Công trình nghiên cứu được tiến hành để đánh giá tiềm năng probiotic in vitro của các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ các nguồn mẫu rau quả lên men, sữa chua, kefir, phân su và sữa mẹ. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC MỘT SỐ VI KHUẨN LACTIC CÓ TIỀM NĂNG LÀM PROBIOTIC Dương Nhật Linh*, Nguyễn Văn Minh*, Đan Duy Pháp*, Vũ Thanh Thảo**, Trần Cát Đơng** TĨM TẮT Mở đầu: Probiotic vi khuẩn sống có lợi cho đường ruột, bổ sung vào thể với liều lượng thích hợp Nhiều vi khuẩn probiotic sử dụng để hỗ trợ điều trị bệnh đường ruột như: tiêu chảy, hội chứng ruột kích thích Những vi khuẩn có ảnh hưởng tốt cho sức khoẻ người tăng cường hệ miễn dịch, ngăn ngừa điều trị tiêu chảy rối loạn vi khuẩn đường ruột, điều hoà phản ứng viêm Mục tiêu: Đánh giá tiềm probiotic in vitro chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nguồn mẫu rau lên men, sữa chua, kefir, phân su sữa mẹ Phương pháp: Lactobacillus phân lập mơi trường MRS có bổ sung CaCO3 để phát acid lactic Các đặc tính probiotic khảo sát theo hướng dẫn WHO/FAO bao gồm: khả sinh enzym ngoại bào, chịu acid, muối mật, yếu tố an toàn Chủng vi khuẩn định danh khóa phân loại prokaryote Kết quả: Từ 53 chủng phân lập được, sàng lọc định danh 19 chủng thuộc chi Lactobacillus Trong đó, chủng có khả đối kháng với vi khuẩn có hại thường gặp, có khả sinh emzym ngoại bào, tỷ lệ sinh L-lactic acid/D-lactic acid cao, có khả chịu pH acid dày muối mật, không sinh hemolysin, nhạy cảm với kháng sinh thử nghiệm Kết luận: Chúng chọn chủng Lactobacillus đáp ứng tiêu chí vi khuẩn dùng làm probiotic theo hướng dẫn WHO/FAO Từ khóa: Probiotic, vi khuẩn lactic, Lactobacillus, dung nạp acid/muối mật, sữa mẹ, phân su ABSTRACT ISOLATION AND SCREENING LACTIC ACID BACTERIA FOR POTENTIAL PROBIOTICS Dương Nhat Linh, Nguyen Van Minh, Dan Duy Phap, Vu Thanh Thao, Tran Cat Dong * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 182 - 188 Background: Probiotic is viable microbe agent that beneficially affects the host possibly by improving the balance of the indigenous microflora Many probiotic bacteria have been used as alternative treatment of some intestinal diseases such as diarrhoea, irritable bowel syndrome Objectives: This work aimed to isolating and screening of potential probiotic properties of lactic acid bacteria strains from some naturally fermented food, breast milk and meconium Methods: Lactobacillus was isolated by MRS medium supplemented with CaCO3 to detect lactic acid Probiotic characteristics were tested according to the guidelines of WHO/ FAO, which include: producing extracellular enzymes, resistance to low pH and bile salts, and safety aspects Finally, these strains were identified according to Prokaryote – A Handbook on the Biology of Bacteria Results: We screened Lactobacillus strains with high probiotic potential and safe from 53 strains lactic bacteria had been isolated Seven strains showed antimicrobial activity