2.1 Vật liệu
2.1.1 Các chủng thí nghiệm
- Đối tượng nghiên cứu: 21 chủng vi khuẩn nghi ngờ là Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem thu bệnh viện được từ một số bệnh viện tại Việt Nam.
- Các chủng chuẩn dùng trong thử nghiệm Hodge cải biên: Escherichia coli ATCC ®
25922 (vi khuẩn nhạy carbapenem), K. pneumoniae ATCC ® 1705 (carbapenemase
dương tính), K. pneumoniae ATCC ® 1706 (carbapenemase âm tính).
2.1.2 Thiết bị
- Kính hiển vi điện tử
- Tủ cấy vi sinh (Sanyo, Nhật) - Tủ hút ẩm
- Tủ đông sâu -70oC (Akira, Nhật) - Tủ mát 20oC (Sanyo, Nhật) - Máy ly tâm (Hitachi, Nhật) - Máy vortex
- Máy PCR (MyCycler, Bio-rad, Mỹ) - Máy đọc gel (GelDoz XR, Bio-Rad, Mỹ)
- Máy phân tích nồng độ DNA tự động Aligent 2100 Bioanalyser (Aligent Technologies, Mỹ)
- Máy giải trình tự tự động ABI 3130XL genetic Analyzer (Applied Biosystem, Mỹ)
- Máy sấy khô (Nam Khoa, Việt Nam)
- Micropipet, đầu tuyp, eppendorf, que cấy vòng, que cấy thẳng, que cấy vô trùng, tăm bông vô trùng, khay nhựa 12 giếng.
2.1.3 Hóa chất - Glycerol 20%.
- Bộ thuốc nhuộm Gram: Crystol Violet, Lugol, ethanol 95%, dung dịch safranin 0.5%, nước cất.
Nam).
- Đĩa thạch MC, MHA (Nam Khoa, Việt Nam).
- Đĩa kháng sinh imipenem (10 (Tg), meropenem (10 (Tg), ceftazidime (30 (Tg), cefotaxime (30 (Tg), cefepime (10 (Tg), amoxillin/clavulanate (30/20 (Tg), Ceftazidime/clavulanate (30/10 (Tg) (Nam Khoa, Việt Nam)
- Bộ hóa chất NKMIC.MDA giúp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC bao gồm: kháng sinh đông khô meropenem, ertapenem, doripenem (Nam Khoa, Việt Nam), môi trường lỏng Muller Hinton (Nam Khoa, Việt Nam)
- Bộ hóa chất dùng cho phản ứng PCR (Biorad, Mỹ) bao gồm PCR buffer, MgCl2, dNTPs, Tag DNA polymerase, nước cất.
- Bộ hóa chất QIAquick PCR Purification Kits (QUIAGEN, Mỹ) dùng cho tinh sạch DNA.
- Hóa chất dùng cho điện di gồm: Agarose (Bio-Rad, Mỹ), TBE 10X (Bio-Rad, Mỹ), loading buffer (Bio-Rad, Mỹ), ethidium bromide (Bio-Rad, Mỹ), thang chuẩn DNA từ 100 bp đến 900 bp (Bio-Rad, Mỹ).
- Bộ hóa chất dùng cho điện di DNA chip bao gồm: Gel-dye, marker, ladder (Aligent Technologies, Mỹ).
- Bộ hóa chất dùng cho quá trình giải trình tự (BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, ABI, Mỹ) bao gồm Big Dye, Big Dye buffer, nuclease free water, sodium acetate 3 M, ethanol 100%, ethanol 70%.
2.2 Phương pháp
2.2.1 Phương pháp nhuộm Gram
Muc đích: xác định vi khuẩn là Gram âm hay dương để tiến hành các bước
định danh tiếp theo.
Nguyên tắc: khi nhuộm vi khuẩn với thuốc màu Crystal Violet và một chất gắn
màu Iodine như Lugol nếu ta tẩy màu bằng ethanol 95%, vi khuẩn Gram dương có lớp peptidolycan dày ăn màu tím của Crystal Violet, ngược lại vi khuẩn Gram âm bị tẩy mất màu tím. Khi nhuộm lại với safranin 0,5%, nhóm Gram dương vẫn giữ màu tím còn nhóm Gram âm sẽ bắt màu đỏ.
