ĐỀ TÀI : “Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất β-D-glucan và một số polysaccarit khác từ sinh khối nấm Linh chi và Hầu thủ "

BỘ CƠNG THƢƠNG CHƢƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHCN TRỌNG ĐIỂM QUỐC GIA PHÁT TRIỂN CƠNG NGHIỆP HĨA DƢỢC ĐẾN NĂM 2020 BÁO CÁO TỔNG HỢP ĐỀ TÀI : “Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất β-D-glucan số polysaccarit khác từ sinh khối nấm Linh chi Hầu thủ " Mã số: CNHD.ĐT052/14-16 Chủ nhiệm đề tài (dự án): PGS.TS Lê Mai Hƣơng Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên Hà Nội, 2017 BỘ CƠNG THƢƠNG CHƢƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHCN TRỌNG ĐIỂM QUỐC GIA PHÁT TRIỂN CƠNG NGHIỆP HĨA DƢỢC ĐẾN NĂM 2020 BÁO CÁO TỔNG HỢP ĐỀ TÀI : “Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất β-D-glucan số polysaccarit khác từ sinh khối nấm Linh chi Hầu thủ " Mã số: CNHD.ĐT052/14-16 THỦ TRƢỞNG TỔ CHỨC CHỦ TRÌ CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Họ, tên chữ ký) PGS TS Lê Mai Hƣơng Hà Nội, 2017 DANH MỤC TÀI LIỆU Lời cảm ơn Báo cáo thống kê Danh mục kí hiệu, chữ viết tắt Mục lục Danh mục bảng Danh mục hình ảnh, đồ thị Báo cáo tổng kết i LỜI CẢM ƠN Chủ nhiệm đề tài thành viên tham gia đề tài chân thành cám ơn Cu ̣c Hóa chất - Bô ̣ Cơng thƣơng ; Văn phòng Chƣơng trình Hóa dƣơ ̣c ; Viện Hóa học Hợp chất Thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam ban ngành tạo điều kiện để chúng tơi hồn thành đề tài tiến độ đạt đƣợc mục tiêu đề Xin chân thành cám ơn Ban lãnh đạo đồng nghiệp Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, học viên sinh viên giúp đỡ, cộng tác tạo điều kiện cho chúng tơi hồn thành đề tài Xin cảm ơn quan phối hợp Bộ môn Sinh lý bệnh, Học Viện Quân y Viện Khoa học vật liệu đồng hành trình thực đề tài Vì báo cáo tổng kết nhiều nội dung, tránh khỏi sai sót Tập thể tác giả thực hiên đề tài mong đƣợc góp ý chân thành toàn thể ngƣời quan tâm để sửa chữa bổ sung cho hoàn chỉnh, phù hợp với mục tiêu nội dung đề tài Xin chân thành cám ơn! ii VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc VIỆN HOÁ HỌC CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN Hà Nội, ngày tháng năm 2017 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI Tên đề tài: ―Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất β-D-glucan số polysaccarit khác từ sinh khối nấm Linh chi Hầu thủ‖ Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Lê Mai Hƣơng Học hàm: Phó giáo sƣ Năm đƣợc phong học hàm: 2007 Học vị: Tiến sĩ Năm đạt học vị: 1993 Chức danh khoa học: NCVCC Chức vụ: Chủ tịch Hội đồng KH Điện thoại: Cơ quan: 844-8361899 NR: 844-7613424 Mobile: 0936180907 Fax: 844-7562390 E-mail: lehuong1258@gmail.com Tên quan công tác: Viện Hoá học hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Hố học hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Điện thoại: 844-8361899 Fax: 844-7562390 Địa chỉ: 18 Đƣờng Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam Họ tên thủ trƣởng quan: GS.TS Phạm Quốc Long Số tài khoản: 301.01.010.02.16 Kho bạc Cầu Giấy, Hà Nội Tên quan chủ quản đề tài: Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực đề tài: - Theo hợp đồng kí kết: từ tháng 6/2014 đến tháng 6/2016 Thực tế thực hiện: từ tháng 6/2014 đến tháng 12/2016 Đƣợc gia hạn (nếu có): 06 tháng Kinh phí đƣợc duyệt sử dụng kinh phí: Kinh phí đƣợc cấp: 2500 triệu đồng iii a, Tổng số kinh phí thực hiện: 2500 triệu đồng, đó: + Kinh phí hỗ trợ từ SNKH: 2500 triệu đồng + kinh phí từ nguồn khác: triệu đồng + Tỷ lệ kinh phí thu hồi dự án (nếu có): b, Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn SNKH: Đơn vị tính: triệu đồng STT Theo kế hoạch Thời gian Thực tế đạt đƣợc Kinh phí Thời gian Ghi Kinh phí (Tr.đ) (Tr.