Đề tài: Khảo sát một số yếu tố tổng hợp polymer đóng dấu phân tử salbutamol định hướng ứng dụng làm pha tĩnh trong kỹ thuật chiết tách pha rắn tách salbutamol có tính chọn lọc được tiến hành nhằm góp phần phát triển thêm những phương pháp kiểm nghiệm thực phẩm, mỹ phẩm rẻ tiền nhưng hiệu quả.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ TỔNG HỢP POLYMER ĐÓNG DẤU PHÂN TỬ SALBUTAMOL - ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG LÀM PHA TĨNH TRONG KỸ THUẬT CHIẾT PHA RẮN CĨ TÍNH CHỌN LỌC CAO Nguyễn Thanh Trà*, Phan Văn Hồ Nam* TÓM TẮT Mở đầu: C{c phương ph{p định lượng salbutamol thịt heo HPLC-MS/MS đắt phải sử dụng chất chuẩn đồng vị Polymer đóng dấu phân tử salbutamol giải ph{p đơn giản hóa quy trình phân tích salbutamol mẫu phức tạp Do đó, đề tài: "Khảo sát số yếu tố tổng hợp polymer đóng dấu phân tử salbutamol định hướng ứng dụng l|m pha tĩnh kỹ thuật chiết tách pha rắn tách salbutamol có tính chọn lọc" tiến hành nhằm góp phần phát triển thêm phương ph{p kiểm nghiệm thực phẩm, mỹ phẩm rẻ tiền hiệu Mục tiêu: Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử salbutamol (Salbutamol-MIP) theo phương ph{p kết tủa dung môi Khảo sát khả lưu giữ thuận nghịch salbutamol-MIP để tìm yếu tố ảnh hưởng đến khả t{ch salbutamol Đối tượng: Salbutamol-MIP có khả lưu giữ salbutamol thuận nghịch Phương pháp nghiên cứu: Tổng hợp hạt Salbutamol-MIP phương ph{p kết tủa lượng lớn dung môi Nhồi cột SPE Khảo sát khả lưu giữ salbutamol Salbutamol-MISPE phương ph{p quang phổ UV-Vis quang phổ huỳnh quang Kết quả: Salbutamol-MIP tổng hợp th|nh cơng có kích thước nano có khả lưu giữ salbutamol gấp 2,48 lần so với polymer khơng đóng dấu (81,00% so với 32,65%) Kết luận: Salbutamol-MIP kích thước nano với khả lưu trữ salbutamol thuận nghịch lần tổng hợp phương ph{p kết tủa lượng lớn dung môi, định hướng để ứng dụng làm vật liệu hấp phụ có tính chọn lọc kỹ thuật chiết pha rắn v| c{c thước pháp sắc ký khác Vietnam Từ khóa: Polymer đóng dấu ph}n tử salbutamol, chiết pha rắn chọn lọc ABSTRACT INVESTIGATING SYNTHETIC FACTORS OF SALBUTAMOL-IMPRINTED POLYMER, DIRECTED TO APPLY AS THE SORBENT FOR SELECTIVE SOLID-PHASE EXTRACTION Nguyen Thanh Tra, Phan Van Ho Nam * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 1- 2018: 210 - 215 Introduction: Determination of salbutamol in pork by HPLC-MS/MS is expensive and complex because of using isotopic standard Salbutamol imprinted polymer could be applied for simplifying analysis procedures of salbutamol in complicated samples Thus, the topic “Investigating synthetic factors of salbutamol-imprinted polymer, directed to apply as the sorbent for selective solid-phase extraction” was realized for contributing the development of cheap and effective quality control method of food and medicine Objectives: Synthesis of salbutamol-imprinted polymer (salbutamol-MIP) particles by precipitation *Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS Phan Văn Hồ Nam ĐT: 0909615007 210 Email: phanvanhonam@ump.edu.vn Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học polymerization in large solvent Investigating the ability of salbutamol-MIP in retaining salbutamol reversibly in order to find out the factors affecting their separation Subjects: Salbutamol-MIP with ability of reversibly retaining salbutamol Study methods: Synthesis of salbutamol-imprinted polymer (salbutamol-MIP) particles by precipitation polymerization in large solvent Packaging salbutamol-MIP into SPE column Investigations were carried out to find out the polymer having the ability of retaining high Salbutamol content via UV-Vis and fluorescence spectroscopies Results: Salbutamol-MIP in nano size was successfully synthesized with capable of storing salbutamol 2.48 times higher than non-imprinted polymer (81.00% compared to 32.65%) Conclusions: Salbutamol-MIP in nano size with reversibly holding caffeine effect was firstly synthesized by precipitation polymerization directed to apply to selective solid-phase extraction and other chromatography methods in Vietnam Keywords: Salbutamol-imprinted polymer, selective solid-phase extraction tra chất lƣợng thực phẩm hay kiểm nghiệm ĐẶT VẤN ĐỀ salbutamol thực phẩm vô thiết Salbutamol chất chủ vận beta (β – agonist) yếu(3) Những phƣơng ph{p đƣợc sử dụng để đƣợc dùng y kho để điều trị số bệnh định lƣợng salbutamol thịt heo đƣợc sử liên qu n đến co thắt đƣờng hơ hấp Ngồi ra, dụng điển hình nhƣ HPLC-MS/MS đắt đƣợc sử dụng chăn nu i nhƣ l| cần phải có chất chuẩn đồng vị (theo TCCS: chất tạo nạc nhằm tăng lợi nhuận Tuy nhiên, H.HD.QT.110 Ref: USDA CLG-AGON1.0 salbutamol tồn dƣ thực phẩm có khả Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm tích lũy lại gan, thận, mỡ, võng mạc gây quốc gia)(1) suy giảm chức g n, ảnh hƣởng sức khỏe ngƣời tiêu dùng Chính vậy, nhu cầu kiểm Hình 1: Kỹ thuật đóng dấu phân thử Polymer đóng dấu phân tử salbutamol MIP đƣợc tạo thành q trình polymer hóa (salbutamol-MIP) giải ph{p đơn giản hóa có diện chất ph}n tích đƣợc chọn trƣớc quy trình phân tích salbutamol v| s u chất ph}n tích n|y đƣợc rửa giải để mẫu phức tạp(5) Kỹ thuật đóng dấu phân tử loại bỏ khỏi polymer bộc lộ lỗ trống có kỹ thuật đƣợc dùng để thiết kế nhân tạo khả t{i hấp phụ chất phân tích nhờ phù thụ thể có tính chọn lọc v| độ đặc đặc hiệu hợp cấu trúc không gian liên kết hydro, cao với chất ph}n tích đƣợc chọn trƣớc van der waals, ion (Hình 1) Bằng cách Chuyên Đề Dƣợc 211 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học polymer sở hữu yếu tố nhận biết phân tử mạnh mẽ nhƣ c{c thụ thể sinh học tự nhiên, ví dụ: kháng thể thụ thể sinh học Trang thiết bị Máy cô quay chân khơng R-210S Bucchi - MIP có Thụy Sĩ, bếp cách thủy Memmert WB-14 - Đức, ƣu điểm bền vật lý, ổn định hóa học, dễ tổng tủ sấy Memmert