Nghiên cứu này nhằm đánh giá hoạt tính kháng nấm Colletotrichum musae và nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thư hại chuối và ớt từ dịch chiết gừng (Zingiber officinale).
TẠP CHÍ KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ NƠNG NGHIỆP ISSN 2588-1256 Tập 3(3) – 2019:1439-1447 KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM MỐC GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN CHUỐI VÀ ỚT SAU THU HOẠCH CỦA DỊCH CHIẾT GỪNG Nguyễn Thỵ Đan Huyền*, Lê Thanh Long Tác giả liên hệ: Nguyễn Thỵ Đan Huyền Email: nguyenthydanhuyen@huaf.edu.vn Trường Đại học Nông Lâm, * Đại học Huế Nhận bài: 10/02/2019 Chấp nhận bài: 29/03/2019 Từ khóa: Bệnh thán thư, C gloeosporioides, C musae, Gừng, Kháng nấm TĨM TẮT Nghiên cứu nhằm đánh giá hoạt tính kháng nấm Colletotrichum musae nấm Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh thán thư hại chuối ớt từ dịch chiết gừng (Zingiber officinale) Ảnh hưởng dịch chiết gừng nồng độ 2,5; 5; 7,5, 10; 15 20% đến hình thái tản nấm, hình thành sinh khối xác định thơng qua đường kính tản nấm, sinh khối khô sợi nấm ức chế bào tử nảy mầm điều kiện in vitro Dịch chiết gừng nồng độ 20% ức chế 89,21% phát triển đường kính tản nấm C musae ức chế 65,58% phát triển đường kính tản nấm C gloeosprioides sau 192 nuôi cấy Nồng độ 10% dịch chiết gừng ức chế tương ứng 89,69% 71,38% sinh khối khô sợi nấm C musae nấm C gloeosporioides sau 168 Quan sát kính hiển vi sau 12 cho thấy, dịch chiết gừng nồng độ 10% ức chế 97,33% 94,00% nảy mầm bào tử nấm C musae nấm C gloeosporioides Những kết tiền đề cho nghiên cứu điều kiện in vivo việc bổ sung dịch chiết gừng vào chế phẩm phun kháng nấm bệnh sau thu hoạch chuối ớt MỞ ĐẦU Ở Việt Nam, chuối ớt hai mặt hàng có giá trị kinh tế cao, trồng phổ biến hầu hết tỉnh Ngồi ra, chuối mặt hàng xuất tiềm Tuy nhiên, hai loại có thời hạn bảo quản ngắn dễ bị tổn thất sau thu hoạch số lượng chất lượng Bệnh thán thư nấm C musae gây chuối nấm C gloeosporioides gây ớt nguyên nhân gây thiệt hại sau thu hoạch (Vũ Triệu Mân, 2007) Bệnh phổ biến chuối giai đoạn chín, bảo quản vận chuyển gây nên vết bệnh đốm nâu chín vàng; ớt bệnh hại thân, lá, hạt hại chủ yếu vào giai đoạn chín Phương pháp phổ biến để kiểm soát bệnh thán thư sử dụng chất hóa học Tuy nhiên, phương pháp gây hại cho môi trường ảnh hưởng đến sức khỏe người Biện pháp canh tác thủ công dù http://tapchi.huaf.edu.vn/ thân thiện với môi trường tốn nhiều công sức thời gian Các chất chiết xuất từ thực vật thân thiện với môi trường cho thấy tiềm lớn để thay thuốc diệt nấm tổng hợp (Janisiewicz Korsten, 2002; Zhang cs., 2005) Gần đây, hoạt động kháng nấm, kháng khuẩn số thực vật có hoạt tính sinh học, có khả phân hủy sinh học an toàn cho sức khỏe người thu hút ý nhà nghiên cứu khoa học việc kiểm soát bệnh thực vật (Kumar cs., 2008) Tuy nhiên, để kiểm soát mầm bệnh sau thu hoạch trái rau ăn chuối ớt từ chất chiết xuất từ thực vật hạn chế Gừng tươi (Zingiber officinale) từ lâu có cơng dụng đặc biệt quan trọng đời sống hàng ngày, chúng sử dụng dạng gia vị, thuốc chữa bệnh, loại mứt, bánh