đ) 2014 951 2014 453,735 2015 1549 2015 1196,569474 2016 2016 807,880526 c, Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi Đơn vị tính: triệu đồng STT Nội dung khoản chi Theo kế hoạch Tổng SNKH Nguồn khác Thực tế đạt đƣợc Tổng SNKH 976 976 Công lao động 976 976 Nguyên vật liệu, lƣợng 1170 1170 Thiết bị, máy móc 100 100 99,8 99,8 Chi khác 254 254 228,79 228,79 Tổng 2500 2500 Nguồn khác 1.168,595 1.168,595 2.458,185 2.458,185 Các văn hành trình thực đề tài STT Số, Thời gian ban hành văn Số 4684/QĐ-BCT Ngày 8/7/2013 Tên văn Quyết định việc phê duyệt kinh phí đề tài, dự án khoa học công nghệ thuộc ―Chƣơng trình nghiên cứu khoa học cơng nghệ trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp Hóa dƣợc đến năm 2020‖ năm 2014; iv Ghi Bộ CT Số 052/2014/HĐ- Hợp đồng nghiên cứu khoa học phát triển ĐTCNHD; Ngày 12/6/2014 công nghệ ban điều hành liên ngành Chƣơng trình Hóa dƣợc Viện Hóa học Bộ CT Hợp chất thiên nhiên Số 140/HCTN; Ngày 26/5/2016 Công Văn Viện Hóa học HCTN xin gia VHHHCTN hạn đề tài đến hết tháng 9/2016 Số 5206/BCT- Công Văn Ban Điều hành liên ngành Hóa BĐHHD; Ngày 13/06/2016 dƣợc đồng ý gia hạn đề tài đến hết tháng 9/2016 Số 239/HCTN; Ngày 6/9/2016 Công Văn Viện Hóa học HCTN xin gia VHHHCTN hạn đề tài đến hết tháng 12/2016 Số /BCT- Công Văn Ban Điều hành liên ngành Hóa BĐHHD; Ngày dƣợc đồng ý gia hạn đề tài đến hết tháng 12/2016 Bộ CT Bộ CT Tổ chức phối hợp thực đề tài: STT Tên tổ chức đăng kí theo Thuyết minh Tên tổ chức tham gia thực Nội dung tham gia chủ yếu Trung tâm Công nghệ Trung tâm Công nghệ Lên men tạo sinh khối -Phối hợp để ổn định từ hai lồi xây dựng qui trình lên Sinh học thực Sinh học thực nấm linh chi hầu men nấm linh chi vật, Viện Di truyền Nông nghiệp vật, Viện Di truyền Nông nghiệp thủ Viện Khoa học Vật liệu, Viện Hàn lâm KH&CN Việt nam Viện Khoa học Nghiên cứu cấu trúc - Một số kết Vật liệu, Viện polysaccarit hình ảnh Hàn lâm polysaccarit KH&CN Việt sản phẩm nam - Phối hợp công bố báo Khoa Dƣợc Khoa Dƣợc lý, Thử nghiệm dƣợc lý - Một số kết lý, Học viện Học viện quân sản phẩm thử nghiệm sản phẩm quân y y động vật thử nghiệm Sản phẩm chủ yếu đạt đƣợc hầu thủ để thu sinh khối v Ghi Danh sách cán tham gia thực đề tài: S T T Tên cá nhân đăng kí theo thuyết minh Tên cá nhân tham gia thực Sản phẩm chủ yếu đạt đƣợc PGS.TS Lê Viện Hóa học Chủ nhiệm đề tài, Báo cáo tổng kết đề Mai Hƣơng Hợp chất chịu trách nhiệm tài thiên nhiên Nội dung tham gia TS Đỗ Nghị chung Hữu Viện Hóa học Đánh giá hoạt Báo cáo kết hoạt HCTN tính sinh học in tính vitro sản phẩm CN Nguyễn Viện Hóa học NC Đình Luyện HCTH chọn giống Đã chọn đƣợc 02 nấm tham gia chủng nấm có khả lên men dịch thể sinh trƣởng tốt môi trƣờng dịch thể ThS Trần Thị Viện Hóa học Nghiên cứu tách Hồng Hà HCTN chiết chuyển hóa polysaccarit enzym Đánh giá hoạt - Báo cáo kết tách chiết chuyển hóa polysaccarit enzym - Báo cáo kết tính sinh học in hoạt tính sinh học in vitro sản phẩm vitro sản phẩm ThS Lê Hữu Viện Hóa học Nghiên cứu tách Cƣờng HCTN chiết chuyển hóa polysaccarit enzym TS Hà Phƣơng Viện Khoa học Nghiên cứu Thƣ vật liệu trúc polysaccarit TS Trần Nhƣ Hằng PGS.TS Nguyễn Toàn Báo cáo kết tách chiết chuyển hóa polysaccarit enzym cấu Hình ảnh liệu phổ polysaccarit Thị Viện Hóa học Đánh giá hoạt tính Báo cáo kết hoạt HCTN sinh học Bộ môn sinh lý Đánh giá hoạt tính Lĩnh bệnh, Học viện kháng u tăng quân y cƣờng miễn dịch sản phẩm in vivo vi tính sinh học Báo cáo kết hoạt tính kháng u tăng cƣờng miễn dịch sản phẩm in vivo Ghi Tình hình hợp tác quốc tế STT Theo kế hoạch Thực tế đạt đƣợc - Đoàn Ghi - Đoàn + Năm 2014: 03 cán + Năm 2014: 03 cán Việt Nam Đạt Việt Nam sang Hàn sang Hàn Quốc Quốc Nội dung: - - Trao đổi kế hoạch hợp tác với đối tác - Trao đổi kinh nghiệm nghiên cứu sản xuất thực phẩm chức Tóm tắt nội dung, cơng việc chủ yếu: (Nêu mục 15 thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát nước nước ngồi) Các nội dung, cơng việc chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu) Thời gian (Bắt đầu, kết thúc) Theo kế hoạch Nội dung 1: Tạo nguồn sinh 6/2014khối ổn định, giàu polysaccarit 11/2014 Thực tế đạt đƣợc 6/201411/2014 chất có hoạt tính sinh học từ hai loài nấm linh chi hầu thủ Cá nhân, tổ chức thực hiện* Lê Mai Hƣơng, Nguyễn Đình Luyện, Cồ Thị Thùy Vân Nội dung 2: Xây dựng quy trình 9/2014tách chiết β- Glucan 