Mục tiêu nghiên cứu nhằm khảo sát phản ứng tổng hợp polymer đóng dấu phân tử cafein (cafein-MIP) có cỡ hạt nano có khả năng lưu giữ thuận nghịch cafein áp dụng ở đối tượng cafein-MIP có khả năng hấp phụ thuận nghịch cafein.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 TỔNG HỢP POLYMER ĐÓNG DẤU PHÂN TỬ CAFEIN ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG LÀM PHA TĨNH TRONG KỸ THUẬT CHIẾT PHA RẮN CHỌN LỌC Nguyễn Như Quỳnh*, Phan Văn Hồ Nam* TĨM TẮT Mở đầu: Polymer đóng dấu phân tử thụ thể nhân tạo, có tính chọn lọc cao, hiệu việc tách phân tích mẫu phức tạp, dịch sinh học môi trường Nhằm góp phần nhân rộng kỹ thuật đóng dấu phân tử Việt Nam, đề t|i “Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử cafein để định hướng ứng dụng l|m pha tĩnh kỹ thuật chiết pha rắn chọn lọc” thực hiện, với đối tượng cafein, alkaloid với nhiều tác dụng sinh học, chọn phân tử mẫu Mục tiêu: Khảo sát phản ứng tổng hợp polymer đóng dấu phân tử cafein (cafein-MIP) có cỡ hạt nano có khả lưu giữ thuận nghịch cafein Đối tượng Cafein-MIP có khả hấp phụ thuận nghịch cafein Phương pháp nghiên cứu: Tổng hợp cafein-MIP phương ph{p kết tủa dung môi Khảo sát khả rửa giải tái hấp phụ cafein polymer phương ph{p quang phổ UV-Vis HPLC Kết quả: Cafein-MIP dạng hạt tổng hợp có kích thước khoảng 500 nm, hình cầu, tương đối đồng Khảo sát tỷ lệ khác acid methacrylic 4-vinyl pyridine cho thấy khả đóng dấu cafein tăng tăng h|m lượng 4-vinyl pyridine công thức, nhiên nồng độ acid cao lại làm giảm hiệu đóng dấu Với tỷ lệ 1:1, hiệu đóng dấu cafein-MIP gấp 6,8 lần so với polymer khơng đóng dấu (NIP) Kết luận: Đề tài lần tổng hợp cafein-MIP với cỡ hạt nano có khả lưu giữ thuận nghịch cafein với hiệu đóng dấu phân tử cao Từ khóa: Polymer đóng dấu phân tử cafein, chiết pha rắn chọn lọc ABSTRACT SYNTHESIS OF CAFFEINE-IMPRINTED POLYMER, DIRECTED AS THE SORBENT FOR SELECTIVE SOLID-PHASE EXTRACTION Nguyen Nhu Quynh, Phan Van Ho Nam * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 1- 2018: 204 - 209 Introduction: Molecularly imprinted polymer is considered as artificial receptors with high selectivity and affinity, that could be used for analyse of sophisticated samples such as biological fluid and environmental ones To expand the application of this novel method in Vietnam, the study "Synthesis of caffeine-imprinted polymer, directed as the sorbent for selective solid phase extraction" was conducted in which caffeine, an alkaloid having many biological activities, was selected as a template for polymerization reaction Objectives: Investigating the synthesis of caffeine-imprinted polymer (cafeine-MIP) particles in nano size that is able to retain caffeine reversibly *Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS Phan Văn Hồ Nam ĐT: 0909615007 204 Email: phanvanhonam@ump.edu.vn Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học Subjects: cafeine-MIP with ability of reversible caffeine absorption Study methods: Synthesis of polymer particles based on precipitation method Study on convertible holding capacity of caffeine-MIP