kẹo Trong gừng chứa nhiều tinh dầu số chất có tính 1439 HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY kháng khuẩn gingerol, shogaol, zingiberene có khả ức chế loại loại nấm mốc vi khuẩn (Rodrigues cs., 2007) Mặc dù dịch chiết có nguồn gốc tự nhiên dịch chiết tỏi, gừng, hành có hoạt tính sinh học mạnh, có tiềm kháng nấm, kháng khuẩn lĩnh vực nông nghiệp việc sử dụng dịch chiết gừng chất ức chế, phòng chống bệnh sau thu hoạch cho ớt chuối chưa nghiên cứu cách đầy đủ Mục đích nghiên cứu báo tiến hành đánh giá ảnh hưởng dịch chiết gừng đến hình thành, phát triển nấm C gloeosporioides nấm C musae điều kiện in vitro VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu - Gừng tươi (Zingiber officinale) loại gừng củ nhỏ, giống gừng Huế mua chợ Đông Ba, thành phố Huế Gừng già tươi thu hoạch từ tháng thứ đến tháng thứ tính từ thời điểm trồng, sử dụng để làm thí nghiệm vòng tuần kể từ thu hoạch - Nấm C musae gây bệnh thán thư hại chuối nấm C gloeosporioides gây bệnh thán thư hại ớt cung cấp phòng thí nghiệm Vi sinh, khoa Cơ khí Cơng nghệ, trường Đại học Nơng Lâm, Đại học Huế (Nấm phân lập chuối ớt sau thu hoạch cách cho nhiễm bệnh tự nhiên) Nấm nuôi cấy môi trường PDA (potato dextrose agar) 28oC Sau ngày, sử dụng nước cất vô trùng để thu bào tử Dịch bào tử thu lọc qua vải vô trùng để loại bỏ sợi nấm 2.2 Thu nhận dịch chiết gừng Gừng rửa đất, ngâm cồn 70o khoảng đến 10 phút gọt vỏ, tiếp tục rửa nước cồn 70o sau nghiền nhỏ cối sứ, vắt lấy dịch (nồng độ dịch gừng 100%) (Mendi cs., 2009) 1440 ISSN 2588-1256 Vol 3(3) – 2019:1439-1447 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Xác định ảnh hưởng dịch chiết gừng đến phát triển đường kính tản nấm C musae C gloeosporioides Ảnh hưởng dịch chiết gừng đến phát triển đường kính tản nấm xác định theo Yao Tian (2005) với số điều chỉnh Dịch chiết gừng hòa trộn với môi trường PDA (ở 50 - 55oC) để đạt nồng độ dung dịch cuối 5, 10, 15 20% đổ vào đĩa Petri ɸ9 vô trùng với tổng thể tích 18 ml/đĩa (với đối chứng mẫu 0% dịch chiết gừng) Khi agar đông đặc, cắt mẫu nấm kích thước mm2 rìa tản nấm nuôi cấy ngày cho vào đĩa Petri nuôi 28oC Theo dõi đo đường kính tản nấm ngày/lần thước đo điện tử Thí nghiệm tiến hành với lần lặp lại Hiệu lực ức chế tính theo tỷ lệ phần trăm (%) ức chế tốc độ phát triển đường kính khuẩn lạc PIRG % (Percentage Inhibition of Radial Growth) (Hetar cs., 2011) 𝑹 − 𝑹𝟐 𝑷𝑰𝑹𝑮 (%) = 𝟏 𝒙 𝟏𝟎𝟎 𝑹𝟏 Trong đó: R1: Đường kính tản nấm cơng thức đối chứng R2 : Đường kính tản nấm cơng thức thí nghiệm 2.3.2 Xác định ảnh hưởng dịch chiết gừng đến hình thành sinh khối nấm C musae C gloeosporioides Dịch chiết gừng hòa trộn với mơi trường ½ PDB để đạt nồng độ dung dịch cuối 2,5; 5,0; 7,5 10,0%, sau cho vào bình tam giác 100 ml vơ trùng với tổng thể tích 50 ml/ bình tam giác Mẫu đối chứng mẫu dịch chiết gừng nồng độ 0,0% Cắt mẫu nấm thán thư kích thước mm2 rìa tản nấm cho vào bình tam giác, bịt kín miệng bình giữ mẫu tủ lắc ngày (168 giờ) Nguyễn Thỵ Đan Huyền Lê Thanh Long TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ NÔNG NGHIỆP 28oC Sau thời gian