12/2015 polysaccarit khác từ loại nấm dƣợc liệu (linh chi, đầu khỉ) Phối trộn tạo sản phẩm hỗn hợp 9/201412/2015 Lê Mai Hƣơng, Lê Hữu Cƣờng, Trần Thị Hồng Hà Nội dung 3: Đánh giá hoạt tính 9/2014- 9/2015 9/2014sản phẩm hỗn hợp 9/2015 Lê mai Hƣơng, Trần Thị Hồng Hà NNK Nội dung 4: Phân tích kiểm 9/2014nghiệm sản phẩm nghiên 12/2015 cứu độ ổn định sản phẩm, xây dựng tiêu chuẩn sở sản vii 9/20159/2016 Lê mai Hƣơng, Trần Thị Hồng Hà, Nguyễn Lĩnh Toàn & CS phẩm Nội dung 5: Bản tiêu chuẩn 9/2015Đăng kí chất lƣợng VSAT sản sở sản phẩm 9/2016 phẩm, sở hữu trí tuệ, cơng bố 1-2 NCS, tham gia đào tạo SĐH Lê Mai Hƣơng , Trần Thị Hồng Hà & CS nƣớc III SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CỦA ĐỀ TÀI Sản phẩm KH&CN tạo ra: a) Sản phẩm Dạng I: Đạt T Tên sản phẩm Đơn vị T tiêu chất lượng chủ đo Mức chất lượng Theo kế hoạch Thực tế đạt Chủng Chủng khiết 02 chủng giống nấm Hầu thủ; chủng giống nấm Linh chi Kg Hàm lƣợng yếu Chủng giống Sản phẩm dạng bột 5kg β-D glucan≥30 % 10 kg: kg bột β – glucan, kg bột β – glucan đƣợc phối trộn với curcumin theo tỉ lệ 2:1 Sản phẩm dạng viên Kg Hàm lƣợng 100.000 β-D viên nang glucan≥6% 100.000 viên nang - Lý thay đổi (nếu có): b) Sản phẩm Dạng II: Đạt T T Yêu cầu khoa học cần đạt Tên sản phẩm Theo kế hoạch Thực tế đạt đƣợc Qui trình lên men lấy Qui trình ổn định, có thể lặp Qui trình ổn định, có thể sinh khối từ nấm Linh chi lại, qui mơ 30-80lít/mẻ lặp lại, qui mơ 3080lít/mẻ Qui trình lên men lấy sinh khối từ từ nấm Hầu thủ Qui trình ổn định, có thể lặp lại, qui mơ 30-80lít/mẻ Qui trình ổn định, có thể lặp lại, qui mơ 3080lít/mẻ viii 59 Wang J cs (2009) Structure and chain conformation of five water-soluble derivatives of ab-D-glucan isolated from Ganoderma lucidum Carbohydrate Research 344: 105–112 60 Wang, J C., Hu, S H., Wang, J T., Chen, K S., & Chia, Y C (2005) Hypoglycemic effect of extract of Hericium erinaceus Journal of the Science of Food and Agriculture, 85(4), 641-646 61 Wang, X M., Yang, M., Guan, S H., Liu, R X., Xia, J M., Bi, K S., & Guo, D A (2006) Quantitative determination of six major triterpenoids in Ganoderma lucidum and related species by high performance liquid chromatography Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 41(3), 838-844 62 Wasser S P.(2002): Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysaccarits Application of Microbiological Biotechnology, 60, 258-274 63 Wasser, S P., & Weis, A L (1999) Medicinal properties of substances occurring in higher basidiomycetes mushrooms: current perspectives (review) International Journal of medicinal mushrooms, 1(1) 64 Yanaki T et al (1983) Corelation between the anti-tumor activity of a polysaccarit schizophyllan and its triple-helical conformation in dilute aqueous solution Biophysical Chemistry 17: 337–342 65 Yan-yan, X U (2006) Extraction Methods and Techniques of Polysaccharides [J] Journal of Fujian Fisheries, 3, 008 66 Zhang, M., Cui, S W., Cheung, P C K., & Wang, Q (2007) Antitumor polysaccharides from mushrooms: a review on their isolation process, structural characteristics and antitumor activity Trends in Food Science & Technology, 18(1), 4-19 67 Zhang, A Q., Fu, L., Xu, M., Sun, P L., & Zhang, J S (2012) Structure of a water-soluble heteropolysaccharide from fruiting bodies of Hericium erinaceus Carbohydrate polymers, 88(2), 558-561 68 Zhong, J J., & Tang, Y J (2004) Submerged cultivation of medicinal mushrooms for production of valuable bioactive metabolites In Biomanufacturing (pp 25-59) Springer Berlin Heidelberg 69 Zhu, Y., Li, Q., Mao, G., Zou, Y., Feng, W., Zheng, D., & Yang, L (2014) Optimization of enzyme-assisted extraction and characterization of polysaccharides from Hericium erinaceus Carbohydrate polymers, 101, 606613 155 MỤC LỤC BÁO CÁO TỔNG HỢP i MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lƣợc nấm lớn 1.1.1 Giới thiệu nấm lớn 1.1.2 Giá trị dinh dƣỡng 1.1.3 Giá trị y dƣợc học 1.2 Polysaccarit từ nấm dƣợc liệu 1.3 Nấm linh chi (Ganoderma lucidum) 16 1.3.1 