PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN RHODOBACTER Ở VÙNG VEN BIỂN KIÊN GIANG

Còn theo Phòng Tài nguyên và môi trường huyện Phú Quốc, dọc hai bờ sông Dương Đông và các nhánh phụ hiện có trên 10.000 hộ dân cùng 300 cơ sở sản xuất kinh doanh.Gần như toàn bộ nước thải sinh hoạt, sản xuất từ đây đều xả trực tiếp ra dòng sông nàyvà các nhánh suối, rạch hợp lưu tràn xuống đẩy chất thải ra biển, dòng sông Dương Đông tuy ô nhiễm nhưng chưa đến mức chuyển màu đen kịt và bốc mùi thối như năm nay.Theo cáo cáo mới nhất của Phòng Tài nguyên và môi trường huyện Phú Quốc, tình trạng ô nhiễm tại sông Dương Đông do nhiều nguyên nhân. Trong đó có việc cải tạo tăng dung tích hồ chứa Dương Đông làm giảm lượng nước đổ xuống từ thượng nguồn.Tiếp theo là tình trạng biến đổi khí hậu khiến mùa nóng trở nên gay gắt, lượng mưa giảm mạnh so với các năm gần đây, nhưng nguyên nhân chính là do lượng bùn tích tụ dưới đáy sông quá nhiều năm (Lê Thị Hiền, 2015). Đây đều là chất thải sinh hoạt, sản xuất của hàng ngàn hộ dân cùng hàng trăm doanh nghiệp dọc hai bờ sông thải ra hàng chục năm nay.Vì vậy, việc ứng dụng vi khuẩn quang hợp (PSB) vào xử lý ô nhiễm môi trường nước hiện tại là yếu tố cần thiết. Bởi vì, loại vi khuẩn này có lợi và an toàn, phân hủy nhanh các chất thải hữu cơ tích lũy trong đất ao và nước. Có khả năngloại bỏ các chất thải sinh học và các thành phần độc hại ra khỏi đất, ao và nước. Chính vì vậy, đề tài “Phân lập và khảo sát khả năng sinh trưởng cải thiện môi trường nước của hai loài Rhodobacter sphaeroides và Rhodobacter capsulatus tại Kiên Giang” được thực hiện.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KIÊN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN RHODOBACTER Ở VÙNG VEN BIỂN KIÊN GIANG ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Công nghệ sinh học Mã số ngành: 7420201 Kiên Giang - năm 2019 KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN RHODOBACTER Ở VÙNG VEN BIỂN KIÊN GIANG ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số ngành: 7420201 Kiên Giang - năm 2020 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Từ được viết tắt PSB Phototrophic Bacteria CFU Colony Forming Unit DNA Deoxyribose Nucleic Acid NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribose Nucleic Acid rpm Revolutions Per Minute CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bình quân năm, hàng chục nghìn lượt tàu đánh cá, tàu vận chuyển hải sản ngư trường tỉnh cập bến, với sản lượng thủy - hải sản qua cảng hàng trăm nghìn cung ứng cho thị trường nội địa chế biến xuất khẩu.Người dân gần cảng cá phải đối mặt sống chung với ô nhiễm môi trường, từ nước thải nhà máy chế biến thủy sản đổ sông ô nhiễm mùi, nồng nặc nguồn nước dùng cho sinh hoạt đây, nước sông dần chuyển sang màu đỏ đục, kèm theo mùi (radiocand, 2017) Còn theo Phòng Tài ngun mơi trường huyện Phú Quốc, dọc hai bờ sông Dương Đông nhánh phụ có 10.000 hộ dân 300 sở sản xuất kinh doanh.Gần toàn nước thải sinh hoạt, sản xuất từ xả trực tiếp dòng sông nàyvà nhánh suối, rạch hợp lưu tràn xuống đẩy chất thải biển, dòng sơng Dương Đơng ô nhiễm chưa đến mức chuyển màu đen kịt bốc mùi thối năm nay.Theo cáo cáo Phòng Tài ngun mơi trường huyện Phú Quốc, tình trạng nhiễm sơng Dương Đơng nhiều nguyên nhân Trong có việc cải tạo tăng dung tích hồ chứa Dương Đơng làm giảm lượng nước đổ xuống từ thượng nguồn.Tiếp theo tình trạng biến đổi khí hậu khiến mùa nóng trở nên gay gắt, lượng mưa giảm mạnh so với năm gần đây, nguyên nhân lượng bùn tích tụ đáy sông nhiều năm (Lê Thị Hiền, 2015) Đây chất thải sinh hoạt, sản xuất hàng ngàn hộ dân hàng trăm doanh nghiệp dọc hai bờ sơng thải hàng chục năm