by using UV-Vis and HPLC methods Results: The spherical caffeine-MIP particles with approximately 500 nm size and relatively uniform was successfully synthesized Surveying the various ratios between methacrylic acid and 4-vinyl pyridine showed that the imprinted efficiency was increased by rising the concentration of 4-vinyl pyridine in the formula, and was reduced by high acid content In case of 1:1 rate, caffeine-MIP can hold caffeine than 6.8 times the NIP (non-imprinted polymer) Conclusions: The caffeine-MIP particles in nano size with reversibly and high imprinted efficiency was first time synthesized Keywords: Caffeine-imprinted polymer, selective solid-phase extraction tƣơng lai Chính vậy, đề t|i “Tổng ĐẶT VẤN ĐỀ hợp polymer đóng dấu phân tử cafein định Năm 1930, nghiên cứu hƣớng ứng dụng l|m pha tĩnh kỹ thuật kĩ thuật đóng dấu phân tử đƣợc cơng bố(3) Từ chiết pha rắn tách cafein có tính chọn lọc cao” đến nay, kĩ thuật ngày phát triển đƣợc thực nhằm góp phần nhân rộng kỹ mạnh mẽ chứng minh tính ứng dụng cao thuật này, giúp tiết kiệm thời gian, chi phí, ngành khoa học khác công sức, không công tác kiểm Polymer đóng dấu phân tử (MIP – nghiệm cafein m| c{c lĩnh vực khác Molecular Imprinting Polymer) đƣợc hình ĐỐI TƢỢNG– PHƢƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU thành dựa kĩ thuật đóng dấu phân tử MIT (Molecular Imprinting Technology), Đối tƣợng nghiên cứu phức hợp đƣợc hình thành mẫu Cafein-MIP (chất khảo sát – template) monomer chức Chất đối chiếu dung môi phản ứng polymer Cafein khan (số lô 394541AX20, xuất xứ Cho mẫu, monomer, chất liên kết chéo (crossGermany, h|m lƣợng 99,92%) linker), tác nhân mồi phản ứng vào ống Hóa chất – dung mơi nghiệm, sau phản ứng mạng lƣới polymer khơng gian ba chiều đƣợc hình thành Tiếp Dung mơi, hóa chất thuốc thử đạt độ tinh theo, mẫu đƣợc rửa giải khỏi polymer để lại khiết tùy mục đích sử dụng: Dung mơi tổng “lỗ hổng” với hình dạng, kích thƣớc hợp, rửa giải polymer, pha chế dung dịch: chức hóa học phù hợp với phân tử chất ethanol, methanol, acid acetic, cloroform, nkhảo sát Kết quả, polymer nhận diện gắn butanol, n-hexan, diethyl ether, xuất xứ Trung cách có chọn lọc với mẫu(2,4,5) Chúng Quốc; Hóa chất tổng hợp polymer: acid hữu ích cho việc phân tích mẫu phức tạp metacrylic (MAA), 4-vinylpyridin (4-VP), nhƣ dịch sinh học mẫu môi trƣờng Ở Việt ethylen glycol dimethylacrylate (EDMA), Nam, kỹ thuật lạ Bên azobisisobutyronitril (AIBN) (Aldrich-sigma); cạnh đó, cafein l| alkaloid phổ biến Dung môi sắc ký lỏng: MeOH (J.T.Baker), acid sống, ngƣời ta hầu nhƣ dễ dàng bắt gặp acetic băng (Merck) chế phẩm có cafein thị trƣờng Cafein Trang thiết bị có tác dụng g}y hƣng phấn thần kinh, lợi tiểu, Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao giãn nở phế quản(1) Cafein đƣợc chọn làm Waters Alliance 2695, đầu dò dãy diod quang phân tử mẫu nghiên cứu n|y để từ 2996 (Waters, Mỹ) Cân phân tích Sartorius CP phát triển kỹ thuật đóng dấu phân tử Chuyên Đề Dƣợc 205 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học 224D (Sartorius, Đức), m{y đo quang