Thành phần hoá học nấm Linh chi 16 1.3.2 Giá trị y dƣợc học nấm Linh chi 17 1.4 Nấm Hầu thủ (Hericium erinaceus) 19 1.4.1 Giá trị dinh dƣỡng nấm Hầu thủ 19 1.4.2 Giá trị y dƣợc học nấm Hầu thủ 20 1.5 Nuôi trồng nấm phƣơng pháp lên men dịch thể 22 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Vật liệu 25 2.2 Môi trƣờng 26 2.2.1 Môi trƣờng nuôi cấy nấm 26 2.2.2 Mơi trƣờng đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 27 2.3 Một số phƣơng pháp nghiên cứu phịng thí nghiệm 27 2.3.1 Phƣơng pháp nuôi cấ y dich ̣ thể 27 2.3.2 Phƣơng pháp tách chiế t polysaccarit 27 2.3.2 Phƣơng pháp tinh sa ̣ch polysaccarit 28 2.3.4 Phƣơng pháp xác đinh ̣ hàm lƣơ ̣ng polysaccarit tổng số 28 2.3.5 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng β-glucan 29 Phương pháp so màu 29 Phương pháp huỳnh quang 30 2.3.6 Phƣơng pháp đo hàm lƣợng protein hòa tan 31 2.3.7 Phƣơng pháp tạo hệ nano polysaccarit nấm mang curcumin 31 2.3.8 Phƣơng pháp thử hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thƣ (cytotoxicity) 32 2.3.9 Phƣơng pháp ức chế hình thành khối u ba chiều thạch mềm (antitumor promoting assay) 33 2.3.10 Các phƣơng pháp phân lập xác định cấu trúc hợp chất 33 2.4 Phƣơng pháp thử nghiệm sản phẩm động vật 34 2.4.3 Nghiên cứu tác dụng dự phòng điều trị ung thƣ chế phẩm 36 2.4.3.1 Sản phẩm Heriglucan Plus (Betamix) 36 2.4.3.2 Sản phẩm Bioglucumin Plus 37 2.4.4 Đánh giá tác dụng kích thích miễn dịch 38 2.4.5 Đánh giá khả hoạt hóa đại thực bào phúc mạc chuột tiết interferon gama 39 2.4.6 Phƣơng pháp đánh giá tác dụng bảo vệ gan mơ hình gây độc CCl4 41 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1 NỘI DUNG 1: TẠO NGUỒN SINH KHỐI ỔN ĐỊNH, GIÀU POLYSACCARIT VÀ CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ HAI LỒI NẤM LINH CHI VÀ 43 HẦU THỦ 3.1.1 Nghiên cứu sàng lọc, lựa chọn chủng giống có khả sinh trƣởng tốt 43 chất dịch thể 3.1.1.1 Sàng lọc, lựa chọn chủng giống nấm Hầu thủ 43 3.1.1.2 Sàng lọc, lựa chọn chủng giống nấm Linh chi 46 3.1.2 Nghiên cứu xây dựng quy trình cơng nghệ lên men chìm sinh tổng hợp polysaccarit từ hai loài nấm Linh chi Hầu thủ quy mơ phịng thí nghiệm quy mơ pilot 49 50 3.1.2.1 Quy mô phịng thí nghiệm 56 3.1.2.2 Quy mô pilot 3.1.3 Nghiên cứu thử nghiệm lên men hỗn hợp tạo sản phẩm hỗn hợp polysaccarit 80 hai loài nấm qui mơ phịng thí nghiệm 80 3.1.3.1 Môi trường lên men thích hợp 3.1.3.2 Nhiệt độ thích hợp 80 3.1.3.3 Điều kiện pH thích hợp 81 3.1.3.4 Thời gian ni cấy tĩnh thích hợp 81 3.2 NỘI DUNG 2: XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT β-D-GLUCAN VÀ POLYSACCARIT KHÁC TỪ LOẠI NẤM DƢỢC LIỆU (LINH CHI, HẦU THỦ) VÀ PHỐI TRỘN TẠO SẢN PHẨM HỖN HỢP 83 3.2.1 Xây dựng quy trình tách chiết điều chế β-D-glucan polysaccarit từ nấm Hầu thủ Linh chi 83 84 3.2.1.1 Tách chiết β-D-glucan polysaccarit từ nấm Hầu thủ 3.2.1.2 Tách chiết β-D-Glucan polysaccarit từ nấm Linh chi 87 3.2.2 Thiết lập quy trình làm giàu tinh sản phẩm polysaccarit β-Dglucan để đạt hàm lƣợng β-D-glucan 30% 90 3.2.2.1 Nghiên cứu tinh β-D-glucan từ nấm Hầu thủ 3.2.2.2 Nghiên cứu làm giàu β-D-glucan từ nấm Hầu thủ 90 93 3.2.2.3 Nghiên cứu tinh β-D-Glucan từ nấm Linh chi 96 98 3.2.2.4 Nghiên cứu làm giàu β-D-glucan từ nấm Linh chi 3.2.3 Tạo sản phẩm polysaccarit hỗn hợp nấm Linh chi Hầu thủ 100 3.2.3.1 Nghiên cứu biện pháp hỗ trợ phân cắt polysaccarit trọng lượng 100 phân tử lớn thành sản phẩm có trọng lượng phân tử nhỏ 3.2.3.2 Phối sản phẩm lên men dịch thể với bột thể nấm Linh chi Hầu thủ, nano hóa curcumin bao sản phẩm hỗn hợp 108 112 3.3 NỘI DUNG 3: ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SẢN PHẨM 3.3.1 Hoạt tính in vitro 112 3.3.1.1 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư 112 113 3.3.1.2 Hoạt tính ức chế hình thành khối u thạch mềm 3.3.2 Thử nghiệm in vivo sản phẩm Betamix 114 3.3.2.1 Thử nghiệm độ an toàn sản phẩm Betamix 114 3.3.2.2 Độc tính bán trường diễn sản phẩm Betamix 114 3.3.2.3 Tác dụng dự phòng điều trị ung thư sản phẩm Betamix 117 3.3.3 Thử nghiệm in vivo sản phẩm