nuôi, canh trường lọc, sấy nhiệt độ 55oC đến khối lượng không đổi Cân sinh khối khô nấm cơng thức thí nghiệm Thí nghiệm tiến hành với lần lặp lại + Hiệu lực ức chế sinh khối sợi nấm khô (Đỗ Tấn Dũng, 2007): I (%) = C −T 100 C Trong đó: C: Sinh khối khô nấm công thức đối chứng (khơng xử lí dịch chiết) T: Sinh khối khơ nấm cơng thức thí nghiệm ISSN 2588-1256 Tập 3(3) – 2019:1439-1447 vào phần lõm lam Cho 10 l dịch bào tử (nồng độ 104 bào tử/ml) lên lam, đậy lam kính ni 28oC bóng tối Sau 12 tiến hành đếm số lượng bào tử nảy mầm tổng số 100 bào tử kính hiển vi với độ phóng đại 40X Thí nghiệm lặp lại lần 2.4 Phương pháp xử lý số liệu Kết thí nghiệm phân tích phương sai nhân tố ANOVA kiểm định DUNCAN (Duncan’s Multiple Range Test) phần mềm thống kê SAS, phiên 9.1, giá trị P F test , 0,05 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 2.3.3 Xác định ảnh hưởng dịch chiết gừng đến nảy mầm bào tử nấm C musae C gloeosporioides 3.1 Ảnh hưởng dịch chiết gừng tươi đến sinh trưởng, phát triển tản nấm C musae C gloeosporioides Ảnh hưởng dịch chiết gừng đến nảy mầm bào tử tiến hành lam kính lõm (Cronin cs., 1996) Ở nồng độ khảo sát dịch chiết gừng, cho 40 l Khả ức chế sinh trưởng, phát triển tản nấm C musae C gloeosporioides dịch chiết gừng nồng độ khác sau 192 nuôi cấy trình bày Bảng Hình Bảng Ảnh hưởng dịch chiết gừng đến sinh trưởng, phát triển tản nấm Đường kính tản nấm (mm) Nồng độ dịch chiết PIRG 192 Nấm bệnh gừng (%) (%) 48 96 144 192 27,10a 61,00a 90,40a 97,30a 0,00a 6,70b 21,80b 33,60b 40,30b 58,58b C musae 10 0,00c 11,10c 18,10c 24,40c 74,92c c d d d 15 0,00 6,70 10,00 12,20 87,46d c e d e 20 0,00 0,00 9,60 10,50 89,21d a a a a 21,0 46,40 69,10 91,80 0,00a b b b b 9,90 25,00 42,50 59,90 34,75b c c c c C gloeosporioides 10 7,50 18,80 31,40 41,10 55,23c d d d d 15 0,00 15,80 28,90 37,90 58,71c d e e e 20 0,00 12,50 22,60 31,60 65,58d Các giá trị trung bình đường kính tản nấm theo cột loại nấm bệnh có chữ in thường không sai khác mức ý nghĩa p < 0,05 Đường kính tản nấm tất mẫu có xử lý với dịch chiết gừng với nồng độ tương ứng thời điểm khác giảm đáng kể so với mẫu đối chứng Sau 192 giờ, đường kính tản nấm cơng thức thí nghiệm sai khác Mức độ giảm theo chiều tăng nồng độ http://tapchi.huaf.edu.vn/ dịch chiết gừng, từ 97,30 mm xuống 10,50 mm nấm C musae từ 91,80 mm xuống 31,60 mm nấm C gloeosporioides tương ứng với nồng độ dịch chiết gừng từ 0% lên 20% sau 192 nuôi cấy 1441 HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY Hiệu lực ức chế tăng dần theo chiều tăng dần dịch chiết gừng, đạt 87,46% 89,21% nấm C musae 58,71% 65,58% nấm C gloeosporioides tương ứng với nồng độ dịch chiết gừng 15% 20% Kết cho thấy dịch chiết gừng ức chế a Nấm C musae ISSN 2588-1256 Vol 3(3) – 2019:1439-1447 hình thành phát triển tản nấm C musae tốt so với nấm C gloeosporioides nồng độ thời gian khảo sát Điều nấm C gloeosporioides có khả phát triển mạnh so với nấm C musae điều kiện nuôi cấy khảo sát b Nấm C gloeosporioides Hình Ảnh hưởng dịch chiết gừng đến sinh trưởng, phát triển tản nấm sau 192 nuôi cấy nhiệt độ 28 o C Dịch