Nghiên cứu này, được thử nghiệm sử dụng ba hỗn hợp cytokine để biệt hóa tế bào CD34+ thành ba dòng tế bào tủy (myeloid linages): Dòng hồng cầu (erythrocytic), dòng bạch cầu hạt (granulocytic) và dòng tiểu cầu (megakaryocytic). Mời các bạn cùng tham khảo đề tài qua bài viết này.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 BIỆT HĨA BA DỊNG TẾ BÀO MÁU TỪ TẾ BÀO GỐC DÒNG TẠO MÁU Ở NGƯỜI Nguyễn Thụy Loan Chi*, Miri Nezhad Ayda**, Fichelson Serge** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Máu cuống rốn nguồn cung cấp tế bào gốc dòng tạo máu Ngày nay, liệu pháp sử dụng tế bào gốc dòng tạo máu ứng dụng để điều trị bệnh lý huyết học Những tế bào vốn tế bào gốc đa nên chúng có khả biệt hóa thành hầu hết dòng tế bào máu ni mơi trường có bổ sung tác nhân biệt hóa thích hợp Do đó, nghiên cứu này, thử nghiệm sử dụng ba hỗn hợp cytokine để biệt hóa tế bào CD34+ thành ba dòng tế bào tủy (myeloid linages): dòng hồng cầu (erythrocytic), dòng bạch cầu hạt (granulocytic) dòng tiểu cầu (megakaryocytic) Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Đây nghiên cứu thực nghiệm Những tế bào gốc dòng tạo máu thu nhận nhờ biểu kháng nguyên CD34+ bề mặt tế bào Sau đó, chúng ni cấy mơi trường IMDM, 15% BIT có bổ sung cytokine thích hợp Kết quả: Quần thể tế bào phân lập từ máu cuống rốn có mật độ tế bào CD34+ tối thiểu 85% Cuối q trình biệt hóa thực nghiệm, biến CD34 đồng thời tăng rõ rệt kháng nguyên bề mặt đặc hiệu chứng minh tế bào CD34+ biệt hóa thành cơng Kết luận: Cơng trình mở hướng ứng dụng tương lai cho ngành huyết học truyền máu cụ thể việc sản xuất máu thể nhằm cung cấp nguồn máu “sạch” ổn định cho bệnh nhân Từ khóa: tế bào gốc dòng tạo máu, tế bào CD34+, biệt hóa tế bào ABSTRACT DIFFERENTIATE HUMAN HEMATOPOIETIC STEM CELLS INTO THREE LINAGES OF BLOOD CELLS Nguyen Thi Loan Chi, Miri Nezhad Ayda, Fichelson Serge * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 18 - 23 Background: One of the important sources of hematopoietic stem cells (HSCs) is umbilical cord blood Nowadays, HSC cell-based therapies are applied in treatment of hematological disorders HSCs are multipotent, so these cells have ability to differentiate into all hematopoietic linages very effectively in culture under different combinations of cytokines Therefore, in this study, we aimed to apply three mixtures of cytokines to differentiate HSCs into three myeloid linages of blood cells: erythrocytic, granulocytic and megakaryocytic linage Material and method: This is an experimental study HSCs were isolated by CD34+ antigenes expressed on their surfaces Then, they were cultured in IMDM plus 15% BIT and supplied by suitable cytokines Results: We collected a CD34+ population with more than 85% of purification from cord blood At the end of the differentiation experiments, all of the cultured cells were matured into three linages of blood cells because CD34+ antigenes disappeared and the differentiation markers strongly increased Conclusion: This study opened future applications for medicine of Hematology and Blood transfusion , especially, the ex-vivo production of blood cells will supply a non-infected, stable and donorless source of blood Key words: Hematopoietic stem cells, HSC, CD34+ cells, differentiaion * Bộ mơn Hóa Sinh - Sinh Học Phân Tử - ĐHYK Phạm Ngọc Thạch; ** Khoa Huyết Học - Viện Cochin -Paris, Pháp Tác giả liên lạc: BS Nguyễn Thụy Loan Chi 18** Email: ngloanchi@gmail.com Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 ĐẶT VẤN ĐỀ Tế bào gốc dòng tạo máu (Hematopoietic stem cell- HSC) quần thể tế bào, mang đặc tính tế bào gốc, nghĩa chúng có khả tự nhân lên biệt hóa thành dòng tế bào máu suốt đời sống người Do đó, chúng hồn tồn có khả sử dụng ghép tủy để điều trị bệnh ác tính máu(4) Đồng thời, tương lai, giới khoa học mong muốn sản xuất máu nhân tạo với số lượng lớn, hứa hẹn cách mạng cho ngành y tế, mang lại nguồn cung máu ổn định giảm nguy truyền nhiễm truyền máu Những tế bào gốc thường lưu trú tủy xương- nơi diễn trình tạo máu, Nghiên cứu Y học nhiên phân lập chúng máu cuống rốn Một số dấu ấn màng (như CD34+, CD133+) giúp phân lập tế bào Sự tạo máu trình sản xuất loại tế bào máu từ tế bào gốc dòng tạo máu đa chức Một tế bào theo hai hướng biệt hóa: hướng dòng tủy hướng dòng lympho để hình thành tế bào đầu dòng tủy (common myeloid progenitor cell- CMP) tế bào đầu dòng lympho (common lymphoid progenitor cell- CLP) Những CMP biệt hóa tiếp tục thành bạch cầu hạt, hồng cầu tiểu cầu Trong đó, CLP hình thành nên tế bào lympho T, B tế bào NK (Natural killer cell) (Hình 1) Hình 1: Q trình tạo máu vai trò cytokine biệt hóa in-vivo(5) SCF= Stem Cell Factor, IL= Interleukin, GM-CSF= Granulocyte-Macrophage-Colony Stimulating Factor, G-CSF=Granulocyte-Colony Stimulating Factor, M-CSF= Monocyte-macrophage-Colony Stimulating Factor, EPO= Erythropoietin, TPO= Thrombopoietin) HSC= Hematopoietic stem cell: tế bào gốc dòng tạo máu, Multipotent stem cell: tế bào gốc đa năng, CMP= common myeloid progenitor cell: tế bào đầu dòng dòng tủy, CLP= common lymphoid progenitor: tế bào đầu dòng dòng lympho, BCP= B-cell progenitor: tế bào đầu dòng B, EP= erythroid progenitor: tế bào đầu dòng hồng cầu, GMP= granulocyte–macrophage progenitor: tế bào đầu dòng bạch cầu hạt- đại thực bào; MEP= megakaryocyte erythroid progenitor= tế bào đầu dòng hồng cầu- tiểu cầu, MkP= megakaryocyte progenitor: tế bào đầu dòng tiểu cầu, TNK= T-cell natural killer cell progenitor: tế bào đầu dòng NK lympho T; Primitive progenitor cell: tế bào đầu dòng nguyên thủy; Commited precursor cell: tế bào đầu dòng tiền phân hóa; Lineage commited cell: tế bào biệt hóa theo dòng Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 19 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Sự tăng trưởng tế bào gốc dòng tạo máu theo hướng dòng tủy (myeloid linages) chứng minh nhờ vào số cytokine yếu sau (Hình 1): - Yếu tố tế bào gốc (stem cell factor- SCF): điều hòa giai đoạn đầu trình tạo máu - Yếu tố kích thích tạo dòng bạch cầu