BioGlucumin Plus 121 3.3.3.1 Độc tính cấp chế phẩm BioGlucumin Plus 121 3.3.3.2 Độc tính bán trường diễn chế phẩm BioGlucumin Plus 122 3.3.3.3 Khả kháng u chế phẩm BioGlucumin Plus 126 3.4 NỘI DUNG 4: PHÂN TÍCH KIỂM NGHIỆM SẢN PHẨM VÀ NGHIÊN CỨU ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA SẢN PHẨM, XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ SẢN PHẨM 133 3.4.1 Phân tích kiểm nghiệm sản phẩm 133 3.4.1.1 Cấu trúc polysaccarit β-glucan từ nấm Linh chi 133 3.4.1.2 Cấu trúc polysaccarit β-glucan từ nấm Hầ u thủ 136 3.4.2 Nghiên cứu bào chế viên nang 140 3.4.3 Đánh giá độ ổn định chế phẩm 142 3.4.3.1 Theo dõi điều kiện dài hạn 142 3.4.4.2 Theo dõi điều kiện lão hóa cấp tốc 143 3.5 NỘI DUNG 5: ĐĂNG KÍ CHẤT LƢỢNG VSAT SẢN PHẨM, SỞ HỮU TRÍ TUỆ, CÔNG BỐ VÀ THAM GIA ĐÀO TẠO SĐH 144 3.5.1 Xây dựng tiêu chuẩn sở sản phẩm 144 3.5.2 Danh sách công bố sở hữu trí tuệ vệ sinh an tồn thực phẩm khuôn khổ đề tài 144 3.5.3 Danh sách cơng trình đƣợc cơng bố khuôn khổ đề tài 145 3.5.4 Danh sách NCS đề tài hỗ trợ đào tạo 145 IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 146 V TỰ ĐÁNH GIÁ CỦA NHÓM TÁC GIẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 148 VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 150 PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Nguồn gốc, kiểu hoạt tính polysaccarit từ số nấm lớn Bảng 1.2: Cấu trúc hóa học số polysaccarit chống ung thư (Zhang, 2007) Bảng 1.3: Các thụ thể nhận biết khuôn mẫu với số polysaccarit 14 Bảng 1.4: Thành phần hoá học nấm Linh chi 16 Bảng 1.5: Thành phần hoá học nấm Linh chi 16 Bảng 1.6: Thành phần chất nấm Linh chi có giá trị dược học 18 Bảng 1.7: Thành phần dinh dưỡng thể nấm H erinaceus (% nấm khô) 19 Bảng 1.8: Thành phần hàm lượng axit amin thể nấm H erinaceus 20 Bảng 1.9: Hoạt tính kháng ung thư polysaccarit từ nấm H erinaceus thử 21 nghiệm chuột Bảng 3.1.1: Đặc trưng hình thái hệ sợi thể 04 chủng nấm Hầu thủ sau 14 ngày 43 nuôi môi trường dinh dưỡng Bảng 3.1.2: Thời gian sinh trưởng chủng nấm Hầu thủ đĩa thạch 44 Bảng 3.1.3 Đặc trưng hình thái hệ sợi thể chủng nấm Linh chi môi 47 trường thạch đĩa LCCB Bảng 3.1.4: Sinh trưởng hàm lượng polysaccarit nấm hầu thủ môi trường nuôi 50 Bảng 3.1.5: Sinh khối khô hàm lượng polysaccarit chủng nấm H erinaceus He1 52 điều kiện nhiệt độ khác Bảng 3.1.6: Sinh khối khô hàm lượng polysaccarit chủng nấm H erinaceus He1 52 điều kiện pH khác Bảng 3.1.7: Sinh khối nấm hàm lượng polysaccarit nấm Hầu thủ H erinaceus 53 He1 thời điểm thu khác Bảng 3.1.8: Sinh trưởng hàm lượng polysaccarit chủng nấm Linh chi GL2 54 môi trường nuôi Bảng 3.1.9 Sinh khối khô hàm lượng polysaccarit chủng nấm G lucidum Gl2 55 điều kiện pH khác Bảng 3.1.10: Sinh khối nấm hàm lượng polysaccarit nấm Linh chi thời 55 điểm thu khác Bảng 3.1.11: Ảnh hưởng chế độ khử trùng đến chất lượng môi trường 57 Bảng 3.1.12: Ảnh hưởng thành phần môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng 57 nấm Hầu thủ môi trường lên men lỏng Bảng 3.1.13: Ảnh hưởng pH môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng hệ sợi nấm 58 Hầu thủ Bảng 3.1.14: Ảnh hưởng tỷ lệ giống cấy đến sinh trưởng giống nấm Hầu thủ 59 môi trường MT3 sau ngày ni (dung tích 200 ml) Bảng 3.1.15: Ảnh hưởng chế độ nuôi đến sinh trưởng giống Hầu thủ trung gian 61 cấp môi trường MT8 Bảng 3.1.16: Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến chất lượng môi trường lên men nhân 63 giống trung gian cấp nấm Hầu thủ Bảng 3.1.17: Ảnh hưởng tỷ lệ giống cấy đến kích thước đặc điểm hệ sợi nấm Hầu 64 thủ môi trường nhân giống trung gian cấp Bảng 3.1.18: Ảnh hưởng chế độ sục khí đến sinh trưởng nấm Hầu thủ bình 65 nhân giống trung gian cấp Bảng 3.1.19: Ảnh hưởng chất phá bọt trình lên men Hầu thủ bình 66 nhân giống trung gian cấp Bảng 3.1.20: Đặc điểm hệ sợi nấm Hầu thủ hàm lượng polysaccarit bình lên men 69 80 lít thời điểm nuôi Bảng 3.1.21: Ảnh hưởng thành phần môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng 70 giống nấm Linh chi môi trường lên men lỏng Bảng 