PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN RHODOBACTER Ở VÙNG VEN BIỂN KIÊN GIANG

Còn theo Phòng Tài nguyên và môi trường huyện Phú Quốc, dọc hai bờ sông Dương Đông và các nhánh phụ hiện có trên 10.000 hộ dân cùng 300 cơ sở sản xuất kinh doanh.Gần như toàn bộ nước thải sinh hoạt, sản xuất từ đây đều xả trực tiếp ra dòng sông nàyvà các nhánh suối, rạch hợp lưu tràn xuống đẩy chất thải ra biển, dòng sông Dương Đông tuy ô nhiễm nhưng chưa đến mức chuyển màu đen kịt và bốc mùi thối như năm nay.Theo cáo cáo mới nhất của Phòng Tài nguyên và môi trường huyện Phú Quốc, tình trạng ô nhiễm tại sông Dương Đông do nhiều nguyên nhân. Trong đó có việc cải tạo tăng dung tích hồ chứa Dương Đông làm giảm lượng nước đổ xuống từ thượng nguồn.Tiếp theo là tình trạng biến đổi khí hậu khiến mùa nóng trở nên gay gắt, lượng mưa giảm mạnh so với các năm gần đây, nhưng nguyên nhân chính là do lượng bùn tích tụ dưới đáy sông quá nhiều năm (Lê Thị Hiền, 2015). Đây đều là chất thải sinh hoạt, sản xuất của hàng ngàn hộ dân cùng hàng trăm doanh nghiệp dọc hai bờ sông thải ra hàng chục năm nay.Vì vậy, việc ứng dụng vi khuẩn quang hợp (PSB) vào xử lý ô nhiễm môi trường nước hiện tại là yếu tố cần thiết. Bởi vì, loại vi khuẩn này có lợi và an toàn, phân hủy nhanh các chất thải hữu cơ tích lũy trong đất ao và nước. Có khả năngloại bỏ các chất thải sinh học và các thành phần độc hại ra khỏi đất, ao và nước. Chính vì vậy, đề tài “Phân lập và khảo sát khả năng sinh trưởng cải thiện môi trường nước của hai loài Rhodobacter sphaeroides và Rhodobacter capsulatus tại Kiên Giang” được thực hiện.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KIÊN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN

RHODOBACTER Ở VÙNG VEN BIỂN

KIÊN GIANG

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Ngành: Công nghệ sinh học

Mã số ngành: 7420201

KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN

RHODOBACTER Ở VÙNG VEN BIỂN

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Từ được viết tắt

NCBI National Center for Biotechnology Information

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Bình quân mỗi năm, hàng chục nghìn lượt tàu đánh cá, tàu vận chuyểnhải sản trên ngư trường trong và ngoài tỉnh cập bến, với sản lượng thủy - hảisản qua cảng hàng trăm nghìn tấn cung ứng cho thị trường nội địa và chế biếnxuất khẩu.Người dân ở gần các cảng cá phải đối mặt và sống chung với ônhiễm môi trường, từ nước thải của các nhà máy chế biến thủy sản đổ ra sông

ô nhiễm về mùi, rất nồng nặc nguồn nước ở đây dùng cho sinh hoạt thì giờđây, nước sông đã dần chuyển sang màu đỏ đục, kèm theo mùi hôi tanh(radiocand, 2017)

Còn theo Phòng Tài nguyên và môi trường huyện Phú Quốc, dọc hai bờsông Dương Đông và các nhánh phụ hiện có trên 10.000 hộ dân cùng 300 cơ

sở sản xuất kinh doanh.Gần như toàn bộ nước thải sinh hoạt, sản xuất từ đâyđều xả trực tiếp ra dòng sông nàyvà các nhánh suối, rạch hợp lưu tràn xuốngđẩy chất thải ra biển, dòng sông Dương Đông tuy ô nhiễm nhưng chưa đếnmức chuyển màu đen kịt và bốc mùi thối như năm nay.Theo cáo cáo mới nhấtcủa Phòng Tài nguyên và môi trường huyện Phú Quốc, tình trạng ô nhiễm tạisông Dương Đông do nhiều nguyên nhân Trong đó có việc cải tạo tăng dungtích hồ chứa Dương Đông làm giảm lượng nước đổ xuống từ thượngnguồn.Tiếp theo là tình trạng biến đổi khí hậu khiến mùa nóng trở nên gay gắt,lượng mưa giảm mạnh so với các năm gần đây, nhưng nguyên nhân chính là

do lượng bùn tích tụ dưới đáy sông quá nhiều năm (Lê Thị Hiền, 2015) Đâyđều là chất thải sinh hoạt, sản xuất của hàng ngàn hộ dân cùng hàng trămdoanh nghiệp dọc hai bờ sông thải ra hàng chục năm nay.Vì vậy, việc ứngdụng vi khuẩn quang hợp (PSB) vào xử lý ô nhiễm môi trường nước hiện tại làyếu tố cần thiết Bởi vì, loại vi khuẩn này có lợi và an toàn, phân hủy nhanhcác chất thải hữu cơ tích lũy trong đất ao và nước Có khả năngloại bỏ các chấtthải sinh học và các thành phần độc hại ra khỏi đất, ao và nước Chính vì vậy,