against food poisoning bacteria, extracellular enzyme, high L-lactic acid, resistance to low pH and bile salts, nonhemolytic, the strains were *Khoa Công nghệ sinh học, Đại học Mở TPHCM **Khoa Dược, Đại học Y Dược TPHCM Tác giả liên lạc: PGS TS Trần Cát Đông ĐT: 08 38295641 – 127 Email: trancdong@gmail.com 182 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học sensitive to antibiotics tested Conclusion: In this work, 19 strains belong to Lactobacillus genus have been selected and identified Among them, seven strains meet the requirements for in vitro probiotic characteristic and safety tests according to the guideline of WHO/ FAO Keywords: Probiotics, lactic acid bacteria, Lactobacillus, bile resistance, acid tolerance, breast milk, meconium spp., Bacillus cereus, Staphylococcus aureus ATCC ĐẶT VẤN ĐỀ 25923, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, V Những năm gần đây, việc sử dụng vi parahaemolyticus, Streptococcus feacalis, khuẩn probiotic chất thay kháng sinh Streptococcus tiêu huyết β nhóm A thực phẩm quan tâm Một Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn sử dụng rộng rãi làm probiotic Lactobacillacae mà chúng Phân lập vi khuẩn lactic ta thu nhận từ nhiều nguồn khác Pha loãng mẫu đệm PBS (photphatse phân su em bé, tuyến sữa người mẹ, hạt buffered saline) với độ pha loãng 10-1 đến 10-3 kefir loại thực phẩm lên men Hút 100 μL dung dịch độ pha lỗng lên đĩa truyền thống Sự thích nghi tự nhiên nhiều thạch MRSA bổ sung CaCO3 trải Ủ 35oC vi khuẩn lactic môi trường ruột 24 đến 48 giờ/ 5% CO2 Quan sát khóm chất kháng khuẩn chúng tạo khuẩn môi trường, chọn khuẩn lạc có acid hữu bacteriocin cho vi khuẩn vòng tan CaCO3 xung quanh, tiến hành tạo lactic thuận lợi cạnh tranh so với vi chủng qua nhiều lần phân lập tiếp Tiến sinh vật khác dùng làm probiotic hành khảo sát đại thể, vi thể, catalase, oxidase, Tại Việt Nam có số chế phẩm probiotic, thành phần vi khuẩn Bacillus, số nhà sản xuất Việt Nam sản xuất chế phẩm chứa vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus, nguồn nguyên liệu hoàn toàn ngoại nhập, tính probiotic chưa chứng minh cách khoa học Để góp phần xây dựng sưu tập chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính tốt, chúng tơi tiến hành phân lập sàng lọc đặc tính probiotic chủng phân lập Nghiên cứu góp phần vào nỗ lực tự tạo chế phẩm probiotic có chứa Lactobacillus hồn tồn Việt Nam, với liệu khoa học chứng minh VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Chủng vi khuẩn nghiên cứu thu nhận từ nguồn mẫu rau lên men, sữa chua, kefir, phân su sữa mẹ Chủng vi khuẩn thử nghiệm khả đối kháng: Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella Chuyên Đề Dược Khoa định tính acid lactic Giống thu đuợc ni mơi trường MRS dịch thể giữ giống môi trường MRS bổ sung 20% glycerol, bảo quản 20oC(10) Phương pháp thử khả sinh enzym ngoại bào Thử nghiệm khả sinh số loại enzym như: protease (caseinase, gelatinase), amylase, lipase Chuẩn bị