Phân lập và khảo sát một số chủng vi nấm có hoạt tính chống oxy hóa

Bài viết Phân lập và khảo sát một số chủng vi nấm có hoạt tính chống oxy hóa với mục tiêu nhằm sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa (định lượng và định tính) của các chủng vi nấm phân lập được từ các mẫu đất và nước ở một số địa điểm tại miền Nam.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ CHỦNG VI NẤM CĨ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA Vũ Thanh Thảo*, Nguyễn Minh Thái*, Đồn Duy Thanh*, Trần Cát Đơng* TĨM TẮT Mở đầu: Phân tử oxy hoạt động liên quan đến bệnh hen suyễn, nhiễm trùng, viêm khớp, bệnh suy giảm thần kinh Parkinson, bệnh tim mạch tiểu đường Chất chống oxy hóa đóng vai trò tác nhân đánh bắt gốc tự do, ức chế peroxide hóa lipid, chúng có khả bảo vệ thể trước nhiều bệnh tật có nguyên nhân từ gốc tự Gần đây, vi nấm xem nguồn cung cấp chất chống oxy hóa Mục tiêu: Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa (định lượng định tính) chủng vi nấm phân lập từ mẫu đất nước số địa điểm miền Nam Phương pháp: Mẫu sau thu thập phân lập môi trường Potato Dextrose Agar Sabouraud Agar bổ sung Clororamphenicol Định tính hoạt tính chống oxy hóa phương pháp mỏng DPPH, chủng có hoạt tính chống oxy hóa tiếp tục tiến hành định lượng khả đánh bắt DPPH, kết hợp ion sắt II, định lượng phenol tổng số Kết quả: Từ 200 mẫu nước đất ban đầu, phân lập 48 chủng vi nấm, có 18 chủng có hoạt tính chống oxy hóa Khả đánh bắt gốc tự chủng khoảng 61,31-93,56%, khả tạo phức với ion sắt II, khoảng 51,56 % - 98,75%, lượng phenol tổng 16,71-124,18 (mg/ml) Kết luận: Thơng qua việc định tính phương pháp mỏng DPPH số phương pháp định lượng, nghiên cứu chứng minh vi nấm từ đất nước có hoạt tính chống oxy hóa tốt Cần có hướng nghiên cứu nhằm tối ưu hóa thơng số lên men thu chất chống oxy hóa chiết chất chống oxy hóa điều kiện thích hợp Từ khóa: chống oxy hóa, vi nấm, mỏng DPPH, ion sắt II, phenol tổng ABSTRACT ISOLATING AND SURVEYING ANTIOXIDANT ACTIVITY IN SOME FUNGAL STRAINS Vu Thanh Thao, Nguyen Minh Thai, Doan Duy Thanh, Tran Cat Dong * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No - 2014: 256 - 260 Background: Reactive oxygen species are reported to be involved in asthma, inflammation, arthritis, neurodegeneration Parkinson disease, vascular cardiac diseases, and diabetes Antioxidants act as radicalscavengers, inhibit lipid peroxidation and other free radical-mediated processes; therefore, they are able to protect the human from several diseases attributed to the reactions of radicals Recently, fungi have emerged as the new sources of antioxidants in the form of their secondary metabolites Objectives: Screening antioxidant acitivity (qualitative and quantitative) of fungi isolated from soil and water samples that collected from different regions in Southern of Vietnam Methods: Soil and water samples were taken, and spread on Potato Dextrose Agar or Sabouraud Clororamphenicol Agar plate Screening antioxidant with dot blot DPPH assay, potentially antioxidant strains were done further test for their DPPH, fe rrous ion scavenging activity and total