Tiến hành
- Phết nhuộm được cố định trên lame.
- Phủ Crystal Violet lên phết nhuộm trong 1 phút. Rửa nước và nghiêng kính để cho ráo.
- Phủ Lugol lên phết nhuộm trong 1 phút. Rửa nước và nghiêng kính cho ráo. - Phủ ethanol 95% lên phết nhuộm, để 30 giây. Rửa bằng nước và nghiêng kính
cho ráo.
- Nhuộm lại với dung dịch Safranin trong 30 giây. Rửa nước và thấm khô vết nhuộm.
- Quan sát ở vật kính dầu.
Đoc kết quả: vi khuẩn Gram dương giữ màu tím của Crystal Violet, vi khuẩn
Gram âm giữ màu đỏ của Safranin.
2.2.2 Phương pháp định danh sinh hóa
Các chủng vi khuẩn thí nghiệm được phân lập trên môi trường MacConkey agar (MC). Các vi khuẩn mọc được được định danh bằng bộ hóa chất định danh IDS 14® GNR (Nam Khoa, Việt Nam) dùng cho định danh các trực khuẩn Gram âm dễ mọc.
2.2.2.1 Nguyên tắc một số phản ứng sinh hóa định danh nhóm trực khuẩn Gram âm
• Thử nghiệm khả năng lên men
Khi sử dụng các nguồn cacbon để lên men, tùy phương thức lên men các sản phẩm tạo ra sẽ khác nhau bao gồm rượu, các acid hữu cơ, CO2,. .. Trong tất cả các trường hợp, các sản phẩm tạo thành đều làm giảm pH môi trường dẫn đến sự thay đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường.
• Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)
Nhằm xác định vi sinh vật có có hệ enzyme citratase có khả năng khử nitrat thành nitrite hay nitơ tự do trong điều kiện kị khí. Nitrite được tạo ra sẽ phản ứng với sulphanilamide và N-napthylethylenediamine hydrochloride ở pH acid cho hợp chất
có màu hồng.
• Thử nghiệm ONPG
Các vi khuẩn có khả năng len men đường lactose nhanh có khả năng sản xuất cả 2 loại men lactose permease và P-galactosidase. Một số vi khuẩn được xem là nhóm vi khuẩn lên men lactose chậm chỉ sản xuất được P-galactosidase. Hoạt tính của enzyme này có thể xác định dựa một cơ chất tổng hợp là o-nitrophenyl-D- galactopyranoside (ONPG). Sự thủy phân của cơ chất đường này bởi P-galactosidase sẽ phóng thích o- nitrophenol có màu vàng.
• Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate
Sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kiềm hóa môi trường. Mặt khác mọi sinh vật có khả năng sử dụng citrate làm nguồn cacbon duy nhất đều có khả năng dùng muối ammonium làm nguồn đạm duy nhất. Sự phân giải của muối ammonium dùng làm nguồn đạm trong môi trường sẽ sinh NH3 làm kiềm hóa môi trường. Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường.
• Thử nghiệm Urease
Vi khuẩn tiết men urease có khả năng thủy phân urê trong môi trường thành CO2 và NH3 làm môi trường bị kiềm hóa. Chất chỉ thỉ Phenol Red trong môi trường thử nghiệm làm môi trường chuyển sang màu đỏ.
• Phenylalanine deaminase (PAD)
Một số vi khuẩn thuộc bộ lạc Proteeae như Proteus, Morganella, Providencia có khả năng sản xuất men deaminase khử amin của amino acid phenylalanine thành một keto acid, chất này kết hợp với ion sắt trong thuốc thử Ferric chloride 10% để cho ra màu xanh lá cây.
• Thử nghiệm bile esculine
Thử nghiệm này giúp phân biệt vi sinh vật dựa trên khả năng thủy phân liên kết glucoside trong esculine thành esculetin và glucose tự do khi có sự hiện diện của muối mật. Esculetin tạo ra sẽ phản ứng với muối sắt trong môi trường thử nghiệm tạo
• Thử nghiệm khả năng sinh indol
Thử nghiệm này phát hiên vi sinh vật sản xuất men tryptophanase khi nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường canh trypton. Phản ứng thủy phân trytophan tạo thành Indole, chất này kết hợp với Para-dimethylamino benzaldehyde trong thuốc thử Kovác cho ra một hợp chất muối dimethyl ammonium màu đỏ.
