Đột biến p53 được nhận biết trong nhiều loại bướu, thể hiện tính bất ổn bằng cách cho phép tích lũy những thay đổi về di truyền do quá trình sinh ung tạo ra. Vì vậy nghiên cứu này tìm hiểu tỉ lệ và kiểu đột biến của gen p53 trong ung thư niêm mạc miệng ở người Việt Nam.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI DNA PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN P53 TRONG UNG THƯ NIÊM MẠC MIỆNG Trần Thị Kim Cúc*, Nguyễn Thị Hồng* TÓM TẮT Mở đầu: Đột biến p53 nhận biết nhiều loại bướu, thể tính bất ổn cách cho phép tích lũy thay đổi di truyền trình sinh ung tạo Mục tiêu: Nghiên cứu tìm hiểu tỉ lệ kiểu đột biến gen p53 ung thư niêm mạc miệng người Việt Nam Đối tượng phương pháp: Sử dụng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp để phân tích vùng bảo tồn gen p53 từ exon đến exon ung thư tế bào gai nguyên phát hốc miệng 109 bệnh nhân, tìm hiểu mối liên quan đột biến gen p53 với thói quen nguy ung thư hút thuốc, uống rượu, nhai trầu Kết quả: Tỉ lệ đột biến gen 53 47,7% Về kiểu đột biến, 62,2% đột biến sai nghĩa; 18,9% đột biến vô nghĩa; 9,4% đột biến đoạn gen; 5,7% đột biến ghép nối sai; 1,9% đột biến thêm đoạn gen 1,9% đột biến khung Đa số đột biến chuyển vị G:C>A:T (40,0%) đột biến chuyển dạng G:C>T:A (25,5%) Tỉ lệ đột biến gen p53 người có thói quen hút thuốc cao có ý nghĩa so với người khơng có thói quen (pA:T transitions and G:C>T:A transversions were the predominant mutations (65,5%) p53 gene mutation significantly related to tobacco smoking habit (p< 0.05) *: Khoa RHM – Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: Trần Thị Kim Cúc Chuyên Đề Răng Hàm Mặt ĐT: 0908348850, Email: kimcuc0804@yahoo.com 119 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Conclusion: This study suggested an important contributing role of tobacco to p53 gene mutation and that tobacco might induce specific patterns and spectrums of mutations in oral cancer patients Key words: p53 gene mutations, DNA sequencing, oral cancer liên quan đến tác nhân môi trường Đa số ĐẶT VẤN ĐỀ đột biến xảy từ exon từ đến exon gen Ung thư bệnh lý thay đổi p53, nằm vị trí đặc hiệu gen- khu mặt tế bào qua loạt đột biến gen đặc vực kết nối với DNA(9) Nghiên cứu khảo sát hiệu, làm tăng sinh tế bào khơng kiểm sốt thay đổi gen p53 UTNMM người Nguyên nhân thay đổi Việt Nam, với mục tiêu sau: tiếp xúc với hay nhiều tác nhân hóa học - Xác định tỉ lệ đột biến gen p53 hay vật lý, gây lỗi trình UTNMM chép hay lỗi trình sửa chữa DNA Đột biến gen kiểm soát chu kỳ tế bào - Xác định tỉ lệ kiểu đột biến gen p53 đường dẫn truyền tín hiệu sửa chữa DNA UTNMM kiện bắt đầu cần thiết trình - Phân tích mối liên quan đột biến gen sinh ung thư(5) p53 với thói quen nguy UTNMM (hút Những nghiên cứu gần cho thấy bất thuốc, uống rượu, nhai trầu) hoạt gen đè nén bướu yếu tố quan ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU trọng trình sinh ung thư nhiều bước Có nhiều gen đè nén bướu liên quan Mẫu nghiên cứu đến bướu ác tính khác nhau, Mẫu nghiên cứu lâm sàng, giải phẫu liên quan đến ung thư niêm mạc miệng bệnh sinh học phân tử gồm 109 bệnh nhân (UTNMM) Sự thay đổi gen đè nén bướu p53 chẩn đoán xác định UTNMM yếu tố di truyền nói đến nhiều điều trị Bệnh viện Ung bướu Tp.HCM trong loại ung thư người Các nghiên năm 2009 2010 cứu cho thấy tỉ lệ đột biến gen thay đổi Tiêu chuẩn chọn bệnh từ 30-70% ung thư đầu cổ(2,4) - Có tổn thương ung thư nguyên phát hốc Gen p53, nằm nhiễm sắc thể 17, có 11 miệng exon mã hóa cho protein nhân tế bào có trọng lượng phân tử 53 kDa, biết đến với chức điều hòa tăng sinh tế bào Khi tế bào bị tổn thương DNA, protein p53 làm dừng chu kỳ tế bào pha G1 nhằm khởi động trình sửa chữa DNA, trình chết tế bào theo lập trình Do có vai trò quan trọng điều hòa chu kỳ tế bào, gen p53 ảnh hưởng nhiều đến trình điều trị ung thư hóa trị hay xạ trị(1) Phân tích kiểu đột biến gen p53 giúp nhận biết vị trí đột biến làm rõ chức protein p53 đột biến, chức thường bị bất hoạt tế bào ung thư Ngồi ra, kiểu đột biến thay đổi tùy thuộc vào chất yếu tố bệnh căn, cho thấy phổ đột biến gen p53 dấu ấn sinh học 120 - Có chẩn đốn giải phẫu bệnh carcinơm tế bào gai - Có trả lời vấn trực tiếp thói quen ăn trầu, hút thuốc, uống rượu - Có hồ sơ bệnh án đầy đủ - Chưa điều trị ung thư đặc hiệu Thiết kế nghiên cứu Cắt ngang, mơ tả phân tích Qui trình nghiên cứu - Ghi nhận qua vấn trực tiếp liệu bệnh nhân thói quen hút thuốc, uống rượu, nhai trầu - Khám đánh giá lâm sàng Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 - Đánh giá cận lâm sàng: giải phẫu bệnh, chụp phim tia X, siêu âm, nội soi tai mũi họng, xét nghiệm máu, nước tiểu, v.v… - Chẩn đoán điều trị ung thư (theo hồ sơ bệnh án bệnh viện) - Mẫu mô lấy từ bệnh phẩm sinh thiết hay phẫu thuật bướu nguyên phát cố định, vùi nến nhuộm Hematoxylin- Eosin thường qui Bệnh viện ung bướu để khảo sát giải phẫu bệnh - Tiến hành kỹ tArg M 19 66 196 CGA TGA CT Arg dừng N 38 67 196 CGA TGA CT Arg dừng N 111 42 196 CGA TGA CT Arg dừng N 40 62 205 TAT TGT AG Tyr Cys M 65 67 205 TAT TGT AG Tyr Cys M 77 55 205 TAT TGT AG Tyr Cys M 76 76 205 TAT GGT TAGG Tyr Gly M 19 66 213 CGA TGA CT Argdừng N 71 57 216 GTG TTG G T Val Leu M 61 51 216 GTG ATG GA Val Met M 29 58 225 GTT ATT GA Val Ile M 39 80 238 TGT TAT GA Cys Tyr M 45 50 241 TCCT TCT Mất 1N Cắt cụt F 102 46 245 GGC TGC GT Gly Cys M 92 58 245 GGC AGC GA Gly Ser M 37 64 246 ATG Mất 3N Mất Met I 50 42 248 CCGGA CCGA Mất 1N Cắt cụt F 87 63 249 AGG AAT GGAT Arg Asn M 82 54 266 GGA TGA GT Glydừng N Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 123 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học Mã số BN Tuổi 85 85 51 60 88 Đột biến nucleotid Thay đổi nucleotid Thay đổi acid amin Kiểu đột biến * 266 GGA TGA GT Glydừng N 271 GAG