Hoàn thiện quy trình pha chế và sử dụng bộ xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN MINH THU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH PHA CHẾ BỘ XÉT NGHIỆM ỨNG DỤNG XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ ĐỨT GÃY DNA TINH TRÙNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Hà Nội – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN MINH THU HỒN THIỆN QUY TRÌNH PHA CHẾ BỘ XÉT NGHIỆM ỨNG DỤNG XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ ĐỨT GÃY DNA TINH TRÙNG Chuyên ngành: Y Sinh học - Di truyền Mã số: 60720102 LUẬN VĂN THẠC SỸ HƯỚNG DẪN 1: TS NGUYỄN THỊ TRANG HƯỚNG DẪN 2: TS TRIỆU TIẾN SANG LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Thị Trang, giảng viên Bộ môn Y sinh học - Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội TS Triệu Tiến Sang, Bộ môn Sinh học Di truyền y học , Học viện Quân Y, người thầy hướng dẫn tận tình, quan tâm, động viên, giúp đỡ em trình nghiên cứu học tập để em hoàn thành luận văn Em xin cảm ơn thầy cô, anh chị kĩ thuật viên, anh chị em nội trú Bộ môn Y sinh học - Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội giúp đỡ bảo cho em thời gian học tập nghiên cứu môn Em xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, Thư viện trường Đại học Y Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện cho em hoàn thành luận văn Lời cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình bạn bè ln bên cạnh ủng hộ, khích lệ chỗ dựa vững cho em không thời gian thực luận văn mà suốt trình học tập làm việc Hà Nội, ngày tháng Nguyễn Minh Thu năm 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn “Hồn thiện quy trình pha chế sử dụng xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng” hướng dẫn TS Nguyễn Thị Trang TS Triệu Tiến Sang hồn tồn tơi thực Các số liệu kết khóa luận trung thực chưa công bố trước Hà Nội, ngày tháng Nguyễn Minh Thu năm 2019 MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DNA WHO DFI IUI IVF ICSI AOT SCSA TB TUNEL SCD TCVN Deoxyribonucleic acide World Health Organization DNA fragmentation index intrauterine insemination in vitro fertilization intracytoplasmic sperm injection Acridine Orange Test Sperm Chromatin Structure Assay Toluidine Blue Terminal deoxynucleotidyl tranferase mediated dUTP nick end labeling assay Sperm Chromatin Dispersion test Tiêu Chuẩn Việt Nam DANH MỤC HÌNH VẼ Hình vẽ Hình 1.1 Các chế gây đứt gãy DNA tinh trùng Hình 1.2 Cấu trúc DNA tinh trùng theo Ward L (1997) Hình 1.3 Độ xác Hình 2.1 Sơ đồ bước tiến hành nghiên cứu Hình 2.2 Hình ảnh tinh trùng có quầng halo khơng có quầng halo Hình 3.1 Hình ảnh lam kính với tiêu thạch kit Halosperm Hình 3.2 Hình ảnh lam kính với tiêu thạch tự pha Hình 3.3 Hình ảnh tiêu xét nghiệm Halosperm Hình 3.4 Tiêu làm xét nghiệm tự pha Hình 3.5 Tiêu làm xét nghiệm thương mại Hình 3.6 Biểu đồ so sánh tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng kit tự pha kit thương mại Halosperm Hình 3.7 Biểu đồ Bland Altman đánh giá mối tương quan phương pháp Trang 17 21 24 31 31 32 38 38 39 42 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng biểu Bảng 2.1 Bảng quy ước xác định độ đặc hiệu xét nghiệm Bảng 3.1 So sánh kết nồng độ thạch agarose Bảng 3.2 So sánh kết nồng độ thạch phủ lam kính Bảng 3.3 Kết tạo tiêu tinh dịch - thạch loại