WM 500 CO - Đức, bể siêu âm hợp giá thành rẻ nên vật liệu đầy hứa Elma T840 DH - Đức, c}n điện tử phân tích HR- hẹn ứng dụng kỹ thuật chiết pha rắn Do 200 A&D - Nhật, Máy quang phổ Shimadzu UV- đó, đề t|i n|y đƣợc tiến hành nhằm góp phần 2450 - Nhật, máy quang phổ huỳnh quang F- phát triển thêm phƣơng ph{p kiểm sốt 7000 Flourescence Spectrophotometry Hitachi - chất kích thích tăng trọng chăn nu i, sản Nhật, máy khuấy từ gia nhiệt IKA - Đức, kính xuất rẻ tiền nhƣng hiệu - cụ thể ứng dụng hiển vi Olympus CH2 - Nhật, SPE Manifold MIP chiết tách chọn lọc làm giàu Waters - Mỹ salbutamol Phƣơng pháp nghiên cứu ĐỐI TƢỢNG – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử salbutamol (salbutamol-imprinted polymer salbtamol-MIP) polymer trắng (nonimprinted polymer - NIP) Quy trình tổng hợp salbutamol-MIP phƣơng ph{p kết tủa: Cho monomer, cross – linker, chất mồi phân tử mẫu hòa tan hồn tồn dung mơi Tạo hỗn hợp tiền polymer hóa cách ủ hỗn hợp nhiệt độ phòng vòng 24 Tiến hành polymer hóa c{ch đun v| khuấy từ 60 oC vòng Tiến hành tổng hợp polymer đóng dấu phân tử salbutamol theo cơng thức đƣợc trình bày Bảng Tổng hợp polymer trắng (non-imprinted polymer – NIP tƣơng tự nhƣ MIP, nhiên công thức tổng hợp khơng có thành phần phân tử mẫu, đƣợc dùng để so s{nh đối chiếu với MIP (2,4) (5) Đối tƣợng nghiên cứu Salbutamol-MIP tổng hợp phƣơng pháp kết tủa dung môi Chất đối chiếu Salbutamol sulfat chuẩn, số lô: QT105 070317 H|m lƣợng 99,7% Viện Kiểm nghiệm TP.HCM Hóa chất – dung mơi Vinyl pyrrolidon (VP), acid methacrylic (MAA), acid acrylic (AA), ethylene glycol dimethacrylate (EDMA), azobisisobutyronitrile AI N đƣợc sản xuất Sigma-Aldrich Methanol, acid acetic, cloroform xuất xứ Trung Quốc Methanol, acid acetic dành cho sắc ký lỏng Merck sản xuất Bảng 1: Thành phần công thức salbutamol-MIP Tên công STT thức I II III IV V VI VII VIII IX 212 AA MAA VP VP-AA AA-MAA MAA-chlor VP-chlor MAA-ace VP-ace Monomer(mg) AA MAA VP 100 50 50 - 126 65 126 126 160 80 160 Cross linke Chất mồi (mg) (µl) EGDMA AIBN 12% 1135 1135 1135 1135 1135 1135 1135 1135 50 50 50 50 50 50 50 50 Phân tử mẫu (mg) Dung mơi polymer hóa (ml) Salbutamol Salbutamol Methanol Chloroform Acetonitril sulfat 90 123 90 123 90 123 90 123 90 123 108 123 108 123 90 123 90 123 Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Khảo sát lưu giữ salbutamol Salbutamol-MIP Các polymer sau tổng hợp dạng hạt n no đƣợc kiểm tr kích thƣớc cách quan s{t dƣới kính hiển vi có độ phóng đại 100 lần S u hạt đƣợc rửa salbutamol, nhồi cột SPE, tiến hành tái hấp thu salbutamol rửa giải để kiểm tr đặc tính lƣu giữ salbutamol Dịch thu đƣợc sau rửa giải đƣợc định lƣợng phƣơng ph{p qu ng phổ UV – Vis bƣớc sóng 278 nm v| phƣơng ph{p qu ng phổ huỳnh quang với bƣớc sóng kích thích 230 nm - bƣớc sóng phát xạ 305 nm Nghiên cứu Y học đƣợc nạp vào cột lúc b n đầu KẾT QUẢ Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử salbutamol (salbutamol-imprinted polymer salbtamol-MIP) polymer trắng (nonimprinted polymer - NIP) Hạt polymer thu đƣợc hình có kích thƣớc khoảng 800-1000nm qu n s{t dƣới kính hiển vi có độ phóng đại 100 lần Nhồi hạt vào cột SPE: hạt tạo r đƣợc đem nhồi ƣớt dƣới áp suất giảm vào vỏ xy lanh nhự PE đệm sẵn miếng xốp PTFE 10 µm giấy lọc RC 0,45 µm Rửa cột với dung môi: cho dung môi qua cột Kiểm tra tồn dƣ monomer salbutamol dịch rửa phƣơng ph{p qu ng phổ UV-Vis: thu 10 ml đem quét phổ UV vùng 250 nm đến 400 nm đến dịch rửa khơng hấp thu vùng Quá trình tái hấp thu gồm gi i đoạn Thứ nạp mẫu: cho ml dung dịch phân tử mẫu (1 mg/ml) qua cột, hứng dịch thừa qua cột v|o bình định mức 10 ml, điền đầy đến vạch meth nol để thu đƣợc dịch thừa (1) Thứ rửa cột: cho dung môi rửa qua cột, hứng 10 ml dịch rửa riêng rẽ, quét phổ UV vùng 250 đến 400 nm, đến dịch hứng khơng hấp thu Gộp dịch có hấp thu lại với nh u để thu đƣợc dịch rửa (2) Thứ rửa giải salbutamol sulfat: rửa giải salbutamol sulfat 10 ml methanol – acid acetic (8:2), thu dịch rửa giải (3) Tiến h|nh tính to{n lƣợng phân tử mẫu thu đƣợc dịch thừa (1), dịch rửa (2) dịch rửa giải Lƣợng phân tử mẫu lƣu giữ lại cột đƣợc tính phần trăm lƣợng phân tử mẫu dịch rửa giải thu đƣợc so với lƣợng phân tử mẫu Chuyên Đề Dƣợc Hình 2: Hạt polymer thu quan sát kính hiển vi có độ phóng đại 100x Khảo sát lƣu giữ salbutamol Sa lbutamol-MIP: Lƣợng salbutamol dịch dƣ (1), dịch rửa (2), dịch rửa giải (3) v| % lƣu giữ salbutamol cột đƣợc trình bày Bảng Kết khơng có khác lƣu giữ cặp MIP v| NIP Nhƣ tất cột kh ng lƣu giữ salbutamol Dự đo{n sử dụng salbutamol dạng sulf t để tổng hợp, phân tử salbutamol sulfat có H+ ngăn cản hình thành liên kết hydro salbutamol monomer nên khơng có lỗ liên kết đặc hiệu đƣợc tạo 213 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học Bảng 2: Lượng salbutamol dịch thừa (1), dịch rửa (2), dịch rửa giải (3) v| % lưu giữ salbutamol cột (S: salbutamol; SS: salbutamol sulfat) Công thức I II III IV VI VI VI VI Lượng Dịch mẫu nạp thừa (1) cột 1mg MIP NIP MIP NIP MIP NIP MIP NIP MIP NIP MIP NIP MIP NIP MIP NIP SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS S S S S S S 637,85 727,08 702,46 767,08 837,85 808,62 764,00 764,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,36 209,14 0,00 0,00 Dịch rửa (2) MeOH aceton 300,31 263,39 352,62 558,77 131,08 164,92 137,23 164,92 1054,73 1094,29 1216,48 948,35 983,15 715,66 103,24 371,29 BÀN LUẬN Để loại bỏ ảnh hƣởng H+, tiến hành tổng hợp polymer MAA sử dụng salbutamol dạng tự - công thức VI (MAA-chlor , đem t{i hấp thu với salbutamol salbutamol sulfat, kết chƣ có lƣu giữ salbutamol sulfat hay salbutamol hai loại polymer MIP NIP lƣu giữ 0% hai loại Tuy nhiên, lƣợng dung m i để rửa rửa giải có khác biệt Lƣợng dung mơi dùng rửa salbutamol liên kết không đặc hiệu khỏi cột nhiều so với tái hấp thu salbutamol