đề tài “Phân lập và khảo sát khả năng sinh trưởng cải thiện môi trường nước

của hai loài Rhodobacter sphaeroides và Rhodobacter capsulatus tại Kiên

Giang” được thực hiện

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1.2.1 Mục tiêu chung

Phân lập và định danh chủng vi khuẩn Rhodobacter ở vùng biển Kiên

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

Phân lập, khảo sát đặc tính sinh hóa, định danh phân tử các chủng vikhuẩn Rhodobacter ở vùng biển Kiên Giang

1.2.3 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Phân lập chủng vi khuẩn Rhodobacter

- Nội dung 2: Khảo sát hàm lượng đường thích hợp

- Nội dung 3: Khảo sát pH thích hợp.

- Nội dung 4: Khảo sát thời gian lên men thích h

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Thời gian: Từ tháng 12/2019 đến tháng 05/2020

Địa điểm: Phòng thí nghiệm của Trung tâm Thực hành Thí nghiệm,Trường Đại học Kiên Giang

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.1 TỔNG QUANG VỀ CHỦNG VI KHUẨN RHODOBACTER

2.1.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn quang hợp

Vi khuẩn quang hợp tía là những dạng sống đầu tiên trên Trái đất.Chúng là những sinh vật vi sinh vật đơn bào có vai trò quan trọng trong việcduy trì sự sống Vi khuẩn quang hợp tía thuộc nhóm prokaryote, là các tế bàogram âm, đơn bào, có các dạng cầu, xoắn, hình que ngắn, hình phẩy… đứngriêng rẽ hoặc thành chuỗi Các loài vi khuẩn quang hợp tía đều sinh sản bằngcách nhân đôi, một số loài sinh sản bằng cách nảychồi Chúng có khả năngchuyển hóa năng lượng mặt trời thành năng lượng hóa học bởi quá trình quanghợp kỵ khí Sắc tố quang hợp chính là bacteriochlorophyll a hoặc b Cơ quan

quang hợp là màng quang hợp được gắn với màng tế bào (Michal et al., 2006).

Năm 1907, Molisch là người ñầu tiên phát hiện ra các vi khuẩn có sắc

tố màu đỏ và có khả năng quang hợp, nên ông gọi vi khuẩn quang hợp

này là Rhodobacteria Nhóm này gồm hai họ là Thiorhodaceae (là những vi

khuẩn tía có khả năng hình thành giọt “S” bên trong tế bào) và

Athiorhodaceae (là những vi khuẩn tía không có khả năng hình thành giọt

“S” bên trong tế bào)

Nhóm vi khuẩn có khả năng quang hợp nhờ có sắc tố lục Chất diệp lục

vi khuẩn khác với chất diệp lục của thực vật VKQH không sử dụng nước làmnguồn hidro như thực vật và không tạo ra sản phẩm cuối cùng là oxi Chúng

sử dụng nguồn hidro là sunfit tiosunfat, hidro tự do, chất hữu cơ và sản sinh ranhiều sản phẩm phụ dạng oxi hóa (Stefania et al., 2017)

Ðặc điểm của loại vi khuẩn này là tính thích ứng mạnh, bất kể là trongnước biển hay trong nước ngọt, trong những điều kiện khác nhau có ánh sáng

mà không có oxy hoặc không có ánh sáng mà có oxy đều có thể lơị dụng chấthữu cơ để phát triển Trong điều kiện không có oxy, có ánh sáng, có thể lợidụng các sunfit, phân tử H hoặc vật hữu cơ khác làm thành dioxide carbon

CO2 cố định tiến hành tác dụng quang hợp; trong điều kiện có oxy và không cóánh sáng chúng có thể lợi dụng vật hữu cơ như axit béo cấp thấp tạo nguồncarbon để tiến hành tác dụng quang hợp (Stefania et al., 2017)

Rhodobacter là một loại vi khuẩn được chọn đã được sử dụng trong quá

khứ để điều tra quá trình chuyển hóa quang hợp của vi khuẩn Chúng có thểnhanh chóng phát triển trong một số chế độ quang hợp sáng và tối Do khảnăng sử dụng nitrat làm chất nhận điện tử và amoni làm chất nền, vai trò của

Rhodobacter có thể được kiểm tra trong cả quá trình khử nitơ, khử nitri và không chỉ về khả năng khử nitrat Rhodobacter ổn định để lưu trữ lâu dài trong

điều kiện thích hợp, làm cho nó rất thuận lợi cho sử dụng công nghiệp

(Crosset et al., 2011).