lam kính Bảng 3.4 So sánh DFI dung dịch biến tính Bảng 3.5 So sánh DFI dung dịch ly giải Bảng 3.6 Kết thử nghiệm xác định độ chụm xét nghiệm tự pha Bảng 3.7 Kết kiểm nghiệm mức độ đứt gãy DNA tinh trùng Bảng 3.8 Bảng kiểm định hệ số tương quan phương pháp Bảng 3.9 Bảng kiểm định T - test chênh lệch phương pháp Bảng 4.1 So sánh quy trình xét nghiệm kit Halosperm kit tự pha Trang 28 30 31 32 33 - 34 34 - 35 36 - 37 40 41 41 54 - 55 ĐẶT VẤN ĐỀ Đứt gãy DNA tinh trùng rối loạn vật chất di truyền dẫn tới khả thụ tinh kém, thai phát triển thai dị tật bẩm sinh, dễ sảy thai Theo ước tính, khoảng 25% bệnh nhân nam vơ sinh có mức độ đứt gãy DNA tinh trùng cao [1] Có nhiều mối liên quan đứt gãy DNA tinh trùng kết tinh dịch đồ Nam giới có kết xét nghiệm tinh dịch đồ với tinh trùng có khả di động thường có tỷ lệ đứt gãy DNA cao Tuy nhiên, có khoảng 10% bệnh nhân vơ sinh nam có vấn đề đứt gãy DNA tinh trùng lại cho kết tinh dịch đồ hoàn tồn bình thường [2] Ngồi ra, cặp vợ chồng vơ sinh, đứt gãy DNA tinh trùng liên quan đến tiền sử sảy thai, thai lưu đứt gãy xảy vị trí gen liên quan đến làm tổ [3] Chỉ số đứt gãy DNA tinh trùng có giá trị cao việc tiên lượng khả sinh sản nam giới, giúp lựa chọn phương pháp hỗ trợ sinh sản thích hợp dự đốn tỷ lệ thành cơng phương pháp hỗ trợ sinh sản [4] Trên giới có nhiều phương pháp đánh giá mức độ đứt gãy DNA tinh trùng, phổ biến khảo sát mức độ phân tán chất nhiễm sắc tinh trùng Đây phương pháp đơn giản, dễ thực với chi phí thấp so với phương pháp khác hiệu cao, phù hợp với điều kiện [5] Tuy nhiên, kit xét nghiệm đứt gãy DNA tinh trùng phải nhập ngoại hoàn toàn, Việt Nam chưa có kit riêng Vì vậy, xét nghiệm nước ta phụ thuộc nhiều vào nhà cung cấp nhà vận chuyển không giá thành mà thời gian làm xét nghiệm Để hạn chế nhược điểm này, góp phần đưa xét nghiệm đứt gãy DNA tinh trùng đến gần với bệnh nhân, tiến hành đề tài nghiên cứu "Hồn thiện quy trình pha chế sử dụng xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng" với mục tiêu sau: 10 Hoàn thiện quy trình pha chế xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng So sánh kết xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng nam giới xét nghiệm tự pha với xét nghiệm thương mại Halosperm 67 Ward W.S., Barratt C.và Mortimer D (1997) Chromosome organisation in mammalian sperm nucleic Genetics of Human Male Infertility, 205-221 Denny S., Mariethoz E., Giancarlo M et al (1999) Origin of DNA damage in ejaculated human spermatozoa Reviews of Reproduction, 4, 31 - 37 Aitken R.J De Iuliis G.N (2010) On the possible origins of DNA damage in human spermatozoa Molecular Human Reproduction, 16 (1), 13 Pollister M A (1946) The nucleoprotamine of trout sperm J Gen Physiol, 30, 101-116 10 Leuchtenberger S.F.C, Weir D.R (1953) The desoxyribosenucleic acid (DNA) content in spermatozoa of fertile and infertile human males Chromosoma, 6, 61-78 68 11 Ringertz G B., Darzynkiewicz Z (1970) Changes in deoxyribonucleoprotein during spermiogenesis in the bull Sensitivity of DNA to heat denaturation Exp Cell Res, 62, 204-218 12 Evenson D.P., Melamed M.R (1980) Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility Science, 210, 1131-1133 13 Robert J.A et al (2017) DNA damage in human spermatozoa; important contributor to mutagenesis in the offspring Transl