chiết gừng khơng ảnh hưởng tích cực đến đường kính tản nấm mà làm thay đổi hình thái khuẩn lạc Trên môi trường PDA, công thức đối chứng (dịch chiết gừng 0%) xuất khuẩn lạc có màu cam đậm nấm C musae màu đen nấm C gloeosporioides, sợi nấm tơi xốp, dày, cao lên mỏng dần rìa mép Ở đĩa có nồng độ dịch chiết gừng tăng dần, sợi nấm mọc thưa hơn, màu nhạt đường kính nhỏ nhiều so với cơng thức đối chứng Hoạt tính kháng nấm dịch chiết gừng chiết dung môi chlorofom Pratibha cs (2016) nồng độ 250 mg/mL cho đường kính vùng ức chế đạt 15,87 mm nấm mốc Fusarium oxysporum f.sp lycopersici gây thối cà chua điều kiện in vitro Tagoe cs (2011) nghiên cứu khả kháng nấm Asperillus flavus, Asperillus niger Cladosporium herbarum dịch chiết từ hành tây, gừng tỏi Kết cho thấy 1442 dịch chiết gừng (100 g gừng 100 mL ethanol) cho hoạt tính kháng nấm cao Đường kính tản nấm sau ngày nuôi cấy nấm A niger 3,5 cm, A flavus 3,2 cm C herbarum 0,5 cm Các kết cho thấy, đối tượng nấm mốc khác nhau, hiệu lực kháng dịch chiết gừng không giống Khả ức chế mạnh nấm mốc gừng cho chứa 400 hợp chất khác nhau, hỗn hợp hai thành phần hóa học dễ bay không bay zingerone, shogaols gingerols, sesquiterpenoids (-sesquiphellandrene, bisabolene farnesene) (-phelladrene, cineol citral) Gingerols shogaols biết đến hợp chất có khả ức chế đến hình thành màng sinh học hình thành sợi nấm làm giảm hoạt động nấm mốc (Chrubasik cs., 2005) Nguyễn Thỵ Đan Huyền Lê Thanh Long TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ NÔNG NGHIỆP 3.2 Ảnh hưởng dịch chiết gừng đến hình thành sinh khối nấm C musae C gloeosporioides Mục đích thí nghiệm xác định ảnh hưởng dịch chiết gừng hòa tan mơi trường ni cấy đến tạo thành sinh khối nấm C musae C ISSN 2588-1256 Tập 3(3) – 2019:1439-1447 gloeosporioides Kết thể Hình Bảng Trong mơi trường lỏng, dịch chiết gừng thể khả kháng tốt mơi trường đặc Thí nghiệm mơi trường lỏng với nồng độ giảm so với môi trường đặc PDA cho hiệu ức chế tương đương Hình Ảnh hưởng dịch chiết gừng đến sinh khối khô nấm C musae C gloeosporioides Các giá trị trung bình sinh khối sợi nấm khơ theo cột (đối với loại nấm) có chữ in thường không sai khác mức ý nghĩa p < 0,05 Kết hình cho thấy, quy luật ức chế sinh khối nấm C musae C gloeosporioides giống quy luật ức chế sinh trưởng, phát triển hai loại nấm môi trường đặc Ở loại nấm, nồng độ dịch chiết khác cho hiệu kháng nấm khác có ý nghĩa mặt thống kê Nồng độ dịch chiết cao khả ức chế tạo thành sinh khối nấm C musae C gloeosporioides lớn Đối với nấm C musae, sinh khối tạo thành nhiều so với nấm C gloeosporioides Cùng sau 168 nuôi cấy 28oC sinh khối khô nấm C musae thu nhiều so với sinh khối khô nấm C gloeosporioides, (12,675 g so với 7,662 g) Hiệu lực ức chế nấm Hiệu lực ức chế nấm C Nồng độ dịch chiết C musae (%) gloeosporioides (%) gừng (%) a 0,0 0,00a 0,00 b 2,5 32,75b 52,73 c 5,0 43,90c 74,50 d 7,5 50,59d 79,95 e 10,0 71,38e 89,69 Bảng Hiệu lực ức chế dịch chiết gừng đến sinh khối sợi nấm C musae C gloeosporioides Các giá trị trung bình tỷ lệ nảy mầm theo cột có chữ in thường không sai khác mức ý nghĩa p