2.1.2 Đặc điểm sinh thái học của vi khuẩn quang hợp

Vi khuẩn quang hợp là nhóm vi khuẩn quang dưỡng, sống kỵ khí hoặc kỵkhí tùy tiện trong môi trường có ánh sáng Gồm vi khuẩn quang hợp tía lưuhuỳnh và vi khuẩn quang hợp tía không lưu huỳnh Chúng là các vi sinh vậtđiển hình, rất phổ biến ở nước ngọt cũng như nước mặn, thường cư trú nhiềutrên bề mặt các ruộng lúa, sông, đại dương và bùn các ao đầm tù, có nhiều bùncặn các xác động, thực vật

Rhodobacter thường được tìm thấy trong các thủy vực nước ngọt hoặc

nước mặn có chứa hàm lượng sulfua cao Ở các độ sâu khác nhau có thể thunhận được các loài khác nhau Ngoài ra còn có thể gặp họ vi khuẩn này ở một

số thủy vực có điều kiện cực trị như các thủy vực kiềm hóa hoặc các suối nướcnóng

Hệ sinh thái của Rhodobacter rất đa dạng, có thể gặp chúng trong các ao

hồ tù đọng, các vùng đầm nước lợ hoặc mặn Nơi sống của chúng thường làcác thủy vực có hàm lượng chất hữu cơ cao, hàm lượng oxy hòa tan và lưuhuỳnh thấp Ở một số vùng đất acid có thể gặp các chủng thuộc loài

Rhodopseudomonas acidophila, Rhodopseudomonaspalustris.

2.1.3 Đặc điểm phân loại

Các đặc tính hình thái, thành phần hóa học tế bào và đặc tính sinh lí đềurất quan trọng trong việc định danh vi khuẩn quang dưỡng Phổ hấp thucực đại của huyền phù tế bào nguyên vẹn cho thông tin về loại diệp lụckhuẩn chính Sự hiện hiện đa dạng của bacterichlorophyl (bcl) là yếu tốhữu ích trong phân loại vi khuẩn quang hợp Hầu hết các loài vi khuẩn quanghợp tía đều chỉ có bchl a(Truper and Pfening, 1992)

Ở nhiều loài, màu sắc huyền phù tế bào cho phép xác định các loạicarotenoid chính Spirilloxanthin là thành phần chính cho màu sắc đỏ vàhồng nếu có thêm rhodopin thì màu chuyển sang sắc nâu, okenon màu đỏ tía,

và rhodoinal tạo màu tím tía Carotenoid loại spheroiden cho gam màu từnâu vàng đến đỏ nâu (màu được hình thành tùy thuộc vào các dẫn xuất bịoxy hóa khi có sự hiện diện của oxy) và màu nâu xanh khi trong môitrường có thể oxy hóa khử mạnh (Imhoff and Truper, 1992; Imhoff,1992) Kết quả phân tích ñịnh lượng sắc tố của một mẫu tự nhiên có thểphản ánh mối liên hệ khá quan trọng của nhiều nhóm vi sinh vật quangdưỡng trong môi trường (Korthals and Steenbergen, 1985)

Isoprenoid quinone có vai trò quan trọng trong chuỗi truyền điện tử.VKQH tổng hợp nhiều loại quinone khác nhau ở chiều dài và độ bão hòa củachuỗi polypreinyl Đ ặc điểm đa dạng này của quinone ở nhóm vi khuẩntía không lưu huỳnh có giá trị cao trong phân loại Nhu cầu về vitamin và đặctính biến dưỡng nguồn cacbon là yêu cầu rất quan trọng trong việc định danh

một chủng thuộc họ Rhodospirillaceae Giống và loài thường được phân biệt

dựa trên sự so sánh nhiều đặc tịnh về hình dang, kích thước tế bào, kiểutiêm mao, cấu trúc màng trong tế bào chất, thành phần sắc tố, tỉ lệ cácbase của DNA và các đặc tính sinh lí (như khả năng sử dụng hợp chấtnito, cabon, khả năng hô hấp hiếu khí và kị khí trong tối, tính mẫn cảm vớisulfide, nhu cầu NaCl, nhiệt độ, pH), đặc tính sinh thái (môi trường tự nhiên

mà vi sinh vật thường phân bố) (Truper and Pfening, 1992) Những thôngtin về kích thước và trình tự cytochrome c, cấu trúc lipopolysaccharid và

trình tự gen mã hóa rRNA 16S được dùng để xác định mối quan hệ tiếnhóa giữa các loài Lai phân tử DNA –DNA là tiêu chí quan trọng để phân biệtcác loài gần nhau Việc xác ñịnh thành phần GC của DNA có vai trò quantrọng để mô tả loài(Debont et al., 1981)

2.2 ĐẶC ĐIỂM QUANG HỢP VÀ CƠ CHẾ ĐIỀU HÒA TRAO ĐỔI CHẤT

2.2.1 Màng quang hợp

Ở vi khuẩn quang hợp ngoài màng cytoplasma (CM) còn có thêm hệthống màng Intracytoplasma (ICM) có hình thái đặc biệt ( D r e w s ,

1 9 8 1 ) Người ta cho rằng ICM có nguồn gốc từ CM và được gắn với CM.

Hầu hết trong vi khuẩn quang hợp kí khí, ánh sáng và hàm lượng oxy có liênquan đến sự hình thành ICM, ví dụ ICM được cảm ứng hình thành khi cóhàm lượng oxy thấp, ICM sẽ phát triển rộng khắp trong pha sinh trưởng kịkhí Sắc tố quang hợp của vi khuẩn quang hợp được gắn vào trong màngICM hoặc trong màng CM Khi tế bào chứa hàm lượng các sắc tố quanghợp cao, màng gập sâu vào phía trong vùng sinh chất Các kiểu gập khácnhau mang tính chất đặc trưng cho loài và được chia thành các dạng màng:dạng ống, dạng túi (Dutton, 1971)

2.2.2 Sắc tố quang hợp

Đây là nhóm sắc tố quang hợp chính ở vi khuẩn quang hợp Hiệnnay, bacteriochlorophyll được chia thành 5 nhóm: a, b,c d, e dựa vào sựkhác nhau về cấu trúc phân tử và cực đại của phổ hấp thu trong vùng ánhsáng đỏ thể hiện ở Bảng 2.1 Nhóm vi khuẩn quang hợp tía có chứa hailoại bacteriochlorophyll a or b, nhóm vi khuẩn quang hợp màu xanh chứachủ yếu nhóm bacteriochlorophyll c, d or e Trong khi đó, ở vi khuẩn tía

không lưu huỳnh Rhodospirillum chỉ có bacteriochlorophyll a (Harashima

et al., 1980; Yurkov and Gemerden, 1993)

Bảng 2.1 Phổ cực đại hấp thu của bacteriochlorophyll

Bacteriochlorophyll Phổ cực đại hấp thu (nm)

Trong tế bào Chiết trong aceton Bchl a 375, 590, 805, 830-911 385, 579, 680, 771

Giống như cholorphyll ở thực vật, Bchl bao gồm một vòng pyrol và

7 gốc hydrocacbon Sự khác biệt giữa các gốc R dẫn đến sự khác biệt giữacác loại Bchl Khi so sánh hàm lượng của Bchl trong hai nhóm vikhuẩn quang hợp kị khí và vi khuẩn quang hợp hiếu khí thì hàmlượng Bchl trong nhóm vi khuẩn quang hợp kị khí luôn cao hơn Ví

dụ, trong tế bào của loài vi khuẩn quang hợp R.sphaeroides có chứa

khoảng 20 nmol Bchl/mg trọng lượng khô tế bào Trong khi đó, hàm

lượng Bchl ở các loài vi khuẩn quang hợp hiếu khí như: E.longus là 2.0 nmol/mg trọng lượng khô của tế bào, R.hydrolyticum là 1 – 4 nmol/

mg protein, A.rubrum là 0,7 nmol/mg trọng lượng khô tế bào Tạo nên

màu sắc của các chủng vi khuẩn quang hợp không chỉ dobacteriochlorophyll mà còn do carotenoid trong tế bào của chúng(Harashima et al., 1980; Yurkov and Gemerden, 1993)

2.2.3 Carotenoid

Carotenoid bao gồm một lớp các sắc tố được tìm thấy trong các thểprokaryote quang và không quang tự dưỡng và các sinh vật eukaryote Chứcnăng của carotenoid là bảo vệ tế bào không bị phá hủy bởi phản ứngquang oxy hóa, hấp thụ ánh sáng và là một thành phần cấu trúc sắc tốquang hợp trong vi khuẩn quang hợp (Cogdell et al., 1996)