3.1.22: Ảnh hưởng chế độ khử trùng đến chất lượng môi trường dinh dưỡng 72 Bảng 3.1.23: Ảnh hưởng tỷ lệ giống cấy đến sinh trưởng giống nấm Linh chi 72 môi trường lên men nhân giống trung gian cấp Bảng 3.1.24: Ảnh hưởng pH môi trường đến sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi 73 môi trường lên men nhân giống trung gian cấp Bảng 3.1.25: Ảnh hưởng chế độ thơng khí đến sinh trưởng giống Linh chi 75 môi trường lên men lỏng Bảng 3.1.26: Ảnh hưởng chế độ khử trùng đến chất lượng môi trường lên men nấm 76 Linh chi dung tích 30 lít Bảng 3.1.27: Ảnh hưởng tuổi giống trung gian cấp tới phát triển hệ sợi nấm Linh chi bình nhân giống trung gian cấp 76 Bảng 3.1.28: Ảnh hưởng tuổi giống trung gian cấp tới phát triển hệ sợi nấm 77 bình lên men dung tích 80L Bảng 3.1.29: Đặc điểm hệ sợi nấm Hầu thủ hàm lượng polysaccarit bình lên men 78 80 lít thời điểm nuôi Bảng 3.1.30: Sinh khối khô hàm lượng polysaccarit hỗn hợp của chủng nấm He1 80 Gl2 môi trường nuôi Bảng 3.1.31: Sinh khối khô hàm lượng polysaccarit hỗn hợp chủng nấm He1 81 Gl2 điều kiện nhiệt độ khác Bảng 3.1.32 Sinh khối khô hàm lượng polysaccarit hỗn hợp chủng nấm Hầu thủ 81 He1 Linh chi Gl2 điều kiện pH khác Bảng 3.1.33: Sinh khối hàm lượng polysaccarit của hỗn hợp chủng nấm H erinaceus 82 He1 G lucidum Gl2 thời điểm thu khác Bảng 3.2.1: Hàm lượng polysaccarit β-D-Glucan dịch chiết nước nóng nấm Hầu 85 thủ Bảng 3.2.2 Hàm lượng polysaccarit β-D-Glucan cặn chiết nấm Hầu thủ với 86 nồng độ dung môi kiềm khác Bảng 3.2.3 Hàm lượng polysaccarit β-D-glucan phân đoạn PWH, PAH 86 PKH từ sản phẩm lên men chìm nấm Hầu thủ Bảng 3.2.4: Hàm lượng polysaccarit, β-1,3-D-glucan protein cặn chiết nước nóng 88 nấm Linh chi Bảng 3.2.5 Hàm lượng polysaccarit glucan từ nấm Linh chi chiết với nồng độ kiềm 89 thay đổi Bảng 3.2.6 Hàm lượng polysaccarit phân đoạn chiết từ nấm Linh chi lên men 90 dịch thể Bảng 3.2.7: Hiệu suất độ tinh β-D-glucan qua cột DEAE cellulose 91 Bảng 3.2.8 Hiệu suất độ tinh β-D-glucan sau sử dụng cột Sapharose CL- 93 6B Bảng 3.2.9: Làm giàu β-1,3-D-glucan enzyme protease amylase 94 Bảng 3.2.10: Hiệu làm giàu β-D-glucan từ nấm Hầu thủ phương pháp Sevag 94 Bảng 3.2.11: Hiệu làm giàu β-D-glucan từ nấm Hầu thủ phương pháp sử dụng 95 dung môi ethanol Bảng 3.2.12: Hiệu làm giàu β-D-glucan từ nấm Hầu thủ phương pháp enzyme 95 kết hợp tủa ethanol 60% Bảng 3.2.13: Hiệu suất thu hồi hàm lượng β-1,3-D-glucan từ nấm Linh chi qua cột 96 DEAE cellulose Bảng 3.2.14: Làm giàu β-1,3-D-glucan enzyme protease amylase 98 Bảng 3.2.15: So sánh hiệu làm giàu β-D-glucan từ nấm Linh chi phương pháp 99 sử dụng Bảng 3.2.16 Hoạt tính gây độc tế bào phân đoạn β-1,3/1,6-glucan mạch ngắn từ 102 nấm Hầu thủ Bảng 3.2.17 Giá trị IC50 phân đoạn β-1,3/1,6-glucan mạch ngắn từ nấm Hầu thủ 102 Bảng 3.2.18 Hoạt tính chống oxy hóa sản phẩm β-1,3/1,6-glucan với trọng lượng 103 phân tử khác nấm Hầu thủ Bảng 3.2.19 Hoạt tính ức chế tạo u thạch mềm β-1,3/1,6-glucan có trọng lượng 103 phân tử khác từ nấm Hầu thủ Bảng 3.2.20: Đường khử tạo thành trình thủy phân β-1,3-glucan từ -1,3- 104 glucanase theo thời gian Bảng 3.2.21: Khối lượng phân đoạn ngắn mạch sau cắt β-glucan nấm Linh chi 106 enzyme Bảng 3.2.22: Hoạt tính gây độc tế bào β-1,3/1,6-glucan từ nấm Linh chi với trọng 107 lượng phân tử khác Bảng 3.2.23: Hoạt tính gây độc tế bào β-1,3/1,6-glucan từ nấm Linh chi với trọng 107 lượng phân tử khác Bảng 3.2.24: Hoạt tính chống oxy hóa sản phẩm β-1,3/1,6-glucan từ nấm Linh chi 107 với trọng lượng phân tử khác Bảng 3.2.25: Kết thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u thạch mềm β-1,3/1,6- 108 glucan từ nấm Linh chi có trọng lượng phân tử khác Bảng 3.2.26: Một số peak đặc trưng curcumin, 1,3-β-glucan BioGlucumin Plus 109 Bảng 3.3.1: Hoạt tính gây độc tế bào Betamix 112 Bảng 3.3.2: Tác dụng chất thử lên hình thành khối u thực nghiệm 113 thạch mềm Bảng 3.3.3 Sự thay đổi trọng lượng chuột thí nghiệm cho uống Betamix 114 (g/con) Bảng 3.3.4 Các tiêu huyết học hóa sinh cho chuột uống Betamix 115 