phenolic content * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: DS Nguyễn Minh Thái ĐT: 0986200594 256 Email: minhthai2511@gmail.com Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học Results: From initial 200 samples, 48 strains had been were isolated, among them 18 strains have antioxidant potential These organisms show a good scavenging effecting on DPPH radicals (61,31-93,56 %), chelating activity with ferrous ion is 51,56 % - 98,75%, total phenolic concentration is 16,71-124,18 (mg/ml) Conclusions: By using DPPH dot blot and some method for screening and assaying antioxidant activity, this study demonstrated that fungi isolated from soil and water possess good antioxidant activity We intend to optimize physio-chemical parameters in ferment process and extract antioxidant substances with suitable solvent to apply for medicine and industry Keywords: antioxidant, fungi, DPPH dot blot, ferrous ion, total phenolic thu thập từ tỉnh phía nam Chủng đối chứng: ĐẶT VẤN ĐỀ Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 4F có khả Các gốc tự liên quan nhiều bệnh khác sinh acid kojic-một chất chống oxy hóa người xơ cứng động mạch, ung thư, phòng thí nghiệm vi sinh công nghệ Dược cung đái tháo đường, tổn thương gan, viêm da, bệnh cấp Hóa chất môi trường: Môi trường mạch vành, viêm khớp(9) Chất chống oxy hóa Sabouraud chứa Chloramphenicol (SDA), Mơi yếu tố phòng thủ chống lại gốc tự trường PDA (Potato Dextrose Agar) Hóa chất: thể Các chất chống oxy hóa tổng hợp NaCl 0,85 %, chloramphenicol, DPPH butylated hydroxyanisole (BHA), butylated (di(phenyl)-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium), hydroxytoluene (BHT) tert ferrozin, FeCl2, thuốc thử Folin-Ciocalteau, butylhydroquinone-(TBHQ) thường sử Na2CO3 Merk, chất chuẩn: BHT (butylated dụng làm phụ gia thực phẩm ngành công hydroxytoluene), Vitamin C, acid gallic nghiệp thực phẩm để ngăn chặn peroxy lipid Sigma Tuy nhiên, ứng dụng bị hạn chế thành Các thử nghiệm lặp lại lần, phần độc hại chất gây ung thư phương pháp định lượng xây dựng hình thành trình biến đổi, cần đường chuẩn tìm kiếm nguồn chất chống oxy hóa tự nhiên, an Lấy mẫu phân lập toàn, hiệu kinh tế(7) Một số thực vật nấm bậc cao thường biết đến nguồn sản Tiến hành lấy mẫu đất, nước, cát, bùn xuất chất chống oxy hóa, nghiên khu vực giàu ánh sáng, nhiệt độ cao Mẫu ban cứu đối tượng nấm bậc thấp ít(5) Các đầu đựng ống Falcon 50 ml, mẫu loại nấm mốc Penicillium roquefortii, Aspergillus đất, cát, bùn chiếm khoảng ¼ thể tích ống, mẫu candidus, Mortierella, Acremonium, Colletotrichum nước chiếm đến vạch 30-40 ml Mẫu bảo gloeosporioides(4), Antrodia quản nhiệt độ phòng suốt q trình thử (11) camphorata Chaetomium sp., Cladosporium sp., nghiệm Pha loãng mẫu với dung dịch NaCl (5) Torula sp., Phoma sp chứng minh có 0,85%, độ pha lỗng từ cấp số đến 5, trải 100 µl hoạt tính chống oxy hóa Trong đề tài này, chúng mẫu độ pha lỗng cuối lên mơi trường SDA tơi tiến hành phân lập sàng lọc chủng vi PDA Ủ 30oC từ đến ngày SDA đến 10 ngày PDA Sau thời gian ủ, nấm mơi trường đất nước có khả tiến hành quan sát khóm vi nấm hình sinh chất chống