Androl Urol, (6), S761S764 14 Sakkas D., Alvarez J.G (2010) Sperm DNA fragmentation: mechanisms of origin, impact on reproductive outcome, and analysis American Society for Reproductive Medicine, 93 (4), 1027 - 1036 15 Monica M et al (2015) Investigation on the Origin of Sperm DNA Fragmentation: Role of Apoptosis, Immaturity and Oxidative Stress Molecular Medicine, 21, 109 - 122 69 16 Bejarano I, Rodriguez A B., Pariente J A (2018) Apoptosis Is a Demanding Selective Tool During the Development of Fetal Male Germ Cells Front Cell Dev Biol, 6, 65 17 Garcia-Peiro A., Martinez-Heredia J., Oliver-Bonet M et al (2011) Protamine to protamine ratio correlates with dynamic aspects of DNA fragmentation in human sperm Fertil Steril, 95 (1), 105-109 18 Marcon L Boissonneault G (2004) Transient DNA strand breaks during mouse and human spermiogenesis new insights in stage specificity and link to chromatin remodeling Biol Reprod, 70 (4), 910-918 19 Sakkas D., Manicardi G., Bianchi P G et al (1995) Relationship between the presence of endogenous nicks and sperm chromatin packaging in maturing and fertilizing mouse spermatozoa Biol Reprod, 52 (5), 1149-1155 20 Geoffry N.D et al (2009) DNA Damage in Human Spermatozoa Is Highly Correlated with the Efficiency of Chromatin Remodeling and the Formation of 8-Hydroxy-2 -Deoxyguanosine, a Marker of Oxidative Stress BIOLOGY OF REPRODUCTION, 81, 517 - 524 70 21 Billig H., Furuta I., Rivier C et al (1995) Apoptosis in testis germ cells: developmental changes in gonadotropin dependence and localization to selective tubule stages Endocrinology, 136 (1), 5-12 22 Xie D., Lu C., Zhu Y et al (2018) Analysis on the association between sperm DNA fragmentation index and conventional semen parameters, blood microelements and seminal plasma ROS in male patients with infertility Exp Ther Med, 15 (6), 5173-5176 23 Aitken R J, Baker M A., Sawyer D.(2003) Oxidative stress in the male germ line and its role in the aetiology of male infertility and genetic disease Reprod Biomed Online, (1), 65-70 24 O’Flaherty C., Vaisheva F., Hales B.F (2008) Characterization of sperm chromatin quality in testicular cancer and Hodgkin’s lymphoma patients prior to chemotherapy Hum Reprod, 23 (52), 1044 71 25 Martenies S E, Perry M J (2013) Environmental and occupational pesticide exposure and human sperm parameters: a systematic review Toxicology, 307, 66-73 26 Erenpreiss J., Spano M., Erenpreisa J et al (2006) Sperm chromatin structure and male fertility: biological and clinical aspects Asian J Androl, (1), 11-29 27 Nguyễn Hữu Sơn (2017) Đặc điểm đứt gãy DNA tinh tùng nam giới thất bại hỗ trợ sinh sản, Luận án tốt nghiệp bác sỹ đa khoa, Trường Đại học Y Hà Nội 28 Nguyễn Viết Tiến, Ngô Huy Toàn Bạch Huy Anh (2009) Nghiên cứu thực trạng vô sinh Việt Nam theo vùng sinh thái, Bệnh viện Phụ sản Trung ương, Đại học Y Hà Nội, 29 Trần Thị Trung Chiến, Trần Văn Hanh Lê Văn Vệ (2009) Vô sinh nam giới, Bệnh học giới tính nam, Nhà xuất Y học, 72-122 72 30 Utsuno H., Oka K., Yamamoto A et al (2013) Evaluation of sperm head shape at high magnification revealed correlation of sperm DNA fragmentation with aberrant head ellipticity and angularity Fertil Steril, 99 (6), 1573-1580 31 Cassuto N G., Hazout A., Hammoud I et al (2012) Correlation between DNA defect and sperm-head morphology Reprod Biomed Online, 24 (2), 211218 32 Irvine D S., Twigg J P., Gordon E L et al (2000) DNA integrity in human spermatozoa: relationships with semen quality J Androl, 21 (1), 33-44 33 Sheikh N., Amiri I., Farimani M et al (2008) Correlation between sperm parameters and sperm DNA fragmentation in fertile and infertile men International Journal of Reproductive BioMedicine, (1), 13 - 18 34 Avendano C., Franchi A., Taylor S et al (2009) Fragmentation of DNA in morphologically normal human spermatozoa Fertil Steril, 91 (4), 10771084 73 35 Virro M.R., Larson-Cook K.L., Evenson D.P (2004) Sperm chromatin structure assay (SCSA) parameters are related to fertilization, blastocyst development, and ongoing pregnancy in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection cycles Fertil Steril, 81 (1289-95), 36 Zini A., Dohle G (2011) Are varicoceles associated with increased deoxyribonucleic acid fragmentation? Fertil Steril, 96 (6), 1283-1287 37 Blumer C G., Fariello R M., Restelli A E et al (2008) Sperm nuclear DNA fragmentation and mitochondrial activity in men with varicocele Fertil Steril, 90 (5), 1716-1722 38 Bertolla R P., Cedenho A P., Hassun Filho P A et al (2006) Sperm nuclear DNA fragmentation in adolescents with varicocele Fertil Steril, 85 (3), 625-628 39 Phạm Thị Xuân (2016) Đánh giá đứt gãy ADN tinh trùng nam giới cặp vợ chồng sảy thai, thai lưu, Luận văn tốt ngiệp bác sỹ đa khoa, Đại học Y Hà Nội, 74 40 Robinson L., Gallos I D., Conner S J et al (2012) The effect of sperm DNA fragmentation on miscarriage rates: a systematic review and metaanalysis Hum Reprod, 27 (10), 2908-2917 41 Hamidi J., Frainais C., Amar E et al (2015) A double-blinded comparison of in situ TUNEL and aniline blue versus flow cytometry acridine orange for the determination of sperm DNA fragmentation and nucleus decondensation state index Zygote, 23 (4), 556-562 42 Evenson D P (2016) The Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA((R))) and other sperm DNA fragmentation tests for evaluation of sperm nuclear DNA integrity as related to fertility Anim Reprod Sci, 169, 5675 43 Sharma R., Masaki J., Agarwal A (2013) Sperm DNA fragmentation analysis using the TUNEL assay Methods Mol Biol, 927, 121-136 44 Chenlo P H., Curi S M., Pugliese M N et al (2014) Fragmentation of sperm DNA using the TUNEL method Actas Urol Esp, 38 (9), 608-612 75 45 Ribas-Maynou J., Fernandez-Encinas A., Garcia-Peiro A et al (2014) Human semen cryopreservation: a sperm DNA fragmentation study with alkaline and neutral Comet assay Andrology, (1), 83-87 46 Ribas-Maynou J., Garcia-Peiro A., Fernandez-Encinas A et al (2013) Comprehensive analysis of sperm DNA fragmentation by five different assays: TUNEL assay, SCSA, SCD test and alkaline and neutral Comet assay Andrology, (5), 715-722 47 Fernandez J L., Muriel L., Rivero M T et al (2003) The sperm chromatin dispersion test: a simple method for the determination of sperm DNA fragmentation J Androl, 24 (1), 59-66 48 Fernandez J L., Muriel L., Goyanes V et al (2005) Simple determination of human sperm DNA fragmentation with an improved sperm chromatin dispersion test Fertil Steril, 84 (4), 833-842 49 Nguyễn Thị Thúy An (2014) Kết so sánh số phân mảnh DNA tinh trùng kit Halosperm quy