mơi trường TSA có bổ sung chất cảm ứng thích hợp Hoạt hóa chủng vi khuẩn cần thử nghiệm Chấm khoảng 10µL dịch khuẩn lên đĩa TSA, ủ 37OC/ 48 giờ/ 5% CO2 Đọc kết thuốc thử Lugol (amylase), thuốc thử TCA (gelatinase), quan sát vòng đục vòng xung quanh khóm (lipase caseinase)(2,5) Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn Chuẩn bị dịch vi khuẩn thị có nồng độ 12 x 108 tế bào/mL Chủng vi khuẩn cần thử nghiệm nuôi nhân giống môi trường MRS, ủ 37oC, 5% CO2 sau 48 Để tách 183 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 chiết bacteriocin thô ta tiến hành ly tâm 13000 vòng/phút, 20 phút, 4oC Dịch thu điều chỉnh pH NaOH 1M Sau tủa dung dịch amoni sulphat (40% bão hòa) Khuấy dung dịch 2h 4oC, sau ly tâm 20000 vòng/phút, 1h, 4oC Chất tủa huyền phù lại vào 25mL dung dịch đệm kali phosphat (pH= 7) Dịch khuẩn thị trải mơi trường MHA đục giếng có đường kính mm Nhỏ 50 µL dịch chuẩn bị vào giếng ủ 4oC 30 phút để chất lỏng khuếch tán dễ dàng thạch Cuối đĩa ủ điều kiện phù hợp cho vi khuẩn thị Khả kháng khuẩn dịch bacteriocin thô xác định cách đo đường kính vòng vơ khuẩn quanh giếng(1,4) Định lượng D/L- lactic acid Định lượng khả tạo D/L -lactic acid chủng lactic Kit phát định lượng D/L-lactic acid hãng Megazyme(6) Khảo sát khả chịu pH thấp muối mật Thử nghiệm pH : Các chủng vi khuẩn hoạt hóa Ly tâm 5000 vòng/ 10 phút 4oC, thu cắn huyền phù lại PBS (photphatse buffered saline) pH 7,4 tạo thành huyền dịch có độ đục McFarland 0.5 tương đương 108 CFU/mL Chuyển huyền dịch vi khuẩn vào bình nón chứa nước muối sinh lý chỉnh pH có giá trị là: 1,5; 2; 2,5.Ủ 37oC, % CO2 Ở thời điểm giờ, giờ, lấy 1mL dung dịch mẫu thử trung hòa pH = Tiến hành pha lỗng đến mật độ thích hợp đếm dung dịch đệm trải hộp thạch MRS agar Ủ 37oC, % CO2, 24 – 48 Đếm khóm tính số đơn vị sống vi khuẩn khảo sát Mỗi thử nghiệm tiến hành lần(3,4) Thử nghiệm muối mật : Các chủng vi khuẩn hoạt hóa mơi trường MRS, ủ qua đêm khoảng 18 - 24 Vi khuẩn pha loãng đến độ đục McFarland 0.5 tương đương 108 CFU/mL Lấy 1mL dịch vi khuẩn ly tâm, cho tiếp xúc với dịch muối mật với 184 nồng độ 0,3%, 0,5%, 1%, 1,5%, 2% 1giờ, giờ, Sau ly tâm rửa dịch mật Tiến hành pha lỗng đến mật độ thích hợp đếm dung dịch đệm trải hộp thạch MRS agar Ủ 37oC, % CO2, 24 - 48 Đếm khóm tính số đơn vị sống vi khuẩn khảo sát Mỗi thử nghiệm tiến hành lần(3,9) Phần trăm sống sót tính: Ni/Nx × 100, Ni = log CFU/mL sau thời gian nuôi cấy, Nx = log CFU/ mL thời gian Phương pháp thử khả huyết giải Hoạt hóa chủng vi khuẩn cần thử nghiệm Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn cấy lên môi trường thạch máu BA bổ sung 5% máu cừu, song song tiến hành với vi khuẩn đối chứng không dung huyết Ủ 37oC/5 % CO2 /24 giờ(4) Phương pháp thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh Xác định MIC phương pháp pha loãng kháng sinh canh lỏng theo CLSI, 2006 Các kháng sinh sử dụng bao gồm Penicillin, Ampicillin, Imipenem, Gentamycin, Vancomycin, Erythromycin, Clindamycin