phổ tử ngoại khả kiến UV-Probe 2550 (Shimadzu – Nhật) Phƣơng pháp nghiên cứu Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử cafein (cafein-imprinted polymer - cafein-MIP) polymer trắng (non-imprinted polymer NIP) Pha dung dịch Cafein mẹ nhƣ sau: DD C1: mg /ml cafein aceton, DD C2: mg/ml cafein acetonitril, DD C3: Bảng 1: Công thức thành phần tổng hợp polymer Thành phần DD C1 (µl) DD C2 (µl) DD C3 (µl) EDMA (mg) MAA (mg) 4-VP(mg) AIBN (µl) Aceton (ml) ACN (ml) Cloroform (ml) Acid acetic (µl) NaOH 0,1N (µl) B1 200 160 14 35 - B2 200 160 14 35 - B3 200 160 14 35 - B4 200 140 35 35 - Tạo hạt Sau tổng hợp polymer đến trạng thái gel, lấy 500 µl polymer dạng gel cho vào ống nghiệm có nắp đậy Thêm vào ống nghiệm ml ethanol Khuấy bếp từ Sau đem ly t}m với tốc độ 5000 vòng/phút phút, thu lấy cắn Kiểm tra lưu giữ cafein cafein-MIP dạng hạt sử dụng phương pháp quang phổ UV-Vis HPLC (Sơ đồ 1) Hạt polymer (MIP NIP) sau tổng hợp theo công thức B7, B8, B9, B11 (Bảng 1) đƣợc rửa cafein với dung mơi thích hợp cách cho vào ống nghiệm ml dung môi rủa giải, đậy nắp ống nghiệm, lắc rung phút, để lắng phút v| đem ly t}m với tốc độ 5000 vòng/phút phút Dịch thu đƣợc pha lỗng thành 25 ml Tiến h|nh đo quang để kiểm tra diện cafein Quy trình đƣợc thực với dung môi rửa 206 mg/ml cafein cloroform Thực tổng hợp MIP theo công thức kh{c nhƣ Bảng Cho thành phần vào eppendorf, lắc rung hỗn hợp 10 gi}y Sau cách thủy hỗn hợp 74 oC hỗn hợp hình thành trạng thái gel, lắc rung hỗn hợp 30 giây Với công thức MIP, thực tổng hợp NIP song song để đối chiếu th|nh phần tổng hợp tƣơng ứng khơng có dung dịch cafein B5 200 120 50 35 - B6 200 140 35 40 - B7 200 150 30 10 35 0,4 - B8 200 150 20 20 35 0,4 - B9 200 150 10 30 35 0,4 20 - B10 200 160 40 35 0,4 20 B11 200 160 40 35 0,4 - giải methanol, thu đƣợc dung dịch A, dung môi rửa giải methanol – acid acetic (9:1) thu đƣợc dung dịch B Sơ đồ 1: Quy trình kiểm tra lưu giữ cafein cafein-MIP dạng hạt sử dụng phương ph{p quang phổ UV-Vis HPLC Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Tái hấp phụ cafein: cho 1ml dung dịch cafein pha ACN có nồng độ mg/ml vào hạt polymer rửa (MIP NIP) Lắc rung phút, để ổn định phút đem ly t}m Tiếp tục cho vào cắn ml dung dịch methanol, lắc rung phút, để ổn định phút, ly tâm 5000 vòng/phút 10 phút Thực lần, gộp dịch thu đƣợc pha loãng methanol thành 25 ml (dung dịch C) Cho ml dung dịch methanolacid (9:1) cắn lại Lắc rung phút, để lắng phút đem ly t}m 5000 vòng/phút 10 phút Lặp lại bƣớc lần Sau đó, gộp dịch thu đƣợc pha loãng với methanol-acid (9:1) thành 25 ml (dung dịch D) Lọc dung dịch A, B, C, D thu đƣợc qua màng lọc 0,45 µm, tiến h|nh định lƣợng cafein phƣơng ph{p sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) Quy trình ph}n tích HPLC để x{c định nồng độ cafein dịch rửa giải sử dụng c{c điều kiện sắc ký là: Cột sắc kí CC 125/4 Nucleosil 1005C18 (125 ì mm, àm); Pha ng l| Nƣớc methanol - acid acetic (69:28:3); Nhiệt độ cột 45oC; Tốc độ dòng 1ml/phút; Thể tích tiêm mẫu 10 µl; Bƣớc sóng phát 273 nm Quy trình đƣợc kiểm tra tính tƣơng thích hệ thống thẩm