PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG THỰC VẬT Ở VƢỜN QUỐC GIA CÁT TIÊN

Từ xưa đến nay, năng suất cây trồng luôn là vấn đề quan tâm hàng đầu của mọi nền nông nghiệp. Do đó đã có rất nhiều phương pháp được sử dụng nhằm cải thiện năng suất cũng như tăng cường sức đề kháng của cây trồng với mầm bệnh trong đó phổ biến nhất là sử dụng thuốc trừ sâu và phân bón hoá học. Tuy nhiên các biện pháp này còn rất nhiều hạn chế như: gây ô nhiễm môi trường, thoái hoá đất và ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ con người. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, các biện pháp và xu hướng mới đã ra đời với mục tiêu xây dựng một nền nông nghiệp bền vững, thân thiện với môi trường mà vẫn đạt năng suất cao. Bên cạnh đó, gần đây nhiều công bố khoa học cho thấy tiềm năng sử dụng tương tác có lợi giữa vi sinh vật với cây trồng để kích thích sinh trưởng ở thực vật, trong đó các vi sinh vật có khả năng cố định nitrogen và biến dưỡng methyl đang thu hút được rất nhiều sự quan tâm. Khả năng kích thích sinh trưởng thực vật của các chủng vi sinh vật này được biết đến thông qua cơ chế cố định đạm hoặc sự sản sinh các hợp chất sinh học như các phytohormone, vitamin và cả một số loại enzyme có khả năng ức chế sự phát triển của mầm bệnh qua đó kích thích sinh trưởng của cây chủ. Chính bởi những ưu điểm này mà việc tìm ra các chủng vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật đang là một hướng đi đầy tiềm năng. Đặc biệt trong điều kiện nước ta là một trong những quốc gia có đa dạng sinh học phong phú với các khu bảo tồn thiên nhiên còn hoang dã, thì tiềm năng tìm thấy các chủng vi sinh vật có ích trên là rất lớn.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG THỰC VẬT Ở VƢỜN QUỐC GIA CÁT TIÊN Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003-2007 Sinh viên thực hiện: PHAN TRUNG HẬU Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************************** PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG THỰC VẬT Ở VƢỜN QUỐC GIA CÁT TIÊN Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS BÙI VĂN LỆ PHAN TRUNG HẬU ThS KIỀU PHƢƠNG NAM Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 LỜI CẢM ƠN Khóa luận được hoàn thành với sự quan tâm giúp đỡ rất nhiều các thầ y cô, các anh chị các bạn Em xin gửi lời cảm ơn chân thà nh đế n: PGS.TS Bùi Văn Lê ̣ , người đã tâ ̣n tin ̀ h hướng dẫn và ta ̣o mo ̣i điề n kiê ̣n để em thực hiê ̣n khóa luâ ̣n này Thạc sĩ Kiều Phương Nam , người thầy hết lòng tận tụy tuyền đạt kinh nghiệm q báo suốt quá trình làm đề tài Em xin cảm ơn thầy rất nhiều! Quý thầy cô môn công nghệ sinh học, các thầy cô trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh dạy truyền đạt cho chúng em kiến thức quý báu suốt năm học qua Em cảm ơn anh Bình cùng toàn thể các bạn sinh viên năm tư trường ĐH Khoa ho ̣c Tự nhiên , ĐH Mở sẵn sàng giúp đỡ và đô ̣ng viên những lúc gă ̣p khó khăn đề tài Cảm ơn tất các thành viên lớp CNSH 29 các ba ̣n thân đã cùng chia sẻ nỗi buồn vui năm đa ̣i ho ̣c Và hết , cảm ơn ba má , các anh chị đã chăm lo , ủng hộ, tin tưởng khích lệ lúc khó khăn nhất để có thể vững bước đường chọn Tháng 9/2007 Phan Trung Hậu iii TÓM TẮT Đề tài “Phân lập định danh số vi sinh vật có khả kích thích sinh trƣởng thực vật vƣờn quốc gia Cát Tiên” được thực tại trại thực nghiệm sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007 Kết quả: - Phân lập làm được 75 chủng vi sinh vật từ vườn Quốc Gia Cát Tiên Trong đó có 45 chủng môi trường chọn lọc MMS (khoáng MS+1% methanol) 30 chủng môi trường chọn lọc MSo (môi trường MS loại bỏ các thành phần chứa nitrogen) - Sàng lọc qua hệ thống (khả tác động lên chồi thuốc lá điều kiện in vitro khả kích thích hạt nảy mầm hạt đậu xanh điều kiện in vivo), chúng chọn lọc được chủng vi sinh vật có khả kích thích sinh trưởng thực vật bao gồm: 6012a, 6019a, 6019b, 6021a, 6027a, ON16a, ON20a, ON28a ON29b Kết định danh: Chủng 6012a 6027a được định danh tới cấp độ giống vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium Riêng chủng 6012a có thể loài mới Các chủng 6019a, 6019b, 6021a, ON16a, ON20a, ON28a, ON29b nấm men có đặc điểm tương đồng với các giống nấm men sau: - Các chủng 6019b, ON16a, ON20a, ON29b có điểm tương đồng với giống Pichia - Chủng 6019a có điểm tương đồng với giống Cocidiascusc - Chủng 6021a có điểm tương đồng với giống Rhodotorula - Chủng ON28a có điểm tương đồng với giống Endomycopsis iv MỤC LỤC CHƢƠNG .TRANG Trang tựa i Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Mục lục v Danh sách các chữ viế t tắ t viii Danh sách các hình ix Danh sách các sơ đồ biểu đồ xi Danh sách các bảng xii Chƣơng 1: MỞ ĐẦU Error! Bookmark not defined 1.1 Đặt vấn đề Error! Bookmark not defined 1.2 Mục tiêu Error! Bookmark not defined 1.3 Yêu cầu Error! Bookmark not defined Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Error! Bookmark not defined 2.1 Vườn Quốc gia Cát Tiên Error! Bookmark not defined 2.2 Sơ lược sự tương tác vi sinh vật thực vật Error! Bookmark not defined 2.2.1 Phân nhóm vi sinh vật tương tác với thực vật dựa vào chất sự tương tác 2.2.1.1 Các vi sinh vật ức chế tác hại mầm bệnh lên thực vật Error! Bookmark not defined 2.2.1.2 Vi sinh vật gia tăng dinh dưỡng cho Error! Bookmark not defined 2.2.2 Vi khuẩn sản xuất các chất kích thích lên sự sinh trưởng thực vật Error! Bookmark not defined 2.3 Các phương pháp định danh vi sinh vật Error! Bookmark not defined 2.3.1 Phương pháp truyền thống Error! Bookmark not defined v 2.3.1 Phương pháp đại Error! Bookmark not defined vi Chƣơng 3: VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP Error! Bookmark not defined 3.1 Thời gian địa điểm Error! Bookmark not defined 3.2 Vật liệu Error! Bookmark not defined 3.2.1 Mẫu thí nghiệm Error! Bookmark not defined 3.2.2 Thiết bị dụng cụ Error! Bookmark not defined 3.2.3 Hóa chất Error! Bookmark not defined 3.2.3.1 Môi trường phân lập làm vi sinh vật biến dưỡng methyl (MMS)……………… Error! Bookmark not defined 3.2.3.2 Môi trường chọn lọc vi sinh vật cố định nitơ (MSO) Error! Bookmark not defined 3.2.3.3 Môi trường nhân sinh khối vi khuẩn (CMS) Error! Bookmark not defined 3.2.3.4 Các môi trường khác Error! Bookmark not defined 3.3 Phương pháp thí nghiệm Error! Bookmark not defined 3.3.1 Phân lập làm Error! Bookmark not defined 3.3.1.1 Lấy mẫu tăng sinh mẫu: Error! Bookmark not defined 3.3.1.2 Phân lập chọn lọc Error! Bookmark not defined 3.3.1.3 Giữ giống ………………………………………………………………….Error! Bookmark not defined 3.3.2 Định tính Error! Bookmark not defined 3.3.2.1 Khảo sát khả kích thích sinh trưởng thực vật các chủng kiện in vitro in vivo Error! Bookmark not defined 3.3.2.2 Xử lý thống kê Error! Bookmark not defined 3.3.2.3 Quan sát hình thái Error! Bookmark not defined 3.3.3 Định danh vi khuẩn Error! Bookmark not defined 3.3.3.1 Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Error! Bookmark not defined 3.3.3.2 Đặc điểm sinh lý Error! Bookmark not defined 3.3.3.3 Đặc điểm sinh hóa Error! Bookmark not defined vii 3.3.3.4 So sánh tính tương đồng di truyền dựa hệ số Jascard Error! Bookmark not defined 3.3.3.5 Phân tích trình tự rDNA 16S Error! Bookmark not defined 3.3.4 Định danh nấm men Error! Bookmark not defined 3.3.4.1 Khảo sát các đặc điểm hình thái nấm men Error! Bookmark not defined 3.3.4.2 Xác định số đặc tính sinh hóa nấm men Error! Bookmark not defined Chƣơng 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 4.1 Kết phân lập làm Error! Bookmark not defined 4.2 Kết sàng lọc các chủng có khả tương tác với thực vật Error! Bookmark not defined 4.2.1 Khảo sát khả kích thích tăng trưởng thực vật các chủng VSV điều kiện in vitro Error! Bookmark not defined 4.2.2 Khảo sát khả kích thích sự nảy mầm hạt giống Error! Bookmark not defined 4.3 Định danh vi sinh vật Error! Bookmark not defined 4.3.1 Kết quan sát hình thái Error! Bookmark not defined 4.3.2 Định danh vi vi khuẩn 59 4.3.2.1 Kết khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 59 4.3.2.2 Phân tích trình tự rDNA 16S .70 4.3.3 Định danh nấm men .77 4.3.3.1 Quan sát các đặc điểm hình thái nấm men 77 4.3.3.2 Các đặc điểm sinh lí, sinh hóa .80 Chƣơng 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ Error! Bookmark not defined.2 5.1 Kết luận Error! Bookmark not defined.2 5.2 Đề nghị Error! Bookmark not defined viii TÀI LIỆU THAM KHẢO ………………………………………… ………….85 PHỤ LỤC ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Bp Base pair EDTA Ethylene-Diamine-Tetraacetic-Acid MS Murashige Skoog, 1962 CMS Môi trường bổ sung 2% cao thịt 2% casein MMS môi trường Methanol Minerol Salts Gram (-) Gram âm Gram (+) Gram dương PPFM Pink-Pigment Facultative Methylotrophic PCR Polymerase chain reaction MSo Môi trường khoáng MS không có nitrogen DNA Deoxyribonucleotide Acid Taq Tag polymerase LDC Lysine decarboxylase PHB Poly-beta-hydroxybutyrate viii ... chủng vi sinh vật có ích rất lớn 2 Trên sở đó, chúng tiến hành đề tài: “ Phân lập định danh số vi sinh vật có khả kích thích sinh trƣởng thực vật vƣờn Quốc gia Cát Tiên? ?? 1.2 Mục tiêu  Phân. .. tài ? ?Phân lập định danh số vi sinh vật có khả kích thích sinh trƣởng thực vật vƣờn quốc gia Cát Tiên? ?? được thực tại trại thực nghiệm sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia. .. DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************************** PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ VI SINH VẬT CĨ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG THỰC