nay.Vì vậy, việc ứng dụng vi khuẩn quang hợp (PSB) vào xử lý ô nhiễm môi trường nước yếu tố cần thiết Bởi vì, loại vi khuẩn có lợi an toàn, phân hủy nhanh chất thải hữu tích lũy đất ao nước Có khả năngloại bỏ chất thải sinh học thành phần độc hại khỏi đất, ao nước Chính vậy, đề tài “Phân lập khảo sát khả sinh trưởng cải thiện môi trường nước hai loài Rhodobacter sphaeroides Rhodobacter capsulatus Kiên Giang” thực 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1.2.1 Mục tiêu chung Phân lập định danh chủng vi khuẩn Rhodobacter vùng biển Kiên Giang 1.2.2 Mục tiêu cụ thể Phân lập, khảo sát đặc tính sinh hóa, định danh phân tử chủng vi khuẩn Rhodobacter vùng biển Kiên Giang 1.2.3 Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Phân lập chủng vi khuẩn Rhodobacter - Nội dung 2: Khảo sát hàm lượng đường thích hợp - Nội dung 3: Khảo sát pH thích hợp - Nội dung 4: Khảo sát thời gian lên men thích h 1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU Thời gian: Từ tháng 12/2019 đến tháng 05/2020 Địa điểm: Phòng thí nghiệm Trung tâm Thực hành Thí nghiệm, Trường Đại học Kiên Giang CHƯƠNG TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.1 TỔNG QUANG VỀ CHỦNG VI KHUẨN RHODOBACTER 2.1.1 Giới thiệu chung vi khuẩn quang hợp Vi khuẩn quang hợp tía dạng sống Trái đất Chúng sinh vật vi sinh vật đơn bào có vai trò quan trọng việc trì sống Vi khuẩn quang hợp tía thuộc nhóm prokaryote, tế bào gram âm, đơn bào, có dạng cầu, xoắn, hình que ngắn, hình phẩy… đứng riêng rẽ thành chuỗi Các lồi vi khuẩn quang hợp tía sinh sản cách nhân đơi, số lồi sinh sản cách nảychồi Chúng có khả chuyển hóa lượng mặt trời thành lượng hóa học q trình quang hợp kỵ khí Sắc tố quang hợp bacteriochlorophyll a b Cơ quan quang hợp màng quang hợp gắn với màng tế bào (Michal et al., 2006) Năm 1907, Molisch người ñầu tiên phát vi khuẩn có sắc tố màu đỏ có khả quang hợp, nên ơng gọi vi khuẩn quang hợp Rhodobacteria Nhóm gồm hai họ Thiorhodaceae (là vi khuẩn tía có khả hình thành giọt “S” bên tế bào) Athiorhodaceae (là vi khuẩn tía khơng có khả hình thành giọt “S” bên tế bào) Nhóm vi khuẩn có khả quang hợp nhờ có sắc tố lục Chất diệp lục vi khuẩn khác với chất diệp lục thực vật VKQH không sử dụng nước làm nguồn hidro thực vật không tạo sản phẩm cuối oxi Chúng sử dụng nguồn hidro sunfit tiosunfat, hidro tự do, chất hữu sản sinh nhiều sản phẩm phụ dạng oxi hóa (Stefania et al., 2017) Ðặc điểm loại vi khuẩn tính thích ứng mạnh, nước biển hay nước ngọt, điều kiện khác có ánh sáng mà khơng có oxy khơng có ánh sáng mà có oxy lơị dụng chất hữu để phát triển Trong điều kiện khơng có oxy, có ánh sáng, lợi dụng sunfit, phân tử H vật hữu khác làm thành dioxide carbon CO2 cố định tiến hành tác dụng quang hợp; điều kiện có oxy khơng có ánh sáng chúng lợi dụng vật hữu axit béo cấp thấp tạo nguồn carbon để tiến hành tác dụng quang hợp (Stefania et al., 2017) Rhodobacter loại vi khuẩn chọn sử dụng khứ để điều tra q trình chuyển hóa quang hợp vi khuẩn Chúng nhanh chóng phát triển số chế độ quang hợp sáng tối Do khả sử dụng nitrat làm chất nhận điện tử amoni làm chất nền, vai trò Rhodobacter kiểm tra trình khử nitơ, khử nitri không khả khử nitrat Rhodobacter ổn định để lưu trữ lâu dài điều kiện thích hợp, làm cho thuận lợi cho sử dụng công nghiệp (Crosset et al., 2011) 2.1.2 Đặc điểm sinh thái học vi khuẩn quang hợp Vi khuẩn quang hợp nhóm vi khuẩn quang dưỡng, sống kỵ khí kỵ khí tùy tiện mơi trường có ánh sáng Gồm vi khuẩn quang hợp tía lưu huỳnh vi khuẩn quang hợp tía khơng lưu huỳnh Chúng vi sinh vật điển hình, phổ biến nước nước mặn, thường cư trú nhiều bề mặt ruộng lúa, sông, đại dương bùn ao đầm tù, có nhiều bùn cặn