Bảng 3.3.5 Kết mổ giải phẫu quan nội tạng uống Betamix 116 Bảng 3.3.6 Trọng lượng số nội quan (gram/10 gram thể trọng) 116 Bảng 3.3.7 Khối lượng trung bình chuột thí nghiệm (g/con) 117 Bảng 3.3.8 Quá trình phát triển khối u 117 Bảng 3.3.9 Phần trăm ức chế khối u (%) 118 Bảng 3.3.10 Trọng lượng u (g/con) 118 Bảng 3.3.11 Kết phân tích huyết học hóa sinh máu 120 Bảng 3.3.12: Trọng lượng thể thỏ sau uống BioGlucumin Plus bán trường diễn 122 Bảng 3.3.13: Số lượng bạch cầu nhóm thỏ sau uống BioGlucumin Plus bán 122 trường diễn Bảng 3.3.14: Số lượng hồng cầu nhóm thỏ sau uống BioGlucumin Plus bán 123 trường diễn Bảng 3.3.15: Nồng độ huyết sắc tố (HST) nhóm thỏ sau uống BioGlucumin Plus 123 bán trường diễn Bảng 3.3.16: Số lượng tiểu cầu nhóm thỏ sau uống BioGlucumin Plus bán 123 trường diễn Bảng 3.3.17: Hoạt độ GOT huyết thỏ sau uống BioGlucumin Plus bán 124 trường diễn Bảng 3.3.19: Hoạt độ GPT huyết thỏ sau uống BioGlucumin Plus bán 124 trường diễn Bảng 3.3.20 Nồng độ bilirubin máu thỏ sau uống BioGlucumin Plus bán 125 trường diễn Bảng 3.3.21 Nồng độ ure máu thỏ sau uống BioGlucumin Plus bán trường diễn 125 Bảng 3.3.22 Nồng độ creatinin máu thỏ sau uống BioGlucumin Plus bán 125 trường diễn Bảng 3.3.23 Tỉ lệ chuột sống, chết nhóm nhóm chứng chết 50% 130 Bảng 3.3.24 Tỉ lệ chuột thoái lui khối u 130 Bảng 3.3.25 Tỉ lệ tế bào biểu Cd11b nhóm chuột 131 Bảng 3.4.1: So sánh phổ 13C-NMR β-1,3/1,6 glucan β- glucan tinh từ nấ m 136 Linh chi Bảng 3.4.2 Giá trị tín hiệu phổ 13C-NMR -1,3/1,6-glucan nấm Hầu thủ 139 Bảng 3.4.3: Trọng lượng thể thỏ sau uống BioGlucumin Plus bán trường diễn 142 Bảng 3.4.4: Số lượng bạch cầu nhóm thỏ sau uống BioGlucumin Plus bán trường diễn Bảng 3.4.5: Số lượng hồng cầu nhóm thỏ sau uống BioGlucumin Plus bán trường diễn Bảng 3.4.6: Nồng độ huyết sắc tố (HST) nhóm thỏ sau uống BioGlucumin Plus bán trường diễn 143 143 143 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Kết nối polymer thành tế bào nấm 10 Hình 1.2: Cấu trúc hóa học điển hình β-1,3/1,6-glucan 11 Hình 1.3: Các dạng cấu trúc β-glucan chuyển đổi chúng 12 Hình 1.4: Hệ thống miễn dịch bẩm sinh thích nghi động vật 13 Hình 1.5: Mơ hình glucan hoạt hóa tế bào miễn dịch gây phá hủy tác nhân bệnh 15 Hình 2.1 Cường độ màu poly polysaccarit với hỗn hợp dịch nhuộm (hình trái) 29 Đồ thị chuẩn dùng glucose với nồng độ xác định phản ứng tạo mầu với hỗn hợp dịch nhuộm (hình phải) Hình 3.1.1: Sinh khối chủng nấm Hầu thủ môi trường nuôi cấy dịch thể 45 Hình 3.1.2: Bào tử chủng nấm Hầu thủ H erinaceus He1 46 Hình 3.1.3: Sinh khối nấm Linh chi môi trường nuôi cấy dịch thể 48 Hình 3.1.4: Sự sinh trưởng hệ sợi nấm chủng G lucidum Gl2 môi trường 49 khiết sử dụng thể phân lập giai đoạn phát triển khác nhau, thời gian nuôi sợi 10 ngày Hình 3.1.5: Ảnh hiển vi bào tử chủng G lucidum Gl2 (x15000) 49 Hình 3.1.6: Sinh khối khơ hàm lượng polysaccarit chủng nấm H erinaceus 51 He1 mơi trường lên men dịch thể Hình 3.1.7: Sinh khối khô hàm lượng polysaccarit chủng nấm G lucidum 54 Gl2 khoảng nhiệt độ khác Hình 3.1.8: Ảnh hưởng tỉ lệ giống cấy đến sinh khối hệ sợi nấm môi 59 trường MT8 Hình 3.1.9: Ảnh hưởng nhiệt độ ni đến sinh trưởng hệ sợi nấm Hầu 60 thủ Hình 3.1.10: Hình thái hệ sợi nấm Hầu thủ môi trường MT3 chế độ 62 nuôi sau 10 ngày cấy giống Hình 3.1.11: Mơi trường nhân giống cấp nấm Hầu thủ khử trùng 115oC thời gian 30, 40, 50, 60, 70 phút (từ trái sang) 63 Hình 3.1.12: Ảnh hưởng tỷ lệ giống cấy đến sinh khối nấm Hầu thủ môi 64 trường nhân giống trung gian cấp Hình 3.1.13 Ảnh hưởng tuổi giống trung gian cấp đến sinh khối sợi nấm Hầu 67 thủ bình lên men dung tích 80 lit Hình 3.1.14: Ảnh hưởng tỉ lệ giống cấy chuyển đến sinh khối sợi nấm Hầu thủ 68 bình dung tích 80 lít Hình 3.1.15: Đường cong sinh trưởng giống nấm Hầu thủ bình lên men 69 80 lít theo sinh khối sợi Hình 3.1.16: Ảnh hưởng thành phần mơi trường dinh dưỡng đến 71 sinh khối sợi nấm Linh chi mơi trường lên men lỏng Hình 3.1.17 Hệ sợi nấm nấm Linh chi bình mơi trường nhân giống cấp 71 có thành phần khác