Pha lỗng kháng sinh vào mơi trường MHB để đạt dãy nồng độ 128, 64, 32, 16,…0,0625µg/mL cho vào giếng phiến 96 giếng 50 µL, với 50 µL huyền dịch vi khuẩn có nồng độ 106 CFU/mL Ủ 37oC/ 16-18 đọc kết quả(4,8) Phương pháp định danh vi khuẩn Các chủng chọn lọc định danh phương pháp sinh hóa theo khóa phân loại The Prokaryote - A Handbook on the Biology of Bacteria(7) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết phân lập Lactobacillus Từ mẫu rau lên men, sữa chua, kefir, phân su sữa mẹ, phân lập 82 chủng ký hiệu theo nguồn gốc mẫu Chọn lọc 53 chủng có dạng trực khuẩn, không sinh bào tử, catalase âm, oxidase âm, sinh acid lactic Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Kết sinh enzym hoạt tính kháng khuẩn Từ 53 chủng thu thử nghiệm khả sinh enzym hoạt tính kháng khuẩn, với hai tiêu chí đối kháng tối thiểu vi khuẩn gây bệnh trở lên đối Nghiên cứu Y học kháng tối thiểu vi khuẩn gây bệnh trở lên sinh tối thiểu loại enzym, chọn 22 chủng thỏa mãn điều kiện (R3, R4, R6, R9, R14, K5, K6, K7, K8, K9, K13, K14, K15, S1, S2, S3, S6, S7, S8, Y1, Y7, Y9) Hình Thử nghiệm khả sinh enzym protease S.aureus Đối kháng yếu B.cereus Đối kháng mạnh Salmonella E.coli Hình Thử nghiệm khả kháng khuẩn Kết định lượng D/L- lactic acid Từ 22 chủng sàng lọc bước trên, sử dụng kít định lượng, chúng tơi chọn 19 chủng có tỷ lệ L/D lớn 0.9 Điều cho thấy chủng sinh L-lactic acid cao, chiếm 86,4% tổng số Kết khảo sát khả chịu pH thấp muối mật 19 chủng chọn lọc tiếp tục khảo sát khả chịu pH thấp, tiến hành thử nghiệm chủng ba mức pH Chuyên Đề Dược Khoa 1,5; 2,5 muối mật nồng độ 0,3%; 0,5%; 1%; 1,5%; 2% khoảng thời gian từ đến Theo Biểu đồ 1, 19 chủng thử nghiệm chịu đựng acid muối mật, ta thấy pH 2,5, chủng có tỷ lệ sống ≥ 60% sau giờ, đặc biệt chủng S2 có khả tồn phát triển điều kiện Ở nồng độ muối mật 0,3% sau hầu hết chủng có tỷ lệ sống cao 90%, số chủng có khả tăng trưởng 185 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học Tỉ lệ sống chủng pH Tỉ lệ sống chủng pH 1,5 70 100 T1 T2 T3 60 T1 T2 T3 80 Tỉ Lệ Sống (%) Tỉ lệ sống (%) 50 40 30 60 40 20 20 10 0 K5 R4 S1 S2 S6 K6 S7 R6 Y1 R9 K9 R14 Y7 K13 Y9 S8 K15 K7 K14 K5 R4 S1 S2 S6 K6 S7 R6 Y1 R9 K9 R14 Y7 K13 Y9 S8 K15 K7 K14 Chủng Thử Nghiệm Chủng thử nghiệm Tỉ lệ sống chủng pH 2,5 120 Tỉ lệ sống chủng muối mật 0,3% 140 T1 T2 T3 100 100 Tỉ lệ sống (%) 80 Tỉ Lệ Soáng (%) T1 T2 T3 120 60 80 60 40 40 20 20 0 K5 R4 S1 S2 S6 K6 S7 R6 Y1 R9 K9 R14 Y7 K13 Y9 S8 K15 K7 K14 K5 R4 S1 S2 S6 K6 S7 R6 Y1 R9 K9 R14 Y9 K14 K7 K15 S8 Y7 K13 Chủng thử nghiệm Chủng thử nghiệm Tỉ lệ sống chủng muối mật 0,5% Tỉ lệ sống chủng muối mật 1% 120 140 T1 T2 T3 100 100 Tỉ lệ sống (%) 80 Tỉ lệ sống (%) T1 T2 T3 120 60 80 60 40 40 20 20 0 K5 R4 S1 S2 S6 K6 S7 R6 Y1 R9 K9 R14 Y9 K14 K7 K15 S8 Y7 K13 K5 R4 S1 S2 S6 K6 S7 R6 Y1 R9 K9 R14 Y9 K14 K7 K15 S8 Y7 K13 Chủng thử nghiệm Chủng thử nghiệm Tỉ lệ sống chủng muối mật 1,5% 120 Tỉ lệ sống chủng muối mật 2% 100 T1 T2 T3 T1 T2 T3 100 80 