xác động, thực vật Rhodobacter thường tìm thấy thủy vực nước nước mặn có chứa hàm lượng sulfua cao Ở độ sâu khác thu nhận lồi khác Ngồi gặp họ vi khuẩn số thủy vực có điều kiện cực trị thủy vực kiềm hóa suối nước nóng Hệ sinh thái Rhodobacter đa dạng, gặp chúng ao hồ tù đọng, vùng đầm nước lợ mặn Nơi sống chúng thường thủy vực có hàm lượng chất hữu cao, hàm lượng oxy hòa tan lưu huỳnh thấp Ở số vùng đất acid gặp chủng thuộc loài Rhodopseudomonas acidophila, Rhodopseudomonaspalustris 2.1.3 Đặc điểm phân loại Các đặc tính hình thái, thành phần hóa học tế bào đặc tính sinh lí quan trọng việc định danh vi khuẩn quang dưỡng Phổ hấp thu cực đại huyền phù tế bào nguyên vẹn cho thông tin loại diệp lục khuẩn Sự hiện đa dạng bacterichlorophyl (bcl) yếu tố hữu ích phân loại vi khuẩn quang hợp Hầu hết loài vi khuẩn quang hợp tía có bchl a (Truper and Pfening, 1992) Ở nhiều loài, màu sắc huyền phù tế bào cho phép xác định loại carotenoid Spirilloxanthin thành phần cho màu sắc đỏ hồng có thêm rhodopin màu chuyển sang sắc nâu, okenon màu đỏ tía, rhodoinal tạo màu tím tía Carotenoid loại spheroiden cho gam màu từ nâu vàng đến đỏ nâu (màu hình thành tùy thuộc vào dẫn xuất bị oxy hóa có diện oxy) màu nâu xanh mơi trường oxy hóa khử mạnh (Imhoff and Truper, 1992; Imhoff, 1992) Kết phân tích định lượng sắc tố mẫu tự nhiên phản ánh mối liên hệ quan trọng nhiều nhóm vi sinh vật quang dưỡng môi trường (Korthals and Steenbergen, 1985) Isoprenoid quinone có vai trò quan trọng chuỗi truyền điện tử VKQH tổng hợp nhiều loại quinone khác chiều dài độ bão hòa chuỗi polypreinyl Đ ặc điểm đa dạng quinone nhóm vi khuẩn tía khơng lưu huỳnh có giá trị cao phân loại Nhu cầu vitamin đặc tính biến dưỡng nguồn cacbon yêu cầu quan trọng việc định danh chủng thuộc họ Rhodospirillaceae Giống loài thường phân biệt dựa so sánh nhiều đặc tịnh hình dang, kích thước tế bào, kiểu tiêm mao, cấu trúc màng tế bào chất, thành phần sắc tố, tỉ lệ base DNA đặc tính sinh lí (như khả sử dụng hợp chất nito, cabon, khả hơ hấp hiếu khí kị khí tối, tính mẫn cảm với sulfide, nhu cầu NaCl, nhiệt độ, pH), đặc tính sinh thái (môi trường tự nhiên mà vi sinh vật thường phân bố) (Truper and Pfening, 1992) Những thơng tin kích thước trình tự cytochrome c, cấu trúc lipopolysaccharid trình tự gen mã hóa rRNA 16S dùng để xác định mối quan hệ tiến hóa lồi Lai phân tử DNA –DNA tiêu chí quan trọng để phân biệt loài gần Việc xác định thành phần GC DNA có vai trò quan trọng để mơ tả lồi (Debont et al., 1981) 2.2 ĐẶC ĐIỂM QUANG HỢP VÀ CƠ CHẾ ĐIỀU HÒA TRAO ĐỔI CHẤT 2.2.1 Màng quang hợp Ở vi khuẩn quang hợp ngồi màng cytoplasma (CM) có thêm hệ thống màng Intracytoplasma (ICM) có hình thái đặc biệt ( D r e w s , ) Người ta cho ICM có nguồn gốc từ CM gắn với CM Hầu hết vi khuẩn quang hợp kí khí, ánh sáng hàm lượng oxy có liên quan đến hình thành ICM, ví dụ ICM cảm ứng hình thành có hàm lượng oxy thấp, ICM phát triển rộng khắp pha sinh trưởng kị khí Sắc tố quang hợp vi khuẩn quang hợp gắn vào màng ICM màng CM Khi tế bào chứa hàm lượng sắc tố quang hợp cao, màng gập sâu vào phía vùng sinh chất Các kiểu gập khác mang tính chất đặc trưng cho lồi chia thành dạng màng: dạng ống, dạng túi (Dutton, 1971) 2.2.2 Sắc tố quang hợp Đây nhóm sắc tố quang hợp vi khuẩn quang hợp Hiện nay, bacteriochlorophyll chia thành nhóm: a, b,c d, e dựa vào khác cấu trúc phân tử cực đại phổ hấp thu vùng ánh sáng đỏ thể Bảng 2.1 Nhóm vi khuẩn quang hợp tía có chứa hai loại bacteriochlorophyll a or b, nhóm vi khuẩn quang hợp màu xanh chứa chủ yếu nhóm bacteriochlorophyll c, d or e Trong đó, vi khuẩn tía khơng lưu huỳnh Rhodospirillum có bacteriochlorophyll a (Harashima et al., 