1.3 Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) 1.3.1 Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) Trước đây các men carbapenemase được cho là chuyên biệt cho loài, do gen mã hóa nằm trên nhiễm... 72] Ở K pneumoniae, kênh porin màng OmpK3 5và OmpK36 giữ vai trò quan trọng, sự thiếu hay thay thế một trong hai protein này đều đóng góp vào tính kháng carbapenem [36] - Sản xuất carbapenemase có khả năng thủy giải carbapenem nhờ hoạt tính thủy phân cầu amide của vòng beta-lactam Đây là cơ chế chủ yếu được thấy ở K pneumoniae [71, 72] Với vũ khí Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC), K pneumoniae. .. đánh giá phương pháp PCR giúp phát hiện các thành viên tiết men KPC trong họ vi khuẩn đường ruột [59] - Năm 2009, Pasteran và cộng sự đề nghị thử nghiệm tính nhạy dựa vào APB (3aminophenylboronic acid) để phát hiện carbapenemase lớp A ở các vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae [49] - Ngoài ra, những nghiên cứu sự xuất hiện của gen blaKPC và các biến thế mới của nó được thực hiện trên nhiều quốc gia, ... PCR nhằm xác định xác kiểu gen blaKPC [25] Trang Nhìn chung, việc phát vi khuẩn mang gen blaKPC kháng carbapenem khó khăn giá trị MIC carbapenem cao nằm khoảng xác định trung gian xác định theo... + Định danh lại chủng nghi ngờ Klebsiella pneumoniae có tính đa kháng thu từ số bệnh viện Việt Nam + Xác định kiểu hình tiết ESBL carbapenemase Trang + Phát gen blaKPC phương pháp PCR + Xác định. .. âm đánh giá mức độ kháng thuốc Trang chủng qua việc xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC E-test, xác định tỷ lệ ESBL Klebsiella mà chưa xác định đến mức phân tử dẫn đến tính kháng chủng Các liệu