Sự phân biệt màu sắc của các chủng vi khuẩn quang hợp trong tự nhiên

là do sự khác nhau về thành phần các bacteriochlorophyll và carotenoid.Carotenoid được chia thành 5 nhóm dựa vào cấu trúc phân tử và quangphổ hấp thụ thể hiện ở Bảng 2.2 Khoảng 20 carotenoid khác nhau đã được

tìm thấy trong loài E ramosum màu đỏ cam, trong đó có 10 loại đã được

tinh khiết và cấu trúc đặc trưng

Bảng 2.2 Các nhóm carotenoid trong tế bào vi khuẩn quang hợp

Loài R thiosulfatophilus chứa chủ yếu là hai sắc tố đỏ phân cực là

C30 carotene-dioate t (4,4 '-diapocarotene-4, 4'-dioate) và ester diglucosyltương ứng (di [β-d-glucopyranosyl] -4,4 - diapocarotene-4, 4'- dioate).Chúng chiếm tới 95% trong tổng số carotenoid của tế bào Carotenoid

được tìm thấy chủ yếu trong loài vi khuẩn quang hợp tía Rhodobacter là

spheroidenone Carotenoid nhóm spirilloxanthin được tìm thấy chủ yếu

trong loài Rhodospirillum rubrum và một số vi khuẩn quang hợp khác Như

vậy: các sắc tố hấp thụ ánh sáng chính trong tế bào vi khuẩn quang hợp

là Bchl và carotenoids Những sắc tố này được gắn proteins màng bằng liênkết không cùng hóa trị tạo thành trung tâm phản ứng quang hóa(photochemical reaction center) và hệ thống thu nhận ánh sáng (LH – lightharvesting) (Cogdell et al., 1996)

Các vi khuẩn quang hợp có một hệ thống LH tương đối đơn giản baogồm một loại protein ăng – ten (LHI) liên kết chặt chẽ với trung tâm phảnứng RC, và ở nhiều loài một hoặc nhiều khu phức hợp ăng-ten ngoại

vi (LHII) tất cả đều được nằm trong ICM Lượng tử ánh sáng được tế bàothu nhận qua hệ thống ăng ten Từ đây năng lượng ánh sáng được chuyểnvào trung tâm phản ứng Trung tâm phản ứng của vi khuẩn quang hợpđược cấu tạo từ 3 tiểu phần protein (L, M và H), cùng với các cofactors: 4phân tử Bchls, 2 phân tử bacteriopheophytins, 2 phân tử quoinones, vàmột phân tử nonheme – high spin Fe2+ Tâm phản ứng nằm trong mạch

vận chuyển điện tử Trong mạch chuyển ñiện tử này xuất hiện dòng điện tửkhi ánh sáng gây ra quá trình tách điện tích ở tâm phản ứng(Drews, 1981).

2.2.4 Sự chuyển hóa các hợp chất vô cơ lưu huỳnh

Đa số các loài vi khuẩn quang hợp đều có thể sử dụng các hợp chất khửcủa lưu huỳnh làm nguồn cho điện tử để cố định CO2 Quá trình oxy hóa cáchợp chất khử của lưu huỳnh có sự tham gia của nhiều enzyme và được thựchiện theo nhiều cách khác nhau Trong đó con đường oxy hóa Sox (Hình2.1) được coi là quan trọng nhất Phức hợp Sox là phức hợp nhiều enzymeperiplasmic thiosulphate – oxidizing, lần đầu tiên được tìm thấy trong

Paracoccus (Pcs.) versutus và Pcs pantotrophus Trong Pcs Pantotrophus,

phức hợp Sox rất cần cho quá trình oxy hóa thiosulfate trong điều kiện invivo và xúc tác quá trình khử cặp cytochrome c coupled thành dạng oxyhóa của thiosulfate, sulfide, sulfite và hợp chất sulfua cơ bản trong điềukiện in vitro

Hình 2.1 Hệ thống Sox trong vi khuẩn tía không lưu huỳnh (A) và vi

khuẩn tía lưu huỳnh (B)

Mức độ oxy hóa các hợp chất của lưu huỳnh ở các loài khác nhau làkhác nhau Nhóm vi khuẩn quang hợp tía lưu huỳnh tạo ra sản phẩmtrung gian là các giọt lưu huỳnh được tích lũy bên trong tế bào khi sinhtrưởng quang tự dưỡng với các hợp chất khử của lưu huỳnh làm nguồn chođiện tử Nhóm vi khuẩn tía không lưu huỳnh có khả năng oxi hóa các hợp