1980; Yurkov and Gemerden, 1993) Bảng 2.1 Phổ cực đại hấp thu bacteriochlorophyll Bacteriochlorophyll Phổ cực đại hấp thu (nm) Trong tế bào Chiết aceton Bchl a 375, 590, 805, 830-911 385, 579, 680, 771 Bchl b 400, 605, 986-1035 368,407, 582, 795 Bchl c 457-460, 745-755 433, 663 Bchl d 450, 715-745 425, 654 Bchl e 460-462, 710-725 459, 468 835-850, Giống cholorphyll thực vật, Bchl bao gồm vòng pyrol gốc hydrocacbon Sự khác biệt gốc R dẫn đến khác biệt loại Bchl Khi so sánh hàm lượng Bchl hai nhóm vi khuẩn quang hợp kị khí vi khuẩn quang hợp hiếu khí hàm lượng Bchl nhóm vi khuẩn quang hợp kị khí ln cao Ví dụ, tế bào lồi vi khuẩn quang hợp R.sphaeroides có chứa khoảng 20 nmol Bchl/mg trọng lượng khơ tế bào Trong đó, hàm lượng Bchl lồi vi khuẩn quang hợp hiếu khí như: E.longus 2.0 nmol/mg trọng lượng khô tế bào, R.hydrolyticum – nmol/mg protein, A.rubrum 0,7 nmol/mg trọng lượng khô tế bào Tạo nên màu sắc chủng vi khuẩn quang hợp không bacteriochlorophyll mà carotenoid tế bào chúng (Harashima et al., 1980; Yurkov and Gemerden, 1993) 2.2.3 Carotenoid Carotenoid bao gồm lớp sắc tố tìm thấy thể prokaryote quang không quang tự dưỡng sinh vật eukaryote Chức carotenoid bảo vệ tế bào không bị phá hủy phản ứng quang oxy hóa, hấp thụ ánh sáng thành phần cấu trúc sắc tố quang hợp vi khuẩn quang hợp (Cogdell et al., 1996) 10 Loài R thiosulfatophilus chứa chủ yếu hai sắc tố đỏ phân cực C30 carotene-dioate t (4,4 '-diapocarotene-4, 4'-dioate) ester diglucosyl tương ứng (di [β-d-glucopyranosyl] -4,4 - diapocarotene-4, 4'- dioate) Chúng chiếm tới 95% tổng số carotenoid tế bào Carotenoid tìm thấy chủ yếu lồi vi khuẩn quang hợp tía Rhodobacter spheroidenone Carotenoid nhóm spirilloxanthin tìm thấy chủ yếu lồi Rhodospirillum rubrum số vi khuẩn quang hợp khác Như vậy: sắc tố hấp thụ ánh sáng tế bào vi khuẩn quang hợp Bchl carotenoids Những sắc tố gắn proteins màng liên kết khơng hóa trị tạo thành trung tâm phản ứng quang hóa (photochemical reaction center) hệ thống thu nhận ánh sáng (LH – light harvesting) (Cogdell et al., 1996) Các vi khuẩn quang hợp có hệ thống LH tương đối đơn giản bao gồm loại protein ăng – ten (LHI) liên kết chặt chẽ với trung tâm phản ứng RC, nhiều loài nhiều khu phức hợp ăng-ten ngoại vi (LHII) tất nằm ICM Lượng tử ánh sáng tế bào thu nhận qua hệ thống ăng ten Từ lượng ánh sáng chuyển vào trung tâm phản ứng Trung tâm phản ứng vi khuẩn quang hợp cấu tạo từ tiểu phần protein (L, M H), với cofactors: phân tử Bchls, phân tử bacteriopheophytins, phân tử quoinones, phân tử nonheme – high spin Fe2+ Tâm phản ứng nằm mạch 12 vận chuyển điện tử Trong mạch chuyển điện tử xuất dòng điện tử ánh sáng gây q trình tách điện tích tâm phản ứng (Drews, 1981) 2.2.4 Sự chuyển hóa hợp chất vơ lưu huỳnh Đa số lồi vi khuẩn quang hợp sử dụng hợp chất khử lưu huỳnh làm nguồn cho điện tử để cố định CO2 Q trình oxy hóa hợp chất khử lưu huỳnh có tham gia nhiều enzyme thực theo nhiều cách khác Trong đường oxy hóa Sox (Hình 2.1) coi quan trọng Phức hợp Sox phức hợp nhiều enzyme periplasmic thiosulphate – oxidizing, lần tìm thấy Paracoccus (Pcs.) versutus Pcs pantotrophus Trong Pcs Pantotrophus, phức hợp Sox cần cho q trình oxy hóa thiosulfate điều kiện in vivo xúc tác trình khử cặp cytochrome c coupled thành dạng oxy hóa thiosulfate, sulfide, sulfite hợp chất sulfua điều kiện in vitro Hình 2.1 Hệ thống Sox vi khuẩn tía khơng lưu huỳnh (A) vi khuẩn tía lưu huỳnh (B) Mức độ oxy hóa hợp chất lưu huỳnh lồi khác khác Nhóm vi khuẩn quang hợp tía lưu huỳnh tạo sản phẩm trung gian giọt lưu huỳnh tích lũy bên tế bào sinh trưởng quang tự dưỡng với hợp chất khử lưu huỳnh làm nguồn cho điện tử Nhóm vi khuẩn