AAG GA Glu Lys M 44 272 GTG ATG GA Val Met M 32 45 282 CGG TGG CT Arg Trp M 44 90 282 CGG TGG CT Arg Trp M 84 52 Intron cagTAC cggTAC A G IVS4-2A>G S 15 76 Intron GAGgtc GAGttc GT IVS6+1G>T S 34 58 Intron tagGTT ttgGTT AT IVS6-2A>T S Exon Codon ٭: M: đột biến sai nghĩa, N: đột biến vô nghĩa, F: đột biến dịch khung, I: đột biến khung, S: đột biến ghép nối sai Đột biến gen p53 Các kiểu đột biến gen p53 Các đột biến chủ yếu dạng đột biến điểm, Số ca (%) G:C>A:T 07 (12,7) G:C>A:T vị trí CpG 19 (34,6) chiếm tỉ lệ 81,1%, bao gồm đột biến sai nghĩa A:T>G:C 03 (5,5) (62,2%) đột biến vô nghĩa (18,9%) Đột biến Chuyển dạng 04 (25,5) G:C>C:G 01 (1,8) dịch khung chiếm tỉ lệ 11,3%, bao gồm đột biến hay đột biến thêm đoạn gen Các đột biến ghép nối sai vị trí ghép nối intron exon 01 (1,8) A:T>T:A 06 (10,9) A:T>C:G 01 (1,8) Khuyết đoạn gen chiếm tỉ lệ 5,7% Đột biến chuyển vị chiếm 52,7%, chủ yếu dạng G:C>A:T Đột biến chuyển dạng với tỉ lệ 34,6%, chủ yếu dạng G:C>T:A Bảng 2: Các kiểu đột biến Exon 5-8 phổ đột biến gen p53 109 bệnh nhân UTNMM 124 G:C>T:A Thêm đoạn gen Liên quan đột biến gen p53 với thói quen nguy UTNMM Tỉ lệ đột biến gen p53 người hút thuốc 53,8% (42/78 ca), người hút thuốc Đột biến gen p53 Số ca (%) Exon 24 (45,3) Exon 12 (22,6) Tỉ lệ đột biến gen p53 người nhai trầu Exon 08 (15,1) 43,8% (7/16 ca), người nhai trầu Exon 06 (11,3) hút thuốc có đột biến gen p53 (100%) Intron 01 (1,9) Intron 02 (3,8) Kiểu đột biến 43 (81,1) tỉ lệ đột biến gen p53 cao có ý nghĩa thống Đột biến điểm 33 (62,2) kê so với nhóm 31 bệnh nhân khơng có thói Đột biến sai nghĩa 10 (18,9) quen (p0,05) Đột biến ghép nối sai 29 (52,7) Phổ đột biến 14 (25,4) Chuyển vị 08 (14,6) Bảng 3: Liên quan đột biến gen p53 với thói quen nguy UTNMM Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Đột biến Tổng gen p53 (+) Thói quen Số ca Số % ca Hút thuốc 78 42 53,8 Khơng thói quen 31 10 32,3 Nhai trầu (nữ) 16 43,8 Khơng thói quen 15 05 33,3 (nữ) Đột biến gen p53 (+) Số ca 36 21 46,2 67,7 56,2 10 66,7 Giá trị p % 0,042 0,552 BÀN LUẬN Tỉ lệ đột biến gen p53 Theo số liệu đột biến gen p53 tổ chức quốc tế nghiên cứu ung thư (IARC) năm 2010 (dữ liệu R15), tỉ lệ đột biến gen p53 ung thư đầu cổ nói chung 43%(14) Trong UTNMM, tỉ lệ thay đổi từ 5,4% đến 67% tùy nghiên cứu(8) Sự khác biệt nhiều khác biệt vị trí ung thư thói quen nguy cơ(2,4) Đột biến gen p53 phổ biến Nhật Bản, Pháp, Mỹ (53,3%), nơi mà hút thuốc uống rượu xem yếu tố nguy UTNMM Kết tỉ lệ đột biến gen p53 nghiên cứu 47,7%, cao so với nhiều nước phổ biến thói quen nhai trầu Ấn độ (17%-24%)(2,7), tương tự kết nghiên cứu Đài Loan (48,86%) Nghiên cứu đột biến gen p53 Việt nam 18 bệnh nhân UTNMM phát tỉ lệ đột biến gen p53 44,4%(8) Điều cho thấy gen p53 dễ bị đột biến người Việt Nam trình sinh ung thư hốc miệng Vị trí exon codon đột biến PCR định trình tự chuỗi DNA sử dụng để phát trực tiếp kiểu