oxy hóa, lựa chọn chủng có hoạt tính cao nhằm mở nghiên cứu dạng, màu sắc mặt mặt Tách lấy sâu khóm vi nấm tiếp tục làm môi trường SDA (đối với nấm men) PDA (đối với VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP nấm mốc) Vật liệu Đối tượng nghiên cứu: 200 mẫu đất nước Chuyên Đề Dược Học Chuẩn bị dịch lọc vi nấm Cấy huyền dịch (106 bàotử/ml) với tỉ lệ 5% 257 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 (tt/tt) vào 30 ml môi trường PDA, ủ 30oC ngày Ly tâm dịch nuôi cấy 10000 g 4oC trong10 phút, thu dịch nổi, lọc dịch với giấy lọc Whatman để loại bỏ hoàn toàn sợi nấm bào tử Dịch lọc thu mẫu thử cho thử nghiệm định tính định lượng Định tính hoạt tính chống oxy hóa phương pháp mỏng DPPH Theo đó, mẫu thử (khoảng 10 µL) chấm lên mỏng silicagel 60 F254, để khô tự nhiên, nhuộm mỏng với dung dịch DPPH 0,4 M cách lật ngược mỏng giữ 10 giây, đọc kết nhuộm sau phút(4, 6) Chứng âm: nước cất mơi trường PDA khơng có vi nấm, chứng dương: dung dịch vitamin C 0,1% dịch nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae 4F có chứa acid kojic Mẫu có hoạt tính chống oxy hóa (dương tính) xuất vòng trắng tím, ngược lại mẫu khơng có hoạt tính chống oxy hóa (âm tính) khơng xuất vòng trắng, giống với mẫu nước cất mơi trường khơng có vi nấm Định lượng hoạt tính chống oxy hóa Trong báo cáo chúng tơi sử dụng phương pháp khác để định lượng hoạt tính chống oxy hóa Phương pháp xác định khả đánh bắt gốc tự DPPH Zhao cộng sự(12) Theo đó, hỗn hợp phản ứng bao gồm ml dung dịch DPPH 0,1 mM/ethanol 96% 0,5 ml mẫu thử, ủ nhiệt độ phòng 30 phút, đo độ hấp thu bước sóng 517 nm Dung dịch BHT 0,5 M làm chất đối chiếu, phải đánh bắt 100% gốc tự Khả đáng bắt gốc tự (%) tính theo cơng thức:  A − A2  S % = 1 −  × 100 A0   Với A1 : giá trị OD dịch nuôi cấy sau phản ứng với DPPH 258 A2 giá trị OD phản ứng khơng có DPPH A0 giá trị OD phản ứng khơng có dịch ni cấy Phương pháp xác định khả kết hợp ion Fe2+ dựa giảm màu phức Fe2ferrozin bước sóng 562 nm Zhao cộng (12) Hỗn hợp phản ứng bao gồm mẫu thử, dung dịch FeCl2 thuốc thử ferrozin, phản ứng thực 40 phút nhiệt độ phòng Mẫu đối chiếu BHT 0,5M thực điều kiện phải đạt khả kết hợp 100% Tính tốn khả kếp hợp dựa theo cơng thức:  A − A2 S % = 1 − A0    × 100  A0 chứng dương với môi trường chưa nuôi cấy A1 mẫu thử nghiệm với dịch nuôi cấy A2 mẫu thử nghiệm không mặt FeCl2 Phương pháp xác định phenol tổng số: Mẫu thử kết hợp với thuốc thử FolinCiocalteau, kiềm hóa hỗn hợp dung dịch Na2CO3 20%, phản ứng thực 40oC 30 phút Hỗn hợp sau phản ứng đo độ hấp thu bước sóng 562 nm Xây dựng đường chuẩn với acid gallic nồng đồ 0, 10, 20, 30, 40,50,60, 70, 80 (µg/ml) Kết tính tốn dựa theo đường chuẩn (10) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Phân lập Từ mẫu đất nước đất thu vùng, thu 48 chủng nấm mốc, không thu chủng nấm men trình phân lập Định tính hoạt tính chống oxy hóa Sử dụng phương pháp mỏng DPPH, sàng lọc 18 48 chủng có hoạt tính chống oxy hóa, kết trình bày hình bảng 1: Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học 25 26 27 28 29 30 31 10 11 12 13 14 32 33 34 35 36 37 38 15 16 17 18 21 39 40 42 43 44 45 22 23 