tía khơng lưu huỳnh có khả oxi hóa hợp chất khử lưu huỳnh khơng có khả tích lũy giọt lưu huỳnh tế bào (Collins and Jones, 1981) 13 2.2.5 Cơ chế hòa q trình trao đổi chất Trong điều kiện có ánh sáng, vi khuẩn quang hợp tiến hành quang hợp để thu nhận lượng sử dụng cho hoạt động sống tế bào Phương trình tổng quát trình quang hợp: CO2 + 2H2 A + hv [ CH2O]n + 2A + H2O Ở tảo hay thực vật bậc cao: H2O đóng vai trò H2A Ở VKQH: H2A chất hữu đơn giản, hợp chất khử lưu huỳnh hydro phân tử Trong đó, chất hữu vừa đóng vai trò làm chất cho điện tử, vừa làm nguồn cacbon trình quang hợp dị dưỡng Ở sáng, tất loài vi khuẩn quang hợp Rhodobacter ưa thích điều kiện sinh trưởng dị dưỡng, sử dụng chất hữu đơn vừa làm nguồn cho điện tử, vừa làm nguồn C Nhiều đại diện họ vi khuẩn có khả sinh trưởng quang tự dưỡng cacbon với có mặt nguồn cho điện tử hợp chất khử lưu huỳnh hay H2 Đa số đại diện loài biết họ vi khuẩn có khả sinh trưởng điều kiện vi hiếu khí tối theo kiểu hóa dưỡng, số lồi sinh trưởng tốt điều kiện vi hiếu khí tối Tuy nhiên, khả chịu oxy hóa chủng khác Trong điều kiện sinh trưởng quang hợp, khả dinh dưỡng hô hấp loài bị ức chế ánh sáng Ở điều kiện kỵ khí tối, số lồi Rhodobacter capsulatus, Rhodospirillum rubrum tồn nhờ q trình trao đổi chất theo kiểu hơ hấp kị khí với có mặt chất nhận điện tử nitrat, nitrit, NO,dimethylsulfua, hay trimethylamin N – oxit Khi quang hợp, chu trình Calvin, hệ thống cố định nito, hệ thống DMSO/DMSOR tế bào sử dụng để trì oxy hóa khử Các phản ứng chu trình Calvin cho phép CO2 có chức thu nhận lực khử dư thừa trao ñổi chất chất hữu malate, succinate Do đó, vai trò chu trình Calvin suốt trình sinh trưởng quang dị dưỡng giữ cân oxy hóa khử tế bào Khi tế bào sinh trưởng điều kiện quang tự dưỡng vai 14 trò chủ yếu chu trình calvin cố định CO2 để tổng hợp vật liệu tế bào Chính nhờ tính lưỡng cực mà chu trình Calvin có vai trò điều khiển hai trình quang tự dưỡng quang dị dưỡng Q trình cố định nito ln kèm với việc khử proton tạo hydro đòi hỏi nhiều lực khử, trình tiêu tốn lượng Hệ thống khơng đóng vai trò trao đổi nito mà có vai trò điều khiển cân oxy hóa tế bào Tế bào tổng hợp nitrogenase sinh trưởng quang dị dưỡng với nguồn N nghèo glutamat Ở điều kiện sinh trưởng vậy, lực khử dư thừa tạo q trình oxy hóa chất lại bị tiêu dùng vào việc khử proton giải phóng phân tử hydro hoạt tính hydrogenase hệ thống nitrogenase Khi sinh trưởng điều kiện quang hợp, tế bào vi khuẩn quang hợp Rhodobacter xuất mối tương tác hệ thống, giữ cân oxy hóa khử tế bào hệ thống quang hợp Hệ thống điều hòa trao đổi chất vi khuẩn tía linh hoạt, chúng đối tượng lý tưởng cho nghiên cứu trao đổi chất vi sinh vật (Burris, 1991) 2.3 ỨNG DỤNG Những ứng dụng bật VKQH Rhodobacter xử lý nước thải, cải thiện môi trường, sản xuất hydro phân tử, sinh khối Các VKQH Rhodobacter nói chung nguồn cung cấp thành phần chuỗi truyền điện tử quang hợp tạo ATP, nguồn vitamin phân tử hữu khác 2.3.1 Xử lý nước thải Nước thải chứa hỗn hợp chất hữu phân tử lượng nhỏ, nguồn chất tốt cho vi khuẩn Rhodobacter để tăng trưởng điều kiện kị yếm khí vi hiếu khí.; VKQH thường ứng dụng với vi sinh vật dị dưỡng yếm khí, hiếu khí vi tảo hệ thống làm nước thải Các lồi thường sử dụng xử lý nước thải là: R.Capsulatus, R.sphaeroides, Rhodopseudomonas palustris, Rhodospirillum fulvum… 15 Hệ thống xử lý nước thải có tham gia VKQH Rhodobacter có ưu điểm sau: - Khơng cần thiết phải khử trùng nước trước xử lý - Sinh khối thu ñược sau trình xử lý giàu protein, vitamin, carotenoid nhiều hoạt chất sinh học khác nên tái sử dụng y học, nông nghiệp chăn nuôi - Khi xử lý nước thải đậm đặc hữu vi khuẩn quang hợp tía khơng cần phải pha loãng (Kobayshi and Hirotani, 1987) 2.3.2 Sản xuất protein đơn bào VKQH nguồn cung cấp protein đơn bào có giá trị sinh khối VKQH giàu protein, vitamin carotenoid Ở tế bào VKQH hàm lượng protein thường chiếm 60 – 70% trọng lượng khô, số lượng hàm lượng acid amin không thay chúng tương đương với đậu tương, thịt, trứng gà Ở loài Rhodopseudomonas capsulatus, protein acid nucleic chiếm 61% 6% trọng lượng sinh khối; lượng acid amin ly giải tế bào tương đương với Chlorella vulgaris, chứa thành phần methionin cao Các loại chất thải hay vật liệu rẻ tiền thường ñược tận dụng làm nguyên liệu để nuôi cấy VKQH thu sinh khối Khi nuôi cấy đồng thời Rubriviax delatinosa Rhodobacter sphaeroides bã mì, lượng vi tamin B12 carotenoid thu 44 230 µg/g chất khơ Sinh khối VKQH giàu vitamin, acid amin thiết yếu acid amin có lưu huỳnh nguồn thức ăn tốt cho gia súc, phiêu sinh vật tôm cá Giá trị dinh dưỡng VKQH bổ sung vào thức ăn chăn nuôi chứng minh thực tiễn Mức ñộ sống sót cá giống, tốc độ sinh trưởng va trọng lượng chúng gia tăng nuôi thức ăn có bổ sung tế bào VKQH Việc bổ sung sinh khối VKQH vào thức ăn gà mái giúp cải thiện số lượng, chất lượng trứng gà ((Kobayshi and Kurata, 1978) 2.3.3 Sản xuất kháng sinh 16 Một đặc tính VKQH có khả sinh chất kháng vi sinh vật bao gồm: chất kháng sinh, chất kháng khuẩn kháng virus (Hirotani et al., 1991) Hoạt chất kháng virus tìm thấy nhiều chủng thuộc lồi R.rubrum, R.capsulatus Chất thường cơng vào virus gây bệnh cho cá coliphage mà khơng gây hại cho vật chủ R.capsulatus loại bỏ 97% coliphage sử dụng chúng xử lý nước thải chăn nuôi (Kobayshi and Hirotani, 1987) 2.3.4 Sản xuất Ubiquinone Ubiquinone 10 (Q10) thành phần quan trọng chuỗi vận chuyển điện tử hệ quang VKQH Q10 biết đến loại ubiquinone có giá trị dược liêu, chúng có tác dụng kích thích tim, sử dụng điều trị bệnh phổi sử dụng chất chống oxy hóa sản xuất dược phẩm, mỹ phẩm Tế bào VKQH chứa hàm lượng Q10 cao loài vi sinh vật khác Thành phần chiết tách, tinh chế từ Rhodopseudomonas sphaeroides, Rhodopseudomonas sulfidophilus, Rhodospirillum rubrum (Sasilala and Ramana, 1995) 2.3.5 Sản xuất hoocmon thực vật Người ta phát số hoocmon thực vật có mặt tế bào VKQH Rhodobacter với vai trò điều chỉnh trình quang hợp Các hoocmon tách từ R.rubrum có hoạt tính sinh lý cao bao gồm ba loại cytokinin (hàm lượng1mg/g sinh khối tươi) có nguồn gốc adenin Dịch bào R.spharroides nuôi cấy nước thải có chứa kinetin (hàm lượng 4,7 g/l) zeatin với hàm lượng 2g/l Ngoài ra, người ta tìm thấy số chất kích thích sinh trưởng khác auxin, idol – – axetic axit (IAA), indol – – butiric axit (ABA) tế bào chủng R.sphaeroides IFO 12203 (Sasilala and Ramana, 1995) 17 CHƯƠNG 18 PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 3.1.1 Địa điểm thời gian - Thời gian từ tháng 12/2019 đến tháng 03/2020 - Địa điểm: Phòng thí nghiệm Thực hành vi sinh Trung tâm Thực hành Thí nghiệm, Trường Đại Học Kiên Giang 3.1.2 Nguyên liệu + Các chủng vi khuẩn Rhodobacter phân lập vùng ven biển Kiên Giang 3.1.3 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm Sử dụng trang thiết bị có Trung tâm Thực hành Thí nghiệm, Trường Đại Học Kiên Giang a.Thiết bị, dụng cụ sử dụng trình phân lập vi khuẩn như: máy đo pH, Đĩa petri, bình tam giác, micropipet Gibson P10, P20, P200, P1000 (Đức), tủ cấy vi sinh vật, tủ ủ vi sinh vật, nồi hấp khử trùng nhiệt ướt (Đức), máy lắc mẫu, ống nghiệm, kính hiển vi, Tủ lạnh -4 oC Akira (Việt Nam), tủ lạnh -20oC Electrolux Confor plus (Thụy Điển), cân điện tử, b Một số thiết bị, dụng cụ khác: máy chụp ảnh kỹ thuật số, máy phân tích vi tính lưu trữ số liệu, số dụng cụ khác như: que cấy, que trang, đầu cone (vàng, xanh, trắng), lam, lammen, que thủy tinh, cốc đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh, bọc nylong, ống đong, đèn cồn, 3.1.4 Hóa chất mơi trường a Hóa chất NaCl, NaHCO3, NaOH, HCl b Môi trường Đề tài sử dụng môi trường SSM đặc trưng cho vi khuẩn quang hợp Rhodobacter nước mặn Bảng 3.1: Thành phần hóa chất môi trường SSM phân lập vi khuẩn 19 STT Thành phần Sodium malate Sodium succinate KH2PO4 K2HPO4 (NH4)2SO4 MgSO4.7H2O NaCl CaCl2.2H2O Na2S2O3.5H2O 1 0 .2 0.0 00 10 Cao nấm men 11 Hỗn hợp vitamin 12 Dung dịch vi lượng 13 pH Dung dịch vi lượng: STT Hàm lượng (g/l) m m–7 6.8 Thành phần Hàm lượng EDTA-2Na FeCl3 1.0 g 2.0 g ZnCl2 MnCl2 0.1g H3BO3 0.1 g CoCl2.6H2O 20 mg Na2MO4.2H2O 10 mg CuCl2.2H2O 10 mg Na2SeO3 5.0 mg 10 Nước cất 1000 ml Hỗn hợp vitamin 20 STT Thành phần Thiamin – HCl Niacin p-aminobenzoic acid Pyridoxal-HCl Biotin Vitamin B12 Nước cất đủ Hàm lượng (mg) 5 50 ml 100 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Phân lập vi khuẩn 3.2.1.1 Mục đích thí nghiệm Phân lập dòng vi khuẩn Rhodobacter vùng ven biển có khả cải thiện mơi trường nước 3.2.1.2 Cách tiến hành Tiến hành lấy mL mẫu nước 1g mẫu bùn cho vào ống nghiệm chứa mL chứa đầy mơi trường dịch thể SSM Ủ bình ánh sáng đèn sợi đốt 40W với khoảng cách 20cm Sau -7 ngày quan sát sinh khối VKQH với màu sắc đặc trưng từ nâu vàng đến đỏ tía Phân lập làm thuần: huyền phù sinh khối VKQH lấy từ mơi trường ni tích lũy pha lỗng ria mơi trường thạch SSM Sau đặt đĩa ánh sáng bóng đèn sợi đốt 40W, cách 20cm tới đèn Sau 5– ngày, chọn khuẩn lạc riêng rẽ, với màu sắc đặc trưng, huyền phù hóa khuẩn lạc nước cất vơ trùng ria môi trường thạch để làm 3.2.2 Khảo sát đặc điểm hình thái sinh lý chủng vi khuẩn phân lập được 3.2.2.1 Khảo sát hình thái, kích thước tế bào 21 Tế bào VKQH nuôi môi trường dịch thể SSM điều kiện yếm khí ống nghiệm, chiếu sáng từ 5-7 ngày Quan sát hình thái đo kích thước tế bào kính hiển vi quang học với vật kính 40X 3.2.2.2 Xác định thành phần sắc tố Nuôi VKQH môi trường dịch thể ngày, thu sinh khối, rửa tế bào nước cất huyền phù lại tế bào dịch dịch sucrose 60% Dung dịch nồng ñộ cao chống lại tán xạ ánh sáng Phổ hấp thu ánh sáng cực đại sắc tố tế bào xác định quét huyền phù tế bào dãy bước sóng từ 190 – 1100nm máy đo quang phổ Dựa vào phổ hấp thu cực đại huyền phù tế bào, loại diệp lục xác định theo Bảng 2.2 Loại carotenoid dự đốn dựa vào tạp chí hệ thống phân loại vi khuẩn 3.2.2.3 Khảo sát đặc tính sinh lý Việc xác định nhu cầu nồng độ NaCl, khả sử dụng nguồn cacbon chất cho điện tử quang hợp khoảng pH thích hợp cho tăng trưởng… thực sau: sinh khối chủng khảo sát pha loãng 1000 lần nước cất vô trùng tạo huyền phù tế bào không hóa chất mơi trường nhân giống Bổ sung 100µl huyền phù tế bào vào ống nghiệm có chứa đầy mơi trường khảo sát cho mật độ tế bào đạt 10 tế bào/ml Sau 5–7 ngày ni yếm khí, chiếu sáng, tăng trưởng chủng chủng vi khuẩn đánh giá cách xác định độ hấp phụ dịch huyền phù tế bào bước sóng 660nm – OD660 máy đo quang phổ 3.2.3 Thí nghiệm 4: Định danh chủng vi khuẩn phân lập được Tách chiết DNA tổng số vi khuẩn theo Sambrook gồm bước sau: + Dịch tế bào vi khuẩn sinh trưởng pha log đưa vào ống eppendoff, ly tâm 12.000 vòng/phút 10 phút để loại bỏ dịch ni 22 + Hòa tan trở lại 400 µl dịch thủy phân (10mM tris – HCl, pH =8, 1% SDS, 10mM EDTA, 50mM NaCl, 25% sacaroza) Thêm 10µl lysozym 10mg/ml Ủ nhiệt độ phòng 15 phút + Thêm 15 µl protease 1mg/ml tiếp tục ủ 56 C 1h + Thêm 450 µl hỗn hợp phenol/chloroform có tỷ lệ 1:1, đảo nhẹ ống Ly tâm 10.000 vòng/phút 10 phút nhiệt độ phòng Lấy pipet hút nhẹ dung mơi phía sang ống khác + Chiết lại 450 µl chloroform + Thêm 0,1 V CH3COOK 3M, pH = 5,2 