đột biến gen Các đột biến điểm làm thay đổi nucleotid tổng số 23.000 nucleotid gen Đột biến gen p53 thường tìm thấy 280 393 codon cần thiết cho tổng hợp protein Điều làm cho chẩn đốn đột biến trở nên khó khăn hơn, vùng phân tích trải dài tồn gen Nhiều nhóm nghiên cứu tập trung exon 5-8, 8090% đột biến xảy vị trí exon Kỹ thuật phân tử phức tạp Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Nghiên cứu Y học phương tiện chẩn đoán để xác định xác loại đột biến(1,11) Trong nghiên cứu này, tỉ lệ đột biến gen p53 exon 5, 6, 7, 45,2%, 22,6%, 15,1% 11,3% Nhiều nghiên cứu ghi nhận exon dễ bị đột biến nhất(7,13), số nghiên cứu cho thấy exon lại vùng đích dễ bị đột biến(8) Nghiên cứu cấu trúc cho thấy codon mã hóa axít amin vùng đột biến nóng chủ yếu vùng trung tâm (vị trí từ a.a.102-292), số đột biến nằm vùng điều hòa (đầu N từ a.a 1-99 đầu C từ a.a 301-393) Một số codon cho thấy có tần suất đột biến cao, với 28% đột biến ảnh hưởng đến vị trí gen p53, Arg175, Gly245, Arg248, Arg249, Arg273 Arg282 Các vị trí axít amin đột biến thường gặp (điểm nóng) vùng DNA dễ bị tổn thương mã di truyền mã hóa cho acid amin chủ chốt vùng thực chức sinh học protein, hai(1,6) Nghiên cứu tìm thấy điểm nóng thường gặp Arg175, Gly245 Arg282, chiếm tỉ lệ 15,2% Kiểu đột biến gen p53 Đặc điểm kiểu hình đột biến gen p53 thường gặp đột biến sai nghĩa Kết nghiên cứu từ exon đến exon cho thấy đa số (62,3%) đột biến sai nghĩa Theo Stojnev(12), 75% đột biến gen p53 gây thay đổi axít amin riêng lẻ, dẫn đến tổng hợp protein có chiều dài đầy đủ ổn định, chức gắn DNA đặc hiệu tích lũy nhân tế bào bướu Kết bất hoạt protein p53 đột biến gây thay axít amin làm cho nhiều tế bào buớu có biểu protein p53 đột biến Những protein thường ổn định protein nguyên thủy, diện mức cao tế bào bướu(1) Trong đột biến, 20-25% ảnh hưởng tổng hợp protein khơng tồn vẹn Thông thường loại đột biến đột biến vô nghĩa, tạo thành dừng codon, dạng 125 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 khuyết/thêm gen đoạn nhỏ, dẫn đến đột biến dịch khung(12) Chúng tơi tìm thấy tỉ lệ 30,2% đột biến vô nghĩa đột biến dịch khung Các đột biến dịch khung xảy thường xuyên ung thư đầu cổ vị trí ung thư khác(2) ngoại sinh xạ tia cực tím, benzopyren thuốc có ảnh hưởng mạnh đến q trình methyl hóa dinucleotid CpG Các chất sinh ung nội sinh, trao đổi chất tế bào bị thay đổi, nhắm đích dinucleotid methyl hóa, gây tỉ lệ chuyển vị cao hơn(10,11) Đột biến ghép nối sai vị trí intron– exon chiếm 5,7% loại đột biến, phù hợp với quan điểm tác giả cho đột biến ghép nối sai gen p53 gặp ung thư miệng hầu(14) Với chuyển vị G:C>A:T vị trí CpG, nghiên cứu labo cho thấy dạng đột biến thường gặp tác nhân alkylate gây ra, dẫn đến bắt cặp sai O6methylguanin với thymin N-nitrosamin thuốc hút nguyên nhân gây dạng đột biến chuyển vị này(2,10), đồng thời N-nitrosamin thực phẩm Trung quốc Ấn độ góp