hạt: Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) - Interleukin (IL-3): liên quan đến tăng sinh biệt hóa nhiều tế bào đầu dòng q trình tạo máu - Interleukin (IL-6): kích thích tế bào khả biệt hóa thành dòng tủy, ức chế hướng biệt hóa dòng lympho(2) - Ngoài ra, Erythropoietin (EPO) cần thiết để CMP biệt hóa thành hồng cầu Thrombopoietin giúp CMP biệt hóa thành mẫu tiểu cầu (megakaryocyte) Cũng theo y văn, phương pháp nuôi cấy in vitro tế bào gốc dòng tạo máu, việc sử dụng hỗn hợp cytokine tỏ hữu hiệu an toàn Đồng thời, chúng thúc đẩy biệt hóa tế bào gốc tế bào tạo máu đầu dòng (hematopoietic precusors) Do đó, nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng tổ hợp cytokine để nuôi cấy biệt hóa tế bào CD34+ thành ba dòng tế bào: hồng cầu, bạch cầu hạt tiểu cầu ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thu nhận máu cuống rốn Máu cuống rốn thu nhận từ sản phụ xét nghiệm âm tính với HIV, HBV, HCV… khoa sản Viện Cochin (Paris) Sau thai nhi vừa sinh ra, tiến hành kẹp phần cuống rốn gần bụng cắt vị trí kẹp cm Dùng kim tiêm túi thu máu (có chứa sẵn chất chống đông máu) đưa vào cuống rốn vị trí gần thai Máu cuống rốn theo kim ống dẫn chảy vào túi thu máu Khi máu hết chảy, rút kim mang túi chứa máu phòng thí nghiệm 20 Ni cấy biệt hóa tế bào Những tế bào CD34+ phân lập từ máu cuống rốn nuôi cấy môi trường IMDM, bổ sung BIT 15% (StemCell Technologies) vốn hỗn hợp gồm huyết bò (Bovine serum albumin- BSA), Insulin Transferrin Đồng thời, tế bào gốc trưởng thành biệt hóa với diện cytokine tái tổ hợp: SCF; IL-3, EPO, IL-6 (cho dòng hồng cầu)(3); IL-3, G-CSF, Flt-3 (cho dòng bạch cầu hạt)(1,7); TPO (cho dòng tiểu cầu)(6) Hàng ngày, tế bào đếm số lượng, bổ sung môi trường cytokine cần thiết Môi trường nuôi cấy bổ sung Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 μg/ml) L- Glutamine (2 mM) Những tế bào ni biệt hóa điều kiện 370C, 5% CO2 Hàng ngày, tế bào đếm số lượng với buồng đếm kính hiển vi quang học để theo dõi tăng trưởng chúng Phân lập tế bào CD34+ từ máu cuống rốn Về nguyên tắc, máu cuống rốn chứa ba loại tế bào chính: tế bào gốc tạo máu (HSC), tế bào máu trưởng thành tế bào gốc trung mô Các tế bào gốc trung mô tế bào gốc tạo máu thuộc quần thể tế bào đơn nhân Tiến hành thu nhận quần thể tế bào đơn nhân phương pháp li tâm gradient nồng độ Ficoll (Lymphoprep®, Thụy Điển) tốc độ 1.700 vòng/phút, 30 phút Sau đó, thu nhận phân đoạn chứa tế bào đơn nhân nằm lớp Ficoll lớp huyết tương bên Rửa tế bào với PBS ủ 30 phút 4oC với FcR blocking solution kháng thể kháng CD34 Phân lập tế bào CD34+ nhờ hệ thống cột lọc MACS LS (Miltenyi Biotech, Đức) Phân tích tế bào kỹ thuật tế bào dòng chảy (Flow cytometry) Kỹ thuật tế bào dòng chảy thực máy FACS Calibur cytometer (Becton Dickinson) với phần mềm Cell Quest Kỹ thuật cho phép đánh giá mật độ tế bào CD34+ Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học phân lập từ máu cuống rốn theo dõi động học dấu ấn miễn dịch CD34, CD36, GPA, CD14, CD15, CD11b, CD41a CD42b ngày thứ 0, 4, 7, 11, 14 q