Hình 3.1.18: Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng giống nấm Linh chi 74 môi trường lên men nhân giống cấp Hình 3.1.19: Đường cong sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi môi trường lên 79 men dung tích bình ni 80 lít Hình 3.2.1: Quy trình sơ tách chiết polysaccarit tổng số từ sản phẩm lên men 83 chìm nấm Hầu thủ Linh chi Hình 3.2.2: Biểu đồ hàm lượng polysaccarit β-1,3-D glucan nấm Hầu thủ chiết 85 thời gian khác Hình 3.2.3: Hàm lượng polysaccarit, β-1,3-D glucan protein cặn chiết 88 nước nóng nấm Linh chi thời gian chiết khác Hình 3.2.4: Lượng polysaccarit β-D-glucan chiết từ sản phẩm lên men 90 chìm nấm Linh chi Hình 3.2.5: Tinh sạch β-D-glucan qua cợt DEAE cellulose 92 Hình 3.2.6: Tinh β-1,3-D-glucan từ nấm Hầu thủ với cột Sepharose CL-6B 92 Hình 3.2.7: Tinh sạch β-D-glucan qua cợt DEAE cellulose 97 Hình 3.2.8: Tinh β-1,3-D-glucan từ nấm Linh chi qua cột Sepharose CL-6B 97 Hình 3.2.9 Hàm lượng hiệu suất thu hồi β-D-glucan phương pháp làm 99 giàu β-D-glucan từ nấm Linh chi Hình 3.2.10 Dùng cột sephadex G-100 kiểm tra Khối lượng phân tử phân đoạn 102 HT-GL1, HT-GL2 HT-GL3 Hình 3.2.11: Dùng cột sephadex G-100 kiểm tra Mw phân đoạn Pol (LC-GL1), 106 Pol (LC-GL2) Pol (LC-GL3) Hình 3.2.12: Phổ FT-IR (1) curcumin, (2) β-1,3- Glucan (3) BioGlucumin 109 Plus Hình 3.2.13: Phổ huỳnh quang phổ UV-Vis phức BioGlucumin Plus 110 curcumin trước nano hóa (Cur) Hình 3.2.14: Ảnh FESEM DLS BioGlucumin Plus 111 Hình 3.2.15: Đường chuẩn phổ hấp thụ UV-Vis curcumin hịa tan 111 Hình 3.3.1: Dòng tế bào Hep-G2 tác dụng hợp chất thử nghiệm 112 Hình 3.3.2: Dịng tế bào LU-1 tác dụng hợp chất thử nghiệm 113 Hình 3.3.3 Tác dụng chất thử lên hình thành khối u thực nghiệm 113 thạch mềm (x40) Hình 3.3.4 Ảnh chuột sau tuần tiêm tế bào LLC 118 Hình 3.3.5 Ảnh bóc tách khối u sau tuần tiêm tế bào LLC 120 Hình 3.3.6: Hình ảnh giải phẫu bệnh gan thận thỏ nhóm uống BioGlucumin Plus 126 320 mg/kg/ bán trường diễn 30 ngày, thời điểm 15 ngày sau kết thúc uống Hình 3.3.7 Trọng lượng trung bình nhóm chuột q trình điều trị 127 Hình 3.3.8 Kích thước trung bình khối u nhóm nghiên cứu so với nhóm 127 chứng thời điểm bắt đầu theo dõi (tuần 1) Hình 3.3.9 Kích thước trung bình khối u nhóm q trình thí nghiệm 128 Hình 3.3.10 kích thước khối u nhóm DP (phải) nhỏ rõ rệt so với 128 nhóm chứng (trái) giai đoạn cuối Hình 3.3.11 Tỉ lệ % kích thước khối u nhóm dự phòng điều trị chế phẩm giảm so với nhóm chứng sau lần đo 1, 2, 3, tương ứng 129 tuần 1, 2, sau điều trị Hình 3.3.12 Tỉ lệ % chuột sống/chết nhóm 130 Hình 3.3.13 Chuột thối lui u đùi phải (vùng khoanh trịn) 131 Hình 3.3.14 Tỉ lệ đại thực bào quần thể tế bào đơn nhân lách chuột 131 Hình 3.3.15 Tỉ lệ quần thể tế bào đại thực bào lách chuột nhóm 132 Hình 3.3.16 Nồng độ IFNg dịch phúc mạc chuột 133 Hình 3.4.1: Phổ IR của polysaccarit từ nấm Linh chi 134 Hình 3.4.2: Phổ 13C-NMR LC-GL 135 Hình 3.4.3: Phổ 13C-NMR β-1,3/1,6-glucan nấm Linh chi (Chang cs., 2004) 136 Hình 3.4.4: Phổ IR của polysaccarit từ nấm Hầu thủ 137 Hình 3.4.5: Phổ 13C-NMR polysaccarit từ nấm Hầu thủ 138 Hình 3.4.6: Phổ 13 C NMR β- 1,3/1,6 glucan từ nấm P eryngii (A), P 139 ostreatoroseus (B) (Carbonero cs., 2006) Schizophylum commune (nấm chân chim) (C) (Tabata cs., 1981) Hình 3.4.7: Phổ 13C NMR -1,3/1,6 glucan nấm hầu thủ (Dong & cs., 2006) 139 ... THỰC HIỆN ĐỀ TÀI I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI Tên đề tài: ―Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất β-D-glucan số polysaccarit khác từ sinh khối nấm Linh chi Hầu thủ? ?? Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Lê... loài nấm với curcumin để tạo sản phẩm phục vụ sức khỏe Vì thực đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất β-D-glucan số polysaccarit khác từ sinh khối nấm linh chi hầu thủ? ?? Mục tiêu đề tài: ... nguồn sinh khối ổn định, giàu polysaccarit từ nấm Linh chi nấm Hầu thủ; - Xây dựng đƣợc quy trình chi? ??t polysaccarit ổn định từ nấm Hầu thủ, qui mô 10 kg sinh khối nấm/ mẻ; - Tạo đƣợc 01 sản phẩm