phần gây nên dạng đột biến chuyển vị G:C>A:T(13) 15 tổng số 22 (68%) trường hợp đột biến chuyển vị kiểu liên quan đến thói quen hút thuốc nghiên cứu Liên quan tỉ lệ đột biến gen p53 với thói quen nguy UTNMM Đột biến gen xảy 53,8% bệnh nhân hút thuốc có kèm uống rượu, khác biệt có ý nghĩa so với bệnh nhân khơng có thói quen (pA:T (trong 1/3 trường hợp chuyển vị xảy vị trí CpG) Soussi phân tích tất đột biến điểm cho thấy 51% đột biến dạng chuyển vị G:C >A:T, 59% số dạng đột biến xuất vị trí CpG- vùng DNA nơi nucleotid cytosin theo sau nucleotid guanin dọc theo chuỗi DNA(11) Sự chuyển vị G:C>A:T vị trí CpG biết khử amin 5methylcytosin thành thymin dẫn đến bắt cặp T/G bị lỗi, không sửa chữa được, gây tỉ lệ cao đột biến p53 chuyển vị Các chất sinh ung 126 Tỉ lệ cao chuyển dạng G:C>T:A thường thấy ung thư phổi, ung thư thực quản ung thư đầu cổ Chuyển dạng GT codon 157, 158, 248, 273 xảy 30% trường hợp ung thư phổi, 10% ung thư khác xem hậu tiếp xúc với thuốc lá, ảnh hưởng sinh ung benzopyren(6,11) Trong nghiên cứu xuất 10/14 trường hợp đột biến chuyển dạng GT người có thói quen hút thuốc, uống rượu, (21,4%) trường hợp đột biến codon 157 gặp người hút thuốc nhiều Ở bệnh nhân UTNMM có thói quen nhai trầu, N-nitrosamin có thuốc nhai kèm theo có chứa lượng lớn Nnitronornicotine (NNN), hợp chất (4 methylnitrosoamino-1-3 pyridyl 1-1-butanone) (NKK) gây đột biến chuyển vị G:C>A:T NKK gây đột biến chuyển dạng G:C>T:A thực nghiệm chuột, thỏ Chúng tìm thấy 3/7 bệnh nhân nhai trầu có đột biến chuyển vị G:C>A:T 3/7 có đột biến chuyển dạng G:C>T:A Điều cho thấy khả gây đột biến p53 N-nitrosamin thuốc nhai hay xỉa lâm sàng Chuyên Đề Răng Hàm Mặt Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu dịch tễ học phân tử cho thấy mối liên quan phơi nhiễm với tác nhân sinh ung đặc điểm đột biến gen p53(2,4) Các kết phân tích dạng đột biến gen p53 nghiên cứu tìm thấy mối liên quan phổ đột biến tác nhân sinh ung thuốc KẾT LUẬN Gen đè nén bướu p53 với nhiều chức quan trọng tế bào dừng chu kỳ tế bào, chết tế bào theo lập trình, biệt hóa tế bào sửa chữa DNA Đột biến gen p53 ảnh hưởng nghiêm trọng đến trình sinh ung thư protein p53 bị đột biến làm gia tăng tính bất ổn hệ gen tế bào bướu thúc đẩy tiến triển cuả bướu Nghiên cứu cho thấy tỉ lệ cao đột biến gen p53 (47,7%) UTNMM với 81% đột biến điểm, chủ yếu đột biến sai nghĩa làm gia tăng biểu protein p53 tế bào bướu Tỉ lệ đột biến phổ đột biến gen p53 nhóm bệnh nhân UTNMM có liên quan rõ với thói quen hút thuốc lá, cho thấy thuốc giữ vai trò quan trọng chế sinh ung thư người Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO Bai L., Zhu W.G (2006), “p53: structure, function and therapeutic application”, Journal of Cancer Molecules 2(4), pp 141-153 Blons H., Laurent-Puig P (2003), “TP53 and Head and Neck Neoplasms”, Hum Mutat 21, pp 252-253 Brennan J., Boyle J.O., Koch W.M., Goodman