Tỉ lệ sống (%) Tỉ lệ sống (%) 80 60 60 40 40 20 20 0 K5 R4 S1 S2 S6 K6 S7 R6 Y1 R9 K9 R14 Y9 K14 K7 K15 S8 Y7 K13 Chủng thử nghiệm K5 R4 S1 S2 S6 K6 S7 R6 Y1 R9 K9 R14 Y9 K14 K7 K15 S8 Y7 K13 Chủng thử nghiệm Biểu đồ Tỷ lệ sống chủng thử nghiệm theo thời gian 1, pH 1,5; 2; 2,5 muối mật nồng độ 0,3%; 0,5%; 1%; 1,5%; 2% 186 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học Hình Kết khơng tiêu huyết thạch máu BA 19 chủng thử nghiệm Kết thử nghiệm khả huyết giải Theo WHO/FAO thử nghiệm hemolysin bước sàng lọc tính gây bệnh chủng để đảm bảo tính an tồn probiotic 19 chủng thử nghiệm khơng có enzym hemolysin (khơng có khả tiêu huyết), chủng tiếp tục thử nghiệm khả đề kháng kháng sinh Kết thử nghiệm khả đề kháng kháng sinh Đây bước đánh giá tính an tồn chủng tuyển chọn làm probiotic, khảo sát khả nhạy cảm với kháng sinh phương pháp pha loãng 19 chủng khảo sát, đọc kết sau 20-24h/37oC biện giải theo MIC Breakspoint áp dụng cho Lactobacillus theo CLSI (2006) Trong 19 chủng khảo sát có chủng (K5, R4, S1, S7, R14, S8, Y9) nhạy cảm với tất kháng sinh thử nghiệm, chủng kháng Vancomycin, chủng kháng với Erythromycin Kết định danh sinh hóa Lactic acid isomer Amydalin Cellobiose Galactose Lactose Maltose Mannitol Mannose Melibiose Raffinose Salicin Sucrose Trehalose Hệ số tương đồng % Định danh K5 Lys-DAsp DL -/+ - - - + + d - d - - - - d 100 L helveticus S1 Lys-DAsp DL -/+ - + + + d d - + d d + + d 100 L gasseri S2 Lys-DAsp DL -/+ - + + + d d - + d d + + d 100 L gasseri S7 Lys-DAsp DL -/+ - + + + + + - + d d + + d 100 L.acidophilus Test sinh hóa Chủng Tăng trưởng 15/45oC NH3 từ Arginin Peptidoglyan type Bảng Kết định danh nhóm vi khuẩn lactic lên men đồng hình group A R6 Lys-DAsp DL +/+ + + + + d + - + d d + + d 100 L.johnsonii Y7 Lys-DAsp DL -/+ - + + + + + - + d d + + d 100 S8 Lys-DAsp L -/+ - - - + + + + - + + + + + 100 K13 Lys-DAsp DL -/+ - - - + + d - d - - - - d 100 K14 Lys-DAsp L -/+ - - - + + + + - + + + + + 100 L.acidophilus L.salivarius subsp salivarius L helveticus L.salivarius subsp salivarius Cellobiose Esculin Galactose Maltose Mannose Melezitose Melibiose Raffinose Ribose Sucrose Trehalose Xlylose Hệ số tương đồng % Lys-DAsp +/Lys-DAsp +/- Arabinose K6 R14 NH3 từ Arginin Chủng Tăng trưởng 15/45oC Test sinh hóa Peptidoglyan type Bảng Kết định danh nhóm vi khuẩn lactic lên men dị hình group C Định danh + + + - - d - d - + + - - + - d - + + d - - d - 100 100 L.brevis L malefermentans Chuyên Đề Dược Khoa 187 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học Peptidoglyan type Lactic acid isomer Tăng trưởng 15/45oC Amydalin Arabinose Cellobiose Esculin Gluconate Mannitol Melezitose Melibiose Raffinose Ribose Sorbitol Sucrose Xylose Hệ số tương đồng % Bảng Kết định danh nhóm vi khuẩn lactic lên men dị hình khơng bắt buộc group B R4 S6 K7 Y1 R9 K9 Y9 mDpm Lys-DAsp Lys-DAsp Lys-DAsp mDpm mDpm Lys-DAsp DL L L L DL DL L +/+/+ +/+ +/+/+/+/- + + + + + + + + d d d d - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + d + + + + + + + + + - + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + d d - 100 100 100 100 100 100 100 K15 Lys-DAsp L +/d + - + + + + + - - + d + - 100 Test sinh hóa Chủng 19 chủng cho kết sinh hóa phù hợp với 12 loài Lactobacillus: L helveticus, L gasseri, L acidophilus, L johnsonii, L salivarius subsp salivarius, L pentosus, L rhamnosus, L casei, L plantarum, L paracasei subsp paracasei, L brevis, L malefermentans KẾT LUẬN Chúng chọn chủng Lactobacillus đáp ứng tiêu chí vi khuẩn dùng làm probiotic theo hướng dẫn WHO/FAO TÀI LIỆU THAM KHẢO 188 Buntin N., Chanthachum S., Hongpattarakere T (2008) Screening of lactic acid bacteria from gastrointestinal tracts of marine fish for their potential use as probiotic Songklanakarin J Sci Technol 30: 141-148 Cabo M.L et al (1999) A method for bacteriocins quantification Journal of applied microbiology 87: 907-914 10 Định danh L pentosus L.rhamnosus L.rhamnosus L.casei L plantarum L plantarum L.casei L paracasei subsp paracasei Cukrowska B., Motyl I., Kozáková H., Schwarzer M., Górecki R K., Klewicka E., Śliżewska K., Libudzisz Z (2009) Probiotic Lactobacillus Strains: in vitro and in vivo Studies Folia Microbiol 54(6): 533-537 Dunne C., Liam O’M et al (2001) In vitro selection criteria for probiotic bacteria of human origin: correlation with in vivo findings American Society for Clinical Nutrition 73: 386-392 John R.Tagg., Adnan S.Dajani., Lewis W.Wannamaker (1976) Bacteriocins of Gram-possitive bacteria American Scocienty for Microbiology 3: 722-726 Livia Alm (1982) Effect of Fermentation on L(+) and D(−) Lactic Acid in Milk Journal of Dairy Science 65: 515-520 Martin D., Stanley F., et al (2006) The Prokaryotes - A Handbook on the Biology of Bacteria Springer 3: 320 – 372 Methods for Antimicrobial Dilution and Disk Susceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidious Bacteria; Approved Guideline (2006) M45-A 26, 19: 24-25 Mourad K., Nour-Eddine K (2006) In vitro preselection criteria for probiotic Lactobacillus plantanrum strains of fermented olives origin International Journal of Probiotics and Prebiotics 1: 27-32 Nguyễn Lân Dũng (1983) Thực tập Vi sinh vật học NXB Đại học & Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội Chuyên Đề Dược Khoa ... sưu tập chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính tốt, chúng tơi tiến hành phân lập sàng lọc đặc tính probiotic chủng phân lập Nghiên cứu góp phần vào nỗ lực tự tạo chế phẩm probiotic có chứa Lactobacillus... tạo lactic thuận lợi cạnh tranh so với vi chủng qua nhiều lần phân lập tiếp Tiến sinh vật khác dùng làm probiotic hành khảo sát đại thể, vi thể, catalase, oxidase, Tại Vi t Nam có số chế phẩm probiotic, ... Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn sử dụng rộng rãi làm probiotic Lactobacillacae mà chúng Phân lập vi khuẩn lactic ta thu nhận từ nhiều nguồn khác Pha loãng mẫu đệm PBS (photphatse phân su em bé, tuyến