định đạt yêu cầu ph}n tích định lƣợng theo hƣớng dẫn ICH Nghiên cứu Y học KẾT QUẢ Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử cafein (cafein-imprinted polymer - cafein-MIP) polymer trắng (non-imprinted polymer NIP) Quan sát cảm quan hạt MIP/NIP thu đƣợc từ công thức B1, B2, B3, hạt polymer tạo thành dung môi cloroform suốt không màu, hầu nhƣ quan s{t đƣợc điểm gel phản ứng Bên cạnh cafein tan acetonitril tốt aceton, nên dung môi acetonitril đƣợc chọn làm dung môi phản ứng polymer (công thức B2) Nồng độ AIBN MIP cao, thời gian tổng hợp nhanh Tuy nhiên, tăng nồng độ AIBN lên cao, polymer đông khối trƣớc kịp cho vào dung môi tạo hạt Do đó, cơng thức B4 phù hợp so với B6 So sánh cơng thức B2, B4, B5 có tỷ lệ chất liên kết chéo monomer (EDMA - MAA) kh{c Lƣợng chất liên kết chéo lớn, hạt to, khơng đồng đều, tủa nhanh chóng vón cục, nhiên hạt nhỏ không phù hợp nhồi cột SPE Vậy nên tỷ lệ EDMA - monomer công thức đƣợc chọn 80:20 (công thức B4) Sự diện NaOH làm phản ứng polymer hóa kéo dài 24 Vậy cuối có công thức B7, B8, B9, B11 đƣợc sử dụng để khảo sát khả lƣu giữ cafein-MIP Tạo hạt Hình 1: Hình dạng hạt kính hiển vi có độ phóng đại 100x, vạch nhỏ thước trắc vi tương ứng 400 nm Chuyên Đề Dƣợc 207 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Polymer dạng gel đƣợc kết tủa ethanol, thu đƣợc hạt nhỏ có kính thƣớc h|ng micromet quan s{t dƣới kính hiển vi có độ phóng đại 100x (Hình 1) Kiểm tra lƣu giữ cafein polymer sử dụng quang phổ UV-Vis Sau tổng hợp MIP NIP tạo hạt với ethanol, tiến hành rửa giải với lần lƣợt dung môi theo thứ tự: n-butanol, isopropanol, ethanol, methanol, methanolacid acetic (9:1) đo quang phổ UV-Vis ta thu đƣợc kết nhƣ Bảng Kết cho thấy sau dùng n-butanol rửa giải cafein, dung môi phân cực rửa giải nốt lƣợng cafein lƣu giữ cafein-MIP ngoại trừ hỗn hợp methanol-acid acetic (9:1) Hiện tƣợng sảy tƣơng tự tiến hành tái hấp thu cafein Tuy nhiên tái hấp thu, NIP cho kết tƣơng tự MIP Bảng2: Kiểm tra lưu giữ cafein polymer dạng hạt sử dụng phương ph{p quang phổ UV-Vis (kết trình bày theo MIP/NIP công thức tương ứng) B7 B8 Dung môi tạo hạt +/+/n-butanol +/+/Isopropanol -/-/Ethanol -/-/Methanol -/-/Methanol-acid (9:1) +/+/Tái hấp phụ cafein n-butanol +/+ +/+ Iso propanol -/-/Ethanol -/-/Methanol -/-/Methanol-acid (9:1) +/+ -/- B9 +/+/-/-/-/+/- B11 +/+/-/-/-/+/- +/+ -/-/-/+/+ +/+ -/-/-/-/- Chú thích: (+) l| dương tính, có diện cafein, (-) âm tính, khơng có diện cafein Kiểm tra lƣu giữ cafein polymer sử dụng phƣơng pháp HPLC Lƣợng cafein dịch rửa giải MIP/NIP c{c giai đoạn kh{c đƣợc trình bày Bảng 208 Bảng 3: Lượng cafein (mg) thu hồi dịch rửa giải MIP/NIP c{c giai đoạn khác với lượng cafein thêm vào giai đoạn mg B 11 B7 B8 B9 Dung dịch MIP NIP MIP NIP MIP NIP MIP NIP A 0,6144 0,3846 0,6351 0,5612 B 0,0031 0 0 0,0000 C 0,9127 0,9199 0,9234 0,9222 0,7141 0,7359 0,7317 0,6294 D 0,0015 0,0017 0 0,0040 0,0006 0 BÀN LUẬN Từ kết Bảng cho thấy, dùng methanol để rửa giải, polymer B7 B9 khơng có khả lƣu giữ cafein, polymer B8 B11 bị rửa giải thêm hỗn hợp methanol-acid acetic (9:1) B11 với monomer