S.N., Hruban R.H., Eby Y.J (1995), “Associaton between cigarette smoking Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 10 11 12 13 14 Nghiên cứu Y học and mutation of the p53 gene in squamous cell carcinoma of the head and neck”, New Eng J Med 332, pp.712-717 Chitra G., Chandramouli A., Chanchal C (2010), “p53 mutations in head and neck squamous cell carcinoma “, Int J Pharm Biomed Res 1(3), pp.117-121 Feller L., Wood N.H., Khammissa R.A.G., Lemmer J (2010), “Human papilloma virus- mediated carcinogenesis and HPVassociated oral and orophageal squamous cell carcinoma Part 1: Human papilloma virus- mediated carcinogenesis”, Head and Face Medicine, 6:14 Greenblatt M.S., Bennett W.P., Hollstein M., Harris C.C (1994), “Mutations in the p53 tumor suppressor gene: Clue to cancer etiology and molecular pathogenesis”, Cancer Research 54, pp.4855-4878 Hsieh L.L., Wang P.F., Chen I.H., Liao C.T, Chen C.M., Chang C.J.T (2001), “Characteristics of mutations in the p53 gene in oral squamous cell carcinoma associated with betal quid chewing and cigarette smoking in Taiwanese”, Carcinogenesis 22(9), pp.1497-1503 Nguyễn Thị Hồng (2006), “Đột biến gen p53 biểu protein p53, MDM2, KI67, MMP9 ung thư niêm mạc miệng người Việt Nam”, Luận án tiến sĩ y học, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Peltonen J.K., Helppi H.M., Paakko P., Hujanen T.T., Vahakangas K.H (2010), “p53 in head and neck cancer: Functional consequences and environmental implications of TP53 mutation”, Head and Neck Oncology, 2:36 Pfeifer G.P., Denissenko M.F., Olivier M., Tretyakova , Hecht S.S., Hainaut P (2002), “Tobacco smoke carcinogens, DNA damage and p53 mutation in smoking-associated cancer”, Oncogene 21, pp.7435-7451 Soussi T (2005), “The p53 tumor suppressor gene: From molecular biology to clinical investigation”, Annals New York Academy of Sciences, pp.121 Stojnev S., Golubovic M., Babovic P (2009), “TP53 gene mutations-From guardian of the genome to oncogene”, Acta Medica Medianae 48(4), pp.59-63 Thongsukai P., Boonyaphiphat P., Puttawibul W., SudhikaranW (2010), “Specific intronic p53 mutation in esophageal squamous cell carcinoma in Southern Thailand”, World J Gastroenterol 16 (42), pp.5359-5366 http:// www- p53 IARC 127 ... ٭: M: đột biến sai nghĩa, N: đột biến vô nghĩa, F: đột biến dịch khung, I: đột biến khung, S: đột biến ghép nối sai Đột biến gen p53 Các kiểu đột biến gen p53 Các đột biến chủ yếu dạng đột biến. .. sinh ung thư hốc miệng Vị trí exon codon đột biến PCR định trình tự chuỗi DNA sử dụng để phát trực tiếp kiểu đột biến gen Các đột biến điểm làm thay đổi nucleotid tổng số 23.000 nucleotid gen Đột. .. khuyết/thêm gen đoạn nhỏ, dẫn đến đột biến dịch khung(12) Chúng tơi tìm thấy tỉ lệ 30,2% đột biến vô nghĩa đột biến dịch khung Các đột biến dịch khung xảy thư ng xuyên ung thư đầu cổ vị trí ung thư khác(2)