• Thử nghiệm VP (Voges - Proskauer)
Thử nghiệm VP nhằm mục đích phát hiện acetoin, một sản phẩm trung tính trong quá trình trao đổi glucose trong tế bào vi sinh vật. Chất này bị oxid hóa trong môi trường kiềm biến đổi thành diacetyl, dưới sự xúc tác của alpha-naphthol để cho một phức chất màu hồng đỏ.
• Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate
Thử nghiệm nhằm xác định khả năng của vi sinh vật sử dụng malonate như là nguồn carbon duy nhất trong môi trường. Các vi sinh vật biến dưỡng malonate sẽ sử dụng chu trình glyoxylic acid để biến dưỡng năng lượng. Nếu không sử dụng được malonate, chất này có tác dụng như một chất diệt khuẩn. Các vi sinh vật có khả năng biến dưỡng malonate đồng thời có khả năng sử dụng ammonium là nguồn đạm duy nhất. Do vậy khả năng biến dưỡng malonate được ghi nhận nhờ sự phóng thích NH3 làm kiềm hóa môi trường và chuyển màu của chỉ thị pH.
• Thử nghiệm KIA
Thử nghiệm này nhằm phát hiện khả năng sử dụng các nguồn carbonhydrate, khả năng sinh H2S và sinh khí trong môi trường KIA chứa hai loại đường lactose 1% và glucose 0.1%. Sau khi nuôi cấy chủng này 18-24 giờ, có ba trường hợp có thể xảy ra:
+ Nếu vi sinh vật chỉ lên men glucose, phần trên bề mặt của ống thạch nghiêng trở nên có pH kiềm và phần sâu trong ống có pH acid. Điều này có thể giải thích do vi sinh vật sau khi sử dụng hoàn toàn lượng glucose ít ỏi trên bề mặt mội trường, chúng tiếp tục dị hóa pepton trong môi trường giải phóng NH3 làm phần bề mặt của môi trường có pH kiềm. Ở phần sâu trong môi trường với điều kiện thiếu ôxi, glucose được lên men kỵ khí sinh ra các acid hữu cơ làm giảm pH của môi trường. Nếu trong
môi trường có chất chỉ thị phenol red thì trên mặt thạch nghiêng sẽ có màu đỏ và phần sâu sẽ có màu vàng.
+ Nếu vi sinh vật có thể sử dụng cả glucose và lactose, toàn bộ môi trường trở nên có pH acid, vi sinh vật không cần phải sử dụng đến pepton để tạo năng lượng.
+ Nếu vi sinh vật không sử dụng được cả hai nguồn carbon này, thì pepton được sử dụng để biến dưỡng thu năng lượng và vật chất cần cho sự tăng trưởng của vi sinh vật. Tuy nhiên, do pepton chỉ được biến dưỡng trong điều kiện hiếu khí nên hiện tượng kiềm hóa chỉ diễn ra trên phần của bề mặt môi trường và chỉ phần này mới trở nên có màu đỏ. Trong khi đó, phần môi trường sâu trong ống nghiệm sẽ không có hiện tượng đổi màu.
Trong các trường hợp nêu trên, sự lên men đường tạo ra các sản phẩm khí được nhận biết nhờ các khí này đẩy ống thạch lên trên hay làm vỡ thạch. Thử nghiệm này cũng có thể phát hiện khả năng sinh H2S do thành phần môi trường có chứa sodium thiosulphate. Vi sinh vật khử sulfate có thể khử hợp chất này để giải phóng H2S. Khí H2S tạo ra sẽ được phát hiện dựa vào phản ứng tạo kết tủa màu đen FeS giữa H2S và ion Fe2+ của chỉ thị ammonium citrate hiện diện trong môi trường.
• Thử nghiệm tính di động
Vi sinh vật di động thường là các vi sinh vật có tiêm mao phân bố tại các vi trí khác nhau trên tế bào vi sinh vật. Trong môi trường thử nghiệm tính di động thường bổ sung triphenyltetrazolium chloride để phát hiện dễ dàng vị trí hiện diện của tế bào vi sinh vật trong môi trường do hợp chất này khi vào bên trong tế bào sẽ bị khử thành formazan có màu đỏ.