24 H2O Mt- Mt+ vitC 46 19 20 47 41 48 H2O Mt- Mt+ VitC Hình 1: Kết định tính hoạt tính chống oxy hóa mỏng DPPH Mẫu thử: – 48 Chứng âm H2O, Mt- (môi trường chưa nuôi cấy) Chứng dương Mt+ (dịch ni cấy có aicd kojic), Vit C (dung dịch vitamin C 0,1%) Bảng 1: Tổng hợp kết định tính hoạt tính chống oxy hóa STT Kí hiệu Hoạt tính chống STT Kí hiệu Hoạt tính oxy hóa chống oxy hóa NT5 25 DQ31.2 + DQ23.2 26 DT17 ++ DQ28.1 BH9.2 BD6 DT27.1 DT26.2 ++ +++ ++ + 27 28 29 30 31 DT18 DQ25.2 DQ31.3 DQ31.4 DQ26.6 DQ38 - 32 DQ11 + DQ39.1 - 33 DQ24.1 - 10 DT26.1 + 34 DQ26.3 - 11 NT1 - 35 - 12 BH9.5 + 36 DQ39.1 - 13 NHS + 37 DQ22.1 + 14 DT26.1 - 38 DQ19.2 - 15 GL6.1 - 39 DQ21.1 - 16 NT10 - 40 DQ39.2 - 17 BH9.4 - 41 DQ26.5 - 18 DT27.2 + 42 DQ22.2 - 19 DT27.3 20 GL6.3 + - 43 DQ25.1 44 TD6 - 21 BH14.1 22 NT2 23 BH12 24 GL6.2 ++ - 45 46 47 48 + PrBD DQ22.3 DQ21.2 DQ26.2 DQ22.4 + +++ + (+): có hoạt tính chống oxi hố; (-): khơng có hoạt tính chống oxi hoá; (++), (+++): Chuyên Đề Dược Học hoạt tính chống oxi hố mạnh mạnh so với độ sáng vết vitamin C Kết định lượng hoạt tính chống oxy hóa Kết đánh bắt gốc tự DPPH chủng vi nấm thu khoảng 61,31-93,56 %, khả kết hợp với ion Fe2+ khoảng 51,56 % - 98,75%, kết phù hợp với nghiên cứu Arora cộng Kết phenol tổng số chủng vi nấm khoảng 16,71-124,18 (mg/ml) tính theo acid gallic, đa số chủng có lượng phenol tổng số thấp nghiên cứu Arora cộng (3) Bảng 2: Kết định lượng hoạt tính chống oxy hóa theo phương pháp Ký hiệu BH9.2 BD6 DT27.1 DT26.2 DT26.1 BH9.5 NHS DT27.2 DT27.3 BH14.1 DQ31.2 DT17 DQ25.2 DQ31.4 DQ26.6 DQ11 DQ22.1 DQ22.4 Khả đánh Khả kết Lượng phenol 2+ bắt DPPH (%) hợp ion Fe tổng số (mg/ml) (%) 80,91 96,65 108,14 91,75 97,20 113,59 79,80 96,30 103,41 76,5 93,75 92,16 70,57 86,61 44,89 76,68 93,80 95,00 73,75 91,90 77,27 74,94 92,29 82,26 61,31 51,56 10,73 67,19 76,66 34,97 75,88 92,85 88,89 92,50 97,76 118,58 65,56 68,75 13,95 93,56 98,66 124,18 70,94 90,00 55,66 71,69 91,19 58,35 69,94 82,28 37,33 66,12 75,71 16,71 259 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 BÀNLUẬN Hiện nay, để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa hợp chất tự nhiên, tác giả sử dụng nhiều thử nghiệm khác dựa chế nội sinh chất thể, chưa có thử nghiệm tiện lợi, nhanh chóng, xác để đánh giá hoạt tính Nhiều tác giả cho hợp chất polyphenol thực vật vi nấm đất nước chịu trách nhiệm cho hoạt tính chống oxy hóa(8) Hệ thống liên hợp nhân phenol có tác dụng vận chuyển điện tử nguyên tử hydro làm trung hòa gốc tự Nguyên tử hydro linh động nhóm OH đóng vai trò tác nhân khử làm ngăn cản q trình oxy hóa hợp chất lipid, ngăn cản sản sinh gốc tự từ trình này(1) Hơn nữa, polyphenol có khả ăng tạo phức với ion Fe 2+, ion kích thích q trình oxy hóa hợp chất lipid tăng cường tích lũy gốc tự từ tình này(3) Trong đề tài này, sử dụng phương pháp phổ biến đánh giá dựa chế: đánh bắt gốc tự khả tạo phức với ion kim loại khử Nhằm khảo sát mối liên hệ mối liên hệ chế với lượng phenol tổng cộng, sử dụng liệu định lượng 18 chủng vi nấm để tính tốn hệ số tương quan R2 với phần mềm Excel 2003 Khả đánh bắt gốc tự tạo phức với ion Fe2+ có hệ số tương quan 0,592 (