gồm acid methacrylic tạo liên kết hydro với cafein nên MIP v| NIP lƣu giữ cafein, lƣợng cafein lại chƣa đến 9%, nhiên khơng có khác biệt, nhƣ vậy, liên kết yếu q nên việc đóng dấu khơng thành cơng B8 cơng thức giúp polymer có khả lƣu giữ thuận nghịch cafein So sánh công thức B8 với cơng thức lại, khác biệt đến từ h|m lƣợng tổng cộng acid thấp Nhƣ nhóm chức – COOH acid methacrylic acid acetic cản trở hình thành lực polymer cafein B8 với monomer gồm acid methacrylic 4-VP có nhóm chức khác –COOH nhóm pyridin có khả tƣơng hỗ tốt để tạo lực tốt với cafein, vốn base hữu yếu, B8 lƣu giữ đƣợc nhiều cafein hơn, v| tạo khác biệt MIP NIP, MIP giữ cafein gấp 6,8 lần so với NIP (0,40% so với 0,06%) Hiệu đóng dấu phân tử cao so với tài liệu tham khảo tìm thấy Tuy nhiên lực cao khiến cho cafein khơng thể rửa giải hồn tồn với dung môi methanol-acid acetic (9:1) Tổng lƣợng cafein thu hồi đƣợc vào khoảng 70% so với 90% B11 Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 KẾT LUẬN Đề tài lần tổng hợp đƣợc cafeinMIP có khả lƣu giữ thuận nghịch cafein mà hiệu đóng dấu l|m tăng 6,8 lần so với khơng đóng dấu phân tử, bên cạnh tổng hợp thành cơng hạt polymer với kích thƣớc nano tƣơng đối đều, đồng Từ kết n|y, đề t|i mở hƣớng nghiên cứu để cafein-MIP có đƣợc hiệu đóng dấu tối ƣu, phù hợp với định hƣớng l|m pha tĩnh cafein-MISPE TÀI LIỆU THAM KHẢO Institute of Medicine (2014) Caffeine in Food and Dietary Supplements: Examining Safety: Workshop Summary Leslie P, Ann LY, Diana P Washington DC, The National Academies Press 2014 Chuyên Đề Dƣợc Nghiên cứu Y học Lieberzeit PA, Findeisen A, Mähner J, Samardzic R, Pitkänen J, Anttalainen O, Dickert FL (2010) Artificial receptor layers for detecting chemical and biological threats Procedia Engineering 5(Supplement C):381-384 Öpik A, Menaker A, Reut J, Syritski V (2009) Molecularly imprinted polymers: A new approach to the preparation of Functional materials Proceedings of the Estonian Academy of Sciences 58(1):3-11 Phan N, Sussitz H, Lieberzeit P (2014) Polymerization Parameters Influencing the QCM Response Characteristics of BSA MIP Biosensors 4(2):161-171 Vasapollo G, Sole RD, Mergola L, Lazzoi MR, Scardino A, Scorrano S, Mele G (2011) Molecularly imprinted polymers: present and future prospective International journal of molecular sciences 12(9):5908-5945 Ngày nhận báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o đăng: 15/03/2018 209 ... đề t|i Tổng ĐẶT VẤN ĐỀ hợp polymer đóng dấu phân tử cafein định Năm 1930, nghiên cứu hƣớng ứng dụng l|m pha tĩnh kỹ thuật kĩ thuật đóng dấu phân tử đƣợc công bố(3) Từ chiết pha rắn tách cafein. .. phổ tử ngoại khả kiến UV-Probe 2550 (Shimadzu – Nhật) Phƣơng pháp nghiên cứu Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử cafein (cafein- imprinted polymer - cafein- MIP) polymer trắng (non-imprinted polymer. .. thống thẩm định đạt yêu cầu ph}n tích định lƣợng theo hƣớng dẫn ICH Nghiên cứu Y học KẾT QUẢ Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử cafein (cafein- imprinted polymer - cafein- MIP) polymer trắng (non-imprinted