trình SCD xây dựng Trung tâm Nghiên 76 cứu Di truyền Sức khỏe Sinh sản, Khoa Y, Đại học Quốc gia TPHCM, Hội nghị IVF EXPERTS MEETING 10, Vũng Tàu 50 Trần Cao Sơn (2010) Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, Nhà xuất khoa học kĩ thuật, Hà Nội 51 Lwanga S.K Lemeshow S (1991) Sample size determination in Health studies, a practical manual., WHO, Geneva, 52 Duran E H., Morshedi M., Taylor S et al (2002) Sperm DNA quality predicts intrauterine insemination outcome: a prospective cohort study Hum Reprod, 17 (12), 3122-3128 53 Fernandez et al (2003) Based on Sperm Chromatin Dispersion Test (SCDT) for humans, the sperm DNA integrity in bulls has been assessed by Sperm Bos Halomax (SBH) assay J Androl, 24 (1), 59 - 66 54 Phạm Tuấn Hưng (2018) Cải tiến quy trình xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng nam giới vô sinh, Luận văn tốt nghiệp bác sỹ y khoa, Đại học Y Hà Nội, 77 55 Martin B J Altman D STATISTICAL METHODS FOR ASSESSING AGREEMENT BETWEEN TWO METHODS OF CLINICAL MEASUREMENT The Lancet, 327 (8476), 307 - 310 56 Bộ Khoa học Công nghệ (2017) Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 3591:2017 Aga 57 Triệu Tiến Sang (2018) Nghiên cứu xây dựng quy trình đánh giá mức độ đứt gãy ADN tinh trùng Tạp chí Khoa học Công nghệ Việt Nam, 7B, 1722 58 Sadeghi S., Celma F., Valverde A., Fereidounfar S., (2016) Morphometric comparison by the ISAS® CASA-DNAf system of two techniques for the evaluation of DNA fragmentation in human spermatozoa Asian J Androl, 18(6), 835-839 59 Wiweko B (2017) Predictive value of sperm deoxyribonucleic acid (DNA) fragmentation index in male infertility Basic and clinical andrology, 27, 1-7 78 60 Evenson D P.(2005) Comparison of the Halosperm® test kit with the Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA®) infertility test in relation to patient diagnosis and prognosis Fertil Steril, 84 (4), 846-849 79 Phụ lục HỒ SƠ NGHIÊN CỨU I THÔNG TIN MẪU Số phiếu: Tên bệnh nhân: Tuổi: Giới: Nam Địa chỉ: Xét Kiểm tra mức độ đứt gẫy DNA tinh trùng (kit Halosperm kit nghiệm: tự pha) Ngày làm xét nghiệm: II KẾT QUẢ: Tinh trùng không bị đứt gẫy DNA Tinh trùng bị đứt gẫy DNA (%) (%) Quầng Quầng nhiễm sắc rộng nhiễm sắc vừa Kít Halosperm Quầng Khơng có quầng Thối hóa nhiễm sắc nhỏ nhiễm sắc Tỷ lệ tinh trùng bị đứt gẫy DNA Quầng Quầng nhiễm sắc rộng nhiễm sắc vừa Kít tự pha chế Quầng Khơng có quầng Thối hóa nhiễm sắc nhỏ nhiễm sắc Tỷ lệ tinh trùng bị đứt gẫy DNA Người thực (Ký tên) Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu (Ký, ghi rõ họ tên) 80 81 Phụ lục BẢNG PHÂN PHỐI CHUẨN STUDENT ... mức độ đứt gãy DNA tinh trùng" với mục tiêu sau: 10 Hồn thiện quy trình pha chế xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng So sánh kết xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng nam giới xét. .. gãy DNA cao [1] Có mức độ đứt gãy DNA tinh trùng: - DFI < 15% tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng thấp - DFI 15 – 30%: tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng trung bình - DFI > 30%: tỷ lệ đứt gãy DNA tinh trùng. .. 300 mẫu tinh dịch Xét nghiệm đứt gãy DNA tinh trùng Xét bằngnghiệm kit tự pha đứt gãy DNA tinh trùng kit thương mại Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu xét nghiệm So sánh tương đương kit tự pha thương