• Thử nghiệm decarboxylase
Thử nghiệm này giúp xác định khả năng một vi sinh vật tạo enzyme carboxylase thủy phân được các axít amin đặc hiệu để xúc tác phản ứng loại bỏ nhóm carboxyl. Các enzyme carboxylase chỉ được cảm ứng tổng hợp khi môi trường có tính acid và chứa chất cảm ứng đặc hiệu. Phản ứng tạo CO2 trong điều kiện kỵ khí, CO2 sinh ra làm giảm pH của môi trường và được ghi nhận qua sự đổi màu của chỉ thị pH.
2.2.2.2 Cách tiến hành:
Tiến hành các phản ứng sinh hóa trong hệ thống định danh IDS14 GNR® (Nam Khoa, Việt Nam). Bộ hóa chất bao gồm:
• Đĩa giấy oxidase (OXI): thực hiện thử nghiệm oxidase - Nhỏ một giọt nước muối sinh lý vô trùng lên lame.
- Dùng kẹp giấy lấy một đĩa giấy oxidase nhúng vào giọt nước muối sinh lý cho vừa đủ ướt và đặt lên lame.
- Dùng vòng cấy vô trùng lấy khúm khuẩn quệt lên đĩa giấy oxidase.
- Đọc kết quả sau 10 giây: phản ứng dương tính khi đĩa giấy oxidase xuất hiện màu tím đen; âm tính khi đĩa giấy oxidase không có màu tím đen. • Bảng nhựa có 10 giếng chứa 10 loại đĩa giấy sinh hóa
- Dùng tăm bông vô trùng lấy khúm khuẩn cho vào nước muối sinh lý vô trùng để làm thành huyền dịch có độ đục McFarland 2,0.
- Cho vào mỗi giếng 200 (il huyền dịch, đậy nắp. - Ủ 35-37oC/12-24 giờ.
- Đọc kết quả theo bảng 2.1.
• Môi trường Lysin decarboxylase (LDC) thực hiện thử nghiệm Lysin decarboxylase
- Dùng pipet pasteur hay micropiper lấy 2-3 giọt huyền phù cho vào môi trường LDC, xuyên pha lớp parafilm.
- Ủ 35-37oC/12-24 giờ.
- Đọc kết quả: dương tính khi môi trường có vi khuẩn mọc và có màu tím ;
âm tính khi môi trường có màu vàng hoặc có vàng tím. • Môi trường mobility (MOB) thực hiện thử nghiệm di động
- Dùng que cấy vô trùng lấy khúm khuẩn và cắm kim cấy cách 2/3 đáy ampule chứa môi trường MOB, rút que cấy theo chiều thẳng đứng, cấy ria trên bề mặt thạch.
Đọc kết quả: vi khuẩn có khả năng di động khi màu đỏ lan rộng ra khỏi đường
Đọc kết quả định danh: Hệ thống định danh phân chia các thử nghiệm sinh hóa Giếng số Ký hiệu Thử nghiệm sinh hóa Thuốc thử thêm vào Kết quả thử nghiệm (+) (-) 1 GLU Lên men Glucose Vàng Tím 2 NIT Khử Nitrate thành Nitrite Tìm Nitrite Đỏ/hồng (xuất hiện trong vòng 3 phút) Vàn g nhạt 3 ONPG Thủy giải
ONPG Vàng nhạt
4 URE Sinh Urease Đỏ cánh sen Vàng/đỏ
nhạt 5 PAD Phenyl Alanine Deaminase FeCls
Xanh lá (xuất hiện ngay khi bỏ thuốc thử, để lâu sẽ mất màu) Vàn g nhạt 6 CIT Sử dụng Citrate Xanh biển (chỉ cần có ánh xanh biển) Xan h lá/vàn 7 ESC Thủy giải Esculine
Đen (có màu từ đen nhạt qua đen đậm
Không đen
8
H2
S Sinh H2S giếng, mất màu khi Đen (xuất hiện đáy nhỏ Kovac vào)
Không đen IN
D Sinh indol Kovac
Đỏ bề mặt (đọc sau 1 phút, không đọc sau 10 phút) Vàng bề mặt 9 VP Voges- Proskauer KOH + Napthtol
Đỏ (xuất hiện sau 5 phút, không đọc kết quả sau 2h) Vàn g nhạt 10 MLO Sử dụng
malonate Xanh biển
Xan h lá/vàn
Hình 2.1 Hướng dẫn định danh vi khuẩn Gram âm dễ mọc nhờ bộ hóa chất __ ®
IDS14 GNR®
Sau khi có kết quả các phản ứng sinh hóa (theo hướng dẫn ở bảng 2.1) cùng số điểm tương ứng với từng nhóm (hình 2.1), ta có được mã định danh. Từ đó ta có thể tra cứu hệ thống mã định danh của IDS14 GNR ® để xác định vi khuẩn cần định danh.