trình biệt hóa tế bào gốc dòng tạo máu Mỗi mẫu khảo sát gồm khoảng 20.000 tế bào nuôi cấy rửa với PBS-BSA Ủ tế bào cần khảo sát với kháng thể đặc hiệu cho dòng tế bào (hồng cầu, bạch cầu hạt, tiểu cầu) 20 phút, 4oC trước phân tích qua máy KẾT QUẢ- BÀN LUẬN Hiệu kỹ thuật phân lập tế bào CD34+ từ màu cuống rốn Để đánh giá tỷ lệ tế bào CD34+ quần thể tế bào phân lập từ máu cuống rốn, 20.000 tế bào sau phân lập từ máu cuống rốn ủ trực tiếp với kháng thể kháng CD34 có gắn allophycocyanine (APC) Kết phân tích qua máy FACS cho biết tỷ lệ tế bào CD34+ thực quần thể tế bào sau phân lập thường dao động khoảng 80%-95% Chỉ quần thể có tỷ lệ tế bào CD34+ 85% tiến hành ni cấy biệt hóa Hình 2: Kỹ thuật Flow cytometry cho kết tỷ lệ tế bào CD34+ phân lập từ máu cuống rốn Biệt hóa thành dòng hồng cầu Những tế bào CD34+ nuôi cấy môi trường IMDM, BIT 15% Chúng nhân lên biệt hóa tác dụng cytokines tái tổ hợp: SCF, IL3, IL6 Vào ngày thứ q trình biệt hóa, EPO bổ sung vào mơi trường ni giúp hồn chỉnh biệt hóa dòng hồng cầu Số lượng tế bào đếm ngày cho thấy có tăng khoảng gấp đơi dân số tế bào sau 24 nuôi cấy Kết phân tích dấu ấn bề mặt tế bào kỹ thuật tế bào dòng chảy cho thấy hàm lượng dấu ấn tế bào gốc CD34 giảm dần biến vào ngày thứ 11 Trong đó, GPA (dấu ấn đặc trưng cho dòng hồng cầu) CD36 (protein màng hồng cầu) lại dần tăng lên; bắt đầu tăng mạnh từ ngày thứ 11; cuối cùng, đạt tương ứng 88% 100% ngày 14 q trình biệt hóa Điều chứng minh rằng, tế bào dần tính tế bào gốc biệt hóa hồn tồn thành dòng hồng cầu sau 14 ngày nuôi cấy Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 21 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 percentage percentage Nghiên cứu Y học Hình 3: Kỹ thuật Flow cytometry cho kết tỷ lệ phần trăm dấu ấn CD34, GPA, CD36 bề mặt tế bào biệt hóa từ tế bào CD34+ thành dòng hồng cầu vào ngày 0, 4, 7, 11, 14 q trình biệt hóa Biệt hóa thành dòng bạch cầu hạt Chúng tơi sử dụng môi trường IMDM bổ sung tổ hợp cytokine SCF, IL3, Flt-3 G-CFS để hướng tế bào CD34+ biệt hóa thành dòng bạch cầu hạt Kết tương tự quan sát thấy đếm quần thể tế bào biệt hóa thành Hình 4: Kỹ thuật Flow cytometry cho kết tỷ lệ phần trăm dấu ấn CD34, CD15, CD14, CD11b bề mặt tế bào biệt hóa từ tế bào CD34+ thành dòng bạch cầu hạt vào ngày 0, 4, 7, 11, 14 q trình biệt hóa Biệt hóa thành dòng tiểu cầu Hỗn hợp cytokine bổ sung vào môi trường ni cấy để biệt hóa tế bào CD34+ thành dòng tiểu cầu bao gồm SCF TPO Số lượng tế bào tăng lên gấp đơi sau 24 dòng bạch cầu: số lượng tế bào nhân lên gấp đôi nuôi cấy Tuy nhiên, đến ngày 14-15, tế sau 24 Tuy nhiên, đến ngày 24-26 bào có dấu hiệu ngừng tăng trưởng chết trình biệt hóa, tế bào khơng thể tiếp tục phát triển hay biệt hóa thêm Chúng tơi theo dõi biệt hóa tế bào thành dòng megakaryocyte nhóm kháng Phân tích động học kháng thể màng nguyên: CD41a, CD42b Phân tích dấu ấn bề tế bào suốt q trình biệt hóa mặt cho thấy: CD34 giảm nhanh cho thấy: CD34 giảm dần biến vào ngày trình biệt hóa đến ngày 14 11; ngược lại, dấu ấn dòng diện 