sulfat (7,5 lần) Từ đó, thấy H+ salbutamol sulfat có ảnh hƣởng đến tạo liên kết đặc hiệu polymer phân tử mẫu Cụ thể H+ ngăn cản tạo thành liên kết đặc hiệu phân tử mẫu polymer Giải thích cho việc dù loại H+ q trình tổng hợp, tức phải có liên kết đặc hiệu đƣợc tạo r nhƣng lƣu giữ salbutamol lại cột (dịch rửa giải khơng có salbutamol), có hai giả thuyết: Thứ 1: Số liên kết đặc hiệu tạo Thứ 2: Dung môi methanol (dung môi rử đủ mạnh để bẻ gãy hết tất liên kết đặc hiệu đƣợc tạo 214 Dịch rửa giải Phương (3) Tổng lượng Lưu giữ Thu hồi (%) pháp định (%) MeOH – acid thu hồi (g) lượng acetic (8:2) 0,00 938,15 93,82 0,00 0,00 990,46 99,05 0,00 0,00 1055,08 105,51 0,00 0,00 1325,85 132,59 0,00 0,00 968,92 96,89 0,00 0,00 973,54 97,35 0,00 UV 0,00 901,23 90,12 0,00 0,00 928,92 92,89 0,00 0,00 1054,73 105,47 0,00 0,00 1094,29 109,43 0,00 0,00 1216,48 121,65 0,00 0,00 948,35 94,84 0,00 1969,00 1008,86 101,00 3,00 1758,00 947,33 95,00 2,00 Huỳnh quang 440,02 543,26 54,33 81,00 180,01 551,30 55,13 32,65 Do đó, tiến hành tái hấp thu salbutamol với cột đƣợc nhồi polymer công thức VI (MAAchlor) Khi tiến hành tái hấp thu với salbutamol, sử dụng hệ dung môi rửa rửa giải methanol methanol – acid acetic (8:2), phát huỳnh quang, kết có khác biệt VI (MAA-chlor)-MIP VI (MAAchlor)-NIP, nhƣng kh ng nhiều, lƣu giữ lần lƣợt 3,00% 2,00% Khi tiến hành tái hấp thu với salbutamol, sử dụng hệ dung môi rửa rửa giải aceton methanol - acid acetic (8:2), phát huỳnh quang Kết có khác biệt rõ lƣu giữ VI (MAA-chlor)-MIP (81,00%) VI (MAA-chlor)-NIP (32,65%) Nhƣ vậy, polymer đóng dấu phân tử tổng hợp từ cơng thức IV (MAA-chlor tạo đƣợc liên kết đặc hiệu với salbutamol Và cặp dung môi rửa giải aceton methanol – acid acetic (8:2) giúp phân biệt đƣợc mức độ lƣu giữ salbutamol công thức Salbutamol-MIP cơng thức VI có khả lƣu giữ salbutamol gấp 2,48 lần so với NIP (81,00% so với 32,65%) Cơng thức VI có khả lƣu giữ gấp khoảng lần so với công thức khác, hệ dung mơi methanol - acid acetic Chun Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 (8:2) rửa giải đƣợc lần lƣợt 54,33% 55,13% lƣợng salbutamol tái hấp thu MIP NIP so với công thức khác bị rửa giải dƣới 100% KẾT LUẬN Đề t|i tổng hợp đƣợc salbutamol-MIP có khả lƣu giữ salbutamol, bên cạnh lần tổng hợp thành cơng vật liệu ph tĩnh cho SPE với kích thƣớc hạt hàng n no Đ}y l| bƣớc sở cho nghiên cứu phát triển củ phƣơng ph{p đóng dấu phân tử để ứng dụng vào phƣơng ph{p ph}n tích nhƣ chiết pha rắn hay sắc ký, lĩnh vực mà Việt Nam chƣ đƣợc nghiên cứu phát triển Nghiên cứu Y học Phƣơng Ph{p Sắc Ký Lỏng Ghép Hai Lần Khối Phổ Hà Nội, Bộ Khoa học Công nghệ 2014 - 13 Lieberzeit PA, Findeisen A, Mähner J, Samardzic R, Pitkänen J, Anttalainen O, Dickert FL (2010) Artificial receptor layers for detecting chemical and biological threats Procedia Engineering 5(Supplement C):381-384 Nguyễn Thị Thu Thủy (2011) Khảo s{t dƣ lