Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá tác dụng của scopolamine đến khả năng học tập và trí nhớ không gian chuột nhắt thông qua bài tập mê lộ nước (Morris water maze). Đối tượng và phương pháp: chuột nhắt trắng, giống đực, khỏe mạnh.
Tạp chí y - dợc học quân số 9-2016 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA SCOPOLAMINE LÊN KHẢ NĂNG HỌC TẬP VÀ TRÍ NHỚ KHƠNG GIAN CỦA CHUỘT NHẮT QUA BÀI TẬP MÊ LỘ NƯỚC Cấn Văn Mão*; Đinh Quốc Bảo* TÓM TẮT Mục tiêu: đánh giá tác dụng scopolamine đến khả học tập trí nhớ khơng gian chuột nhắt thông qua tập mê lộ nước (Morris water maze) Đối tượng phương pháp: chuột nhắt trắng, giống đực, khỏe mạnh, 10 - 12 tuần tuổi chia ngẫu nhiên thành nhóm: uống NaCl 0,9% tiêm scopolamine: scop 0.5 (0,5 mg/kg), scop 1.0 (1 mg/kg), scop 1.5 (1,5 mg/kg) nhóm chứng (uống tiêm NaCl 0,9%) Kết quả: tập mê lộ nước, scopolamine liều 0,5; 1,5 mg/kg/ngày làm tăng thời gian quãng đường tìm thấy bến đỗ chuột thí nghiệm so với chuột chứng (từ ngày đến ngày 7), đồng thời giảm thời gian chuột bơi góc phần tư trước có đặt bến đỗ (ngày 8) Kết luận: kết nghiên cứu dùng làm tiền đề cho nghiên cứu thuốc, phương pháp cải thiện trí nhớ động vật thực nghiệm * Từ khóa: Scopolamine; Bài tập mê lộ nước; Trí nhớ; Học tập Investigate Effects of Scopolamine on Learning Ability and Spatial Memory in Mice by Using Morris Water Maze Test Summary Objectives: To assess the effect of scopolamine on learning ability and spatial memory in mice in Morris water maze Subjects and methods: 80 male, healthy mice (10 - 12 weeks of age) were randomly divided into scopolamine groups (0.5, 1.0 and 1.5 mg/kg scopolamine, respectively, i.p) and the control group (saline, i.p) Results: In Morris water maze, scopolamine (dose of 0.5 mg; mg and especially 1.5 mg/kg/day, i.p) increased escape latencies and swimming distance in scopolamine-treated group compared to controls (from 1st to 7th day), while reducing the swimming time within the platform quadrant (day 8) Conclusion: These results can apply for medical researches on memory improvement in experimental animals * Key words: Scopolamine; Morris water maze; Memory; Learning ĐẶT VẤN ĐỀ Suy giảm trí nhớ phổ biến người cao tuổi, khoảng 50 - 60% tổng số trường hợp với người > 65 tuổi bị bệnh Alzheimer [6], nhiều nghiên nhằm tìm hợp chất có khả điều trị hỗ trợ bệnh Hiện nay, nhiều mơ hình gây tổn thương trí nhớ kiểu bệnh Alzheimer động vật thực nghiệm theo chế khác sử dụng hóa chất, gây tổn thương vùng não, biến đổi gen [1] Scopolamine, chất đối kháng thụ thể acetylcholine, cho làm suy giảm trình nhận thức, học tập, đặc biệt nhận thức trí nhớ khơng gian [7] * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Cấn Văn Mão (canvanmao2011@gmail.com) Ngày nhận bài: 30/09/2016; Ngày phản biện đánh giá báo: 10/11/2016 Ngày báo đăng: 21/11/2016 25 T¹p chí y - dợc học quân số 9-2016 S dụng scopolamine gây suy giảm trí nhớ mơ hình áp dụng cho thử nghiệm thuốc cải thiện trí nhớ theo chế kháng enzym acetylcholinesterase [3, 9] So với mơ hình khác, mơ hình có ưu điểm dễ thực (tiêm scopolamine vào phúc mạc), tỷ lệ khả sống sót chuột cao Bài tập mê lộ nước Richard G Morris mô tả năm 1981 [8] để đánh giá học tập, trí nhớ khơng gian trí nhớ dài hạn động vật, số đặc điểm như: khơng cần huấn luyện trước, có độ tin cậy cao thay đổi cấu hình dụng cụ, quy trình thí nghiệm thực nhiều lồi (chuột, khỉ…) Chính vậy, chúng tơi thực đề tài nhằm: Đánh giá ảnh hưởng scopolamine đến khả học tập trí nhớ khơng gian chuột nhắt trắng thông qua tập mê lộ nước ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Chuột nhắt trắng, giống đực, khỏe mạnh, 10 - 12 tuần tuổi, trọng lượng 25 30 g Ban Cung cấp Động vật Thí nghiệm, Học viện Quân y cung cấp Chuột chăm sóc ni phòng thống mát, ăn uống đầy đủ, chu kỳ sáng tối trì 12/12 Chia 80 chuột thành nhóm: scop 0.5, scop 1.0, scop 1.5 nhóm chứng (mỗi nhóm 20 chuột) Phương tiện hóa chất * Phương tiện: - Buồng thực nghiệm qy vải đen có kích thước 150 x 150 x 150 cm để cách ly với môi trường xung quanh, tránh yếu tố gây nhiễu - Mê lộ nước (Morris water maze): bể nước tơn, hình tròn, sơn đen, đường kính 75 cm, cao 35 cm Bến đỗ: vị trí để chuột dừng chân, miếng nhựa, có chân đế, cao 28 cm, đường kính cm, đặt vị trí cố định trung tâm góc phần tư bể nước, mặt bến đỗ chìm cách mặt nước cm (hình 1) Bến đỗ Hình 1: Mê lộ nước * Hóa chất: - Dung dịch NaCl 0,9% Euro-Med (Philippine) sản xuất - Scopolamine: scopolamine hydrobromid trihydrate (Sigma Aldrich) 26 Tạp chí y - dợc học quân số 9-2016 Phương pháp nghiên cứu * Sử dụng thuốc: Tiêm vào màng bụng chuột (30 phút trước bắt đầu tập, gam cân nặng tương ứng với thể tích tiêm 0,01 ml dung dịch) Bảng 1: Nhóm Lơ chứng Lơ scop 0,5 mg Lơ scop mg Lô scop 1,5 mg Tiêm NaCl 0,9% Scopolamine liều 0,5 mg (0,01 ml/g thể trọng) Scopolamine liều mg (0,01 ml/g thể trọng) Scopolamine liều 1,5 mg (0,01 ml/g thể trọng) Chuột sử dụng thuốc thời điểm ngày, từ ngày đến ngày * Quy trình thực tập mê lộ nước Morris: Chia động vật làm nhóm, chuột đánh số khác Động vật thả cho bơi tự bể nước khơng có bến đỗ để làm quen 60 giây Sau ngày tiến hành thử nghiệm với động vật - Từ ngày đến ngày 7: + Thả chuột vào mê lộ nước góc ngẫu nhiên từ - quy ước, đầu động vật hướng vào thành mê lộ, vị trí góc phần tư Ghi lại thả động vật góc phần tư + Khi động vật tìm thấy bến đỗ, để lại 10 giây Sau nhấc động vật ra, đặt vào hộp đựng khăn thấm nước, cho nghỉ 60 giây, tiếp tục thao tác với góc lại + Thời gian kiểm định lần thả động vật 60 giây, hết 60 giây khơng tìm thấy bến đỗ nhấc động vật lên bến đỗ 10 giây - Ngày thứ 8: + Bỏ bến đỗ, thả chuột vào mê lộ nước 120 giây từ góc đối diện với góc đặt bến đỗ trước Sau nhấc chuột tiến hành với chuột + Toàn hoạt động chuột tập ghi hình phân tích tự động phần mềm Any maze (Stoelting, Mỹ) * Các số nghiên cứu: - Thời gian quãng đường chuột bơi từ thả vào mê lộ đến tìm bến đỗ (ngày đến ngày 7) - Thời gian chuột bơi góc phần tư trước đặt bến đỗ (ngày 8) * Xử lý số liệu: Kết nghiên cứu sau phân tích xuất dạng file excel Tính tốn số liệu giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, lập bảng so sánh thống kê thơng số thu nhóm chuột phần mềm SPSS 16.0 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Trong tập này, tiến hành qua hai giai đoạn: giai đoạn học tập hình thành trí nhớ (từ ngày đến 7) giai đoạn gợi lại trí nhớ (ngày thứ 8) Thời gian quãng đường chuột bơi mê lộ nước từ thả đến tìm thấy bến đỗ (từ ngày đến 7) thông số thể khả học tập hình thành trí nhớ động vật (acquisition memory) Thời gian chuột bơi góc phần tư trước đặt bến đỗ (ngày thứ 8) thông số thể khả gợi lại trí nhớ hình thành q trình học tập 27 T¹p chÝ y - dợc học quân số 9-2016 Thi gian tỡm thấy bến đỗ Hình 2: Thời gian chuột bơi đến tìm thấy bến đỗ Kết nghiên cứu cho thấy thời gian tìm bến đỗ chuột tất nhóm có xu hướng giảm dần từ ngày đến ngày Có khác biệt đáng kể thời gian chuột bơi tìm thấy bến đỗ theo ngày (phân tích two way ANOVA repeated) nhận thấy [F (4.152, 74.731) = 30.041, p < 0,001] theo nhóm [F (2.651, 47.711) = 23.057, p < 0,001], khơng có tương tác hai yếu tố lên khác biệt thời gian chuột bơi đến tìm thấy bến đỗ So sánh thời gian tìm thấy bến đỗ (phân tích one way ANOVA) nhóm scopolamine với nhóm chứng mơt ngày thấy: chuột thuộc nhóm scop 0,5 cần nhiều thời gian bơi để tìm thấy bến đỗ so với chuột thuộc nhóm chứng ngày ngày (p < 0,05) Chuột thuộc nhóm scop 1,0 cần nhiều thời gian để tìm thấy bến đỗ so với chuột thuộc nhóm chứng ngày ngày (p(6) < 0,05, p(7) < 0,01) Chỉ số nhóm scop 1,5 ngày đến dài so với nhóm chứng (p (1) < 0,01, p(2 ÷ 7) < 0,001) (p(n): so sánh thời gian ngày n nhóm) Qng đường tìm thấy bến đỗ Hình 3: Quãng đường chuột bơi đến tìm thấy bến 28 Tạp chí y - dợc học quân sè 9-2016 Kết nghiên cứu cho thấy: có khác biệt đáng kể quãng đường chuột bơi đến tìm thấy bến đỗ theo ngày (phân tích two way ANOVA repeated) [F (4.073, 73.306) = 14.769, p < 0,001] theo nhóm (cách điều trị) [F (2.734, 49.208) = 13.281, p < 0,001], khơng có tương tác hai yếu tố lên khác biệt quãng đường chuột bơi đến tìm thấy bến đỗ So sánh qng đường tìm thấy bến đỗ (phân tích one way ANOVA) nhóm scopolamine với nhóm chứng Scop 1.5 ngày thấy: chuột thuộc nhóm scop 0,5 có qng đường bơi đến tìm thấy bến đỗ dài so với nhóm chứng ngày 1, ngày 6, (p(1 2) < 0,05, p(6 7) < 0,01) Chuột thuộc nhóm scop 1,0 có qng đường bơi đến tìm thấy bến đỗ dài so với nhóm chứng ngày 1, 3, 6, (p(1 3) < 0,05, p(6) < 0,01, p(7) < 0,001) Chỉ số nhóm scop 1,5 ngày 1, ngày đến dài so với nhóm chứng (p(2) < 0,05, p(1 5) < 0,01, p(4,6 7) < 0,001) (p(n): so sánh quãng đường ngày n nhóm) Scop 1.0 Scop 0.5 Chứng Ngày Ngày Hình 4: Hình ảnh đường bơi chuột ngày theo nhóm Thời gian chuột bơi góc phần tư trước đặt bến đỗ Bảng 2: Thời gian (giây) chuột bơi góc phần tư ngày Chỉ số n Góc (1) Góc (2) Góc (3) Góc (4) p Chứng (a) 20 37,33 ± 8,63 30,90 ± 9,88 26,84 ± 7,32 25,10 ± 8,34 p1,3 < 0,05 p1,4 < 0,01 Scop 0.5 (b) 19 35,12 ± 7,64 36,65 ± 12,59 24,12 ± 6,32 20,11 ± 8,27 p1,3 < 0,01 p1,4 < 0,01 Nhóm Scop 1.0 (c) 19 34,38 ± 8,73 31,42 ± 8,70 29,52 ± 7,46 24,67 ± 6,36 p1,4 < 0,01 Scop 1.5 (d) 24 26,71 ± 7,87 33,91 ± 10,13 31,82 ± 7,01 22,55 ± 7,28 p1,2 < 0,01 pa,d < 0,01 pb,d < 0,01 pc,d < 0,01 > 0,05 > 0,05 > 0,05 p 29 Tạp chí y - dợc học quân số 9-2016 Kết nghiên cứu cho thấy: chuột thuộc nhóm chứng có thời gian bơi góc phần tư (góc đặt bến đỗ trước đây) nhiều so với góc lại (p1,3< 0,05, p1,4 < 0,01) giá trị cao so với chuột thuộc nhóm scop 1,5 Chuột thuộc nhóm scop 0,5 nhóm scop 1,0 có xu hướng giảm dần thời gian bơi góc lại có xu hướng tăng dần Chuột thuộc nhóm scop 1,5 có số thấp nhóm chứng thời gian bơi nhiều chuột thuộc nhóm góc (khơng phải góc trước đặt bến đỗ) Scop 1,5 Scop 1,0 Scop 0,5 Chứng Hình 4: Hình ảnh đường bơi chuột ngày theo nhóm Nghiên cứu chúng tơi thấy: giai đoạn học tập hình thành trí nhớ, chuột tiêm scopolamine (liều 0,5 mg/kg, mg/kg 1,5 mg/kg) cần nhiều thời gian quãng đường vận động dài so với chuột nhóm chứng tất ngày Trong đó, chuột tiêm scopolamin liều 1,5 mg có thời gian quãng đường bơi đến tìm thấy bến đỗ lớn so với 30 chuột thuộc nhóm lại Ở giai đoạn gợi lại trí nhớ (ngày thứ 8), chuột nhóm chứng có thời gian bơi góc phần tư trước đặt bến đỗ nhiều so với chuột tiêm scopolamine Trong đó, chuột tiêm scopolamin liều 1,5 mg/kg có thời gian bơi góc phần tư trước đặt bến đỗ so với chuột thuộc nhóm li Tạp chí y - dợc học quân số 9-2016 Các tác giả như: Manish Kumar Saraf CS (2011) nghiên cứu tác dụng gây suy giảm trí nhớ scopolamine chuột nhắt trắng tập mê lộ nước, với dải liều 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg mg/kg cho thấy với liều 0,5 mg/kg gây tăng thời gian quãng đường chuột bơi từ thả đến tìm thấy bến đỗ từ ngày đến ngày làm giảm đáng kể thời gian chuột bơi góc phần tư (góc đặt bến đỗ trước đây) ngày [14] Liying Zhu CS (2014), Jinghua Wang CS (2014) nhận thấy scopolamine liều mg/kg gây tăng thời gian chuột bơi mê lộ nước từ thả đến tìm đến bến đỗ giảm thời gian chuột bơi góc phần tư mà trước đặt bến đỗ [2, 5] Các liệu chứng tỏ scopolamine làm giảm hai khả học tập hình thành trí nhớ gợi lại trí nhớ động vật scopolamine liều 1,5 mg/kg có tác dụng gây suy giảm trí nhớ mạnh liều thử nghiệm thí nghiệm KẾT LUẬN Scopolamine liều 0,5 mg/kg, mg/kg rõ liều 1,5 mg/kg (tiêm phúc mạc) có tác dụng gây suy giảm trí nhớ tập mê lộ nước: - Giảm khả học tập, hình thành trí nhớ: làm tăng thời gian quãng đường chuột bơi mê lộ nước từ thả đến tìm thấy bến đỗ từ ngày đến ngày - Gây suy giảm khả gợi lại trí nhớ: giảm thời gian chuột bơi góc phần tư trước có đặt bến đỗ (ngày 8) TÀI LIỆU THAM KHẢO Christian Gilles MD, Stéphane Ertlé MS Pharmacological models in Alzheimer’s disease research Dialogues Clin Neurosci 2000, (3) pp.247-255 Etienne Save, Bruno Poucet The morris water task, The behavior laborattory rat 2005, pp.392-400 Hou Q.X, Wu DW, Zhang C.X et al BushenYizhi formula ameliorates cognition deficits and attenuates oxidative stressrelated neuronal apoptosis in scopolamine induced senescence in mice Int J Mol Med 2014, 34 (2), pp.429-439 Jeffrey L, Cummings MD Alzheimer’s disease N Engl J Med 2004, Vol 351, pp.56-67 Jinghua Wang etal Effects of Fructus Akebiae on learning and memory impairment in a scopolamine - induced animal model of dementia 2014 Liying Zhu et al.The effects of Zibu Piyin Recipe components on scopolamine-induced learning and memory impairment in the mouse.Journal of Ethnopharmacology 2014, 15, pp.576-582 Saraf MK., Prabhakar S, Khanduja KL et al Bacopa monniera attenuates scopolamineinduced impairment of spatial memory in mice Evidence-based Complementary and Alternative Medicine.article ID 236186 2010, p.10 Wang J, Kim J, Seo SG et al Effects of Fructus Akebiae on learning and memory impairment in a scopolamine induced animal model of dementia Experimental and Therapeutic Medicine 2014, 8, pp.671-675 Yahaya TA, Adeola SO, Akpojo AJ Crinum zeylanicum bulb extract improves scopolamine-induced memory impairment in mice Molecular and Clinical Pharmacology 2012, (1), pp 21-29 Bài viết sản phẩm đề tài nghiên cứu 106-YS.05-2013.24 tài trợ Quỹ Phát Triển Khoa học Công nghệ Quốc gia (Nafosted) 31 ... điểm dễ thực (tiêm scopolamine vào phúc mạc), tỷ lệ khả sống sót chuột cao Bài tập mê lộ nước Richard G Morris mô tả năm 1981 [8] để đánh giá học tập, trí nhớ khơng gian trí nhớ dài hạn động vật,... 1,5 mg/kg (tiêm phúc mạc) có tác dụng gây suy giảm trí nhớ tập mê lộ nước: - Giảm khả học tập, hình thành trí nhớ: làm tăng thời gian quãng đường chuột bơi mê lộ nước từ thả đến tìm thấy bến... hình dụng cụ, quy trình thí nghiệm thực nhiều lồi (chuột, khỉ…) Chính vậy, chúng tơi thực đề tài nhằm: Đánh giá ảnh hưởng scopolamine đến khả học tập trí nhớ không gian chuột nhắt trắng thông qua