Thêm 2V cồn tuyệt đối lạnh, đặt 20 C 3h o + Ly tâm 12.000 vòng/phút 15 phút nhiệt ñộ C, loại bỏ phần dịch + Rửa lại cồn 70%, tiếp tục ly tâm 12.000 vòng/phút 15 phút nhiệt độ C + Cơ chân khơng phút + Hòa tan 40 µl đệm TE + Lấy µl kiểm tra ñiện di gel Phản ứng PCR nhân đoạn gen mã hoá rRNA 16S: sử dụng cặp mồi 20F 1500R để khuếch đại đoạn gen mã hóa cho phân tử rRNA 16S nguyên vẹn, (kích thước khoảng 1500bp) Mỗi phản ứng PCR thực dung tích 50 µl với thành phần sau: µl DNA mẫu, µl mồi 20F, µl mồi 1500R, 5M dung dịch đệm 10X, µl dNTP, 0.5 µl Ex Taq polymeras o 37.5 µl nước cất vơ trùng Chù trình PCR: chu kì 94 C phút; o 35 chu kì chu kì gồm bước: biến tính 96 C 30 giây, bắt cặp o o o 55 C 30 giây, kéo dài 72 C phút; chu kỳ 72 C o phút Sản phẩm PCR ủ C sử dụng Tinh sản phẩm khuếch đại: điện di 45 µl sản phẩm PCR phản ứng PCR I gel agarose Thu nhận vạch khuếch ñại rRNA 16S từ gel agarose kit QIAEX II theo hướng dẫn 23 Giải trình tự đoạn ngắn thuộc rRNA 16S khuếch đại phản ứng PCR II dựa vào phương pháp dideoxy nucleic acid ( Cycle sequencing by PCR method) Các phân đoạn khác rRNA 16S khuếch đại dựa khuôn DNA mạch đơn rRNA 16S (từ phản ứng PCR I) giải trình tự phản ứng PCR II với mồi (20F, 520F, 920F, 520R, 920R, 1500R) Phản ứng PCR thực dung tích 20 µl gồm thành phần: µl sản phẩm DNA phản ứng PCR I, µl mồi, µl ABI Prims TM Bigdye 10 µl nước cất vơ trùng Chương trình o phản ứng PCR II: chu kì 96 C phút; 25 chu kì chu kì gồm o o bước: biến tính 96 C 10 giây, bắt cặp 50 C giây, kéo dài o o o 60 C 47 phút; chu kỳ 72 C phút Sản phẩm PCRII ủ C điện di Điện di giải trình tự gen mã hóa rRNA 16S: sản phẩm PCRII tinh phương pháp tủa DNA với sodium acetate 3mM ethanol lạnh 95‰ sau dược huyền phù 15µl dung dịch Template o Suppresion Reagent biến tính 96 C phút trước phân tích thiết bị giải trình tự tự động 3.2.4 Phương pháp phân tích số liệu Tất nghiệm thức thực với lần lặp lại, số liệu xử lý thống kê phần mềm Excel Statgraphics Plus 5.1 24 CHƯƠNG KẾT QUẢ DỰ KIẾN - Phân lập số dòng Rhodobacter vùng ven biển Kiên Giang - Định danh số dòng Rhodobacter kỹ thuật giải trình tự DNA Kiên Giang, ngày Cán hướng dẫn (Ký tên) tháng năm 2019 Sinh viên thực (Ký tên) Chủ tịch hội đồng xét duyệt (Ký tên) 25 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO Danh mục tài liệu tiếng Việt Nguyễn Văn Thành, Nguyễn Minh Thủy, Dương Thị Diễm Trang, 2013 Lên men rượu vang khóm (Ananas comosus) Cầu Đúc (Hậu Giang) nấm men phân lập chủng, Tạp chí khoa học trường đại học Cần Thơ Hà Thanh Toàn Huỳnh Ngọc Thanh Tâm, 2017 Nghiên cứu điều kiện thủy phân lên men ethanol từ vỏ xồi sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae, Tạp chí Khoa học Yersin Tô Việt, 2014 Khám phá rượu vang Nhà xuất Bách khoa Hà Nội Danh mục tài liệu tiếng Anh Stefania Costa, Saverio Ganzerli, Irene Rugiero, Simone Pellizzari, Paola Pedrini and Elena Tamburini 2017 Potential of Rhodobacter capsulatus Grown in Anaerobic-Light or Aerobic-Dark Conditions as Bioremediation Agent for Biological Wastewater Treatments Water 2017, vol 9: p 108; doi:10.3390/w9020108 26 ... lập định danh chủng vi khuẩn Rhodobacter vùng biển Kiên Giang 1.2.2 Mục tiêu cụ thể Phân lập, khảo sát đặc tính sinh hóa, định danh phân tử chủng vi khuẩn Rhodobacter vùng biển Kiên Giang 1.2.3... NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN RHODOBACTER Ở VÙNG VEN BIỂN KIÊN GIANG ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số ngành: 7420201 Kiên Giang. .. DỰ KIẾN - Phân lập số dòng Rhodobacter vùng ven biển Kiên Giang - Định danh số dòng Rhodobacter kỹ thuật giải trình tự DNA Kiên Giang, ngày Cán hướng dẫn (Ký tên) tháng năm 2019 Sinh vi n thực