4,6%; đó, CD41a CD42b tăng bạch cầu hạt như: CD14, CD15, CD11b tăng chậm ngày đầu cuối đạt CD41a chậm ngày đầu tiên, sau tăng rõ rệt 74%, CD42b 40% ngày 14 trình biệt tiến đến 50% Như vậy, quần thể tế bào gốc ban hóa Như vậy, tế bào biệt đầu biệt hóa thành cơng thành hóa hướng dòng tiểu cầu tế bào đầu dòng dòng bạch cầu hạt 22 Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 percentage Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 hướng ứng dụng tương lai cho ngành huyết học truyền máu cụ thể việc sản xuất máu thể nhằm cung cấp nguồn máu “sạch” ổn định cho bệnh nhân TÀI LIỆU THAM KHẢO Hình 5: Kỹ thuật Flow cytometry cho kết tỷ lệ phần trăm dấu ấn CD34, CD42b, CD42a bề mặt tế bào biệt hóa từ tế bào CD34+ thành dòng tiểu cầu vào ngày 0, 4, 7, 11, 14 q trình biệt hóa KẾT LUẬN Chúng thu nhận tế bào CD34+ với mật độ cao (>80%) Các tế bào gốc dòng tạo máu biệt hóa thành cơng thành ba dòng tế bào: hồng cầu, bạch cầu hạt, tiểu cầu ni cấy mơi trường có bổ sung cytokine thích hợp để kích thích biệt hóa đặc điệu cho dòng Cơng trình mở Nghiên cứu Y học Haylock DN, To LB et al (1992) "Ex vivo expansion and maturation of peripheral blood CD34+ cells into the myeloid lineage." Blood 80(6): 1405-1412 Maeda K, Malykhin A, et al (2009) "Interleukin-6 aborts lymphopoiesis and elevates production of myeloid cells in systemic lupus erythematosus-prone B6.Sle1.Yaa animals." Blood 113(19): 4534-4540 Migliaccio G, Di Pietro R, et al (2002) "In vitro mass production of human erythroid cells from the blood of normal donors and of thalassemic patients." Blood Cells Mol Dis 28(2): 169-180 Mimeault M, Hauke R, et al (2007) "Stem cells: a revolution in therapeutics-recent advances in stem cell biology and their therapeutic applications in regenerative medicine and cancer therapies." Clin Pharmacol Ther 82(3): 252-264 Robb L (2007) "Cytokine receptors and hematopoietic differentiation." Oncogene 26(47): 6715-6723 Shaw PH, D Gilligan, et al (2003) "Ex vivo expansion of megakaryocyte precursors from umbilical cord blood CD34 cells in a closed liquid culture system." Biol Blood Marrow Transplant 9(3): 151-156 Tura O, GR Barclay, et al (2007) "Optimal ex vivo expansion of neutrophils from PBSC CD34+ cells by a combination of SCF, Flt3-L and G-CSF and its inhibition by further addition of TPO." J Transl Med 5: 53 Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 23 ... tế bào máu từ tế bào gốc dòng tạo máu đa chức Một tế bào theo hai hướng biệt hóa: hướng dòng tủy hướng dòng lympho để hình thành tế bào đầu dòng tủy (common myeloid progenitor cell- CMP) tế bào. .. chính: tế bào gốc tạo máu (HSC), tế bào máu trưởng thành tế bào gốc trung mô Các tế bào gốc trung mô tế bào gốc tạo máu thuộc quần thể tế bào đơn nhân Tiến hành thu nhận quần thể tế bào đơn nhân phương... mặt tế bào biệt hóa từ tế bào CD34+ thành dòng tiểu cầu vào ngày 0, 4, 7, 11, 14 q trình biệt hóa KẾT LUẬN Chúng thu nhận tế bào CD34+ với mật độ cao (>80%) Các tế bào gốc dòng tạo máu biệt hóa