2.2.3 Phương pháp giải trình tự gen 16S RNA
Nguyên tắc: gen 16S rRNA có chiều dài khoảng 1542 bp với nhiều trình tự
bảo tồn, trong đó có một đoạn trình tự chiều dài khoảng 550 bp đặc hiệu cho giống và loài của vi khuẩn. Giải trình tự đoạn đặc hiệu này giúp định danh chính xác loài vi khuẩn.
Lấy một khúm khuẩn cho vào tube eppendorf có chứa sẵn 200 (il dung dịch TE, trộn đều để tạo huyền dịch vi khuẩn - Đun sôi mẫu ở 100oC trong 10 phút sau đó chuyển ngay sang khay đá trong 5
phút.
- Ly tâm 14000 RPM trong 10 phút.
- Hút dịch nổi chứa DNA vi khuẩn sang eppendorf mới. 2.2.3.2 Phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gen 16S rRNA
Phương pháp: sử dụng bộ hóa chất NK16S-PCR của công ty Nam Khoa với các thành phần như trong bảng 2.2.
Chương trình luân nhiệt của phản ứng PCR 16S rRNA 1 chu kỳ 40oC trong 10 phút 1 chu kỳ 95oC trong 10 phút
40 chu kỳ 94oC trong 30 giây
60oC trong 30 giây 72oC trong 1 phút 3 chu kỳ 72oC trong 10 phút
2.2.3.3 Tinh sạch sản phẩm PCR
Muc đích: loại bỏ mồi còn dư, dNTP cùng các thành phần khác, đảm bảo độ tinh sạch cao của DNA trước khi tiến hành
giải trình tự.
Phương pháp: sử dụng bộ hóa chất QIAquick PCR Purification Kits (QUIAGEN, Mỹ). Bộ kit này được chế tạo dựa
trên khả năng bám của DNA lên silica khi có mặt của nồng độ muối cao và pH thích hợp (pH < 7). Các chất không mong muốn như mồi dư, muối, enzyme, những nucleotit không bắt cặp,... không bám vào màng silica mà đi qua cột nhờ ly tâm. Muối được rửa khỏi cột bằng dung dịch đệm chứa ethanol. Dung dịch đệm rửa còn lại trong cột có thể ảnh hưởng đến các phản ứng enzyme sau này bị loại ra khỏi cột nhờ ly tâm. Dung dịch ly giải EB có nồng độ muối thấp và pH cao (pH 8,5) giúp DNA được
phản ứng PCR (50 pl)
PCR buffer 1 X
MgCl2 1,5 mM
Tag polymerase 1,25 U
dNTP 200 (iM mỗi loại
Mồi xuôi NK16s-F 20 pm
Mồi ngược NK16s- R 20 pm
dUTP 200 ỊTM
UNG 1 U
H2O Thêm vào cho đủ 45 (il
Vật liệu - Hóa chất
QUIAquick Spin columns.
Buffer PB (guanidine hydrochloride, isopropanol). Buffer PE (bổ sung ethanol 100%).
Buffer EB (10 nM TrisCl, pH 8,5). pH indicator.
Sodium acetate 3 M , pH 5. Collection Tube.
Qui trình:
Hòa dung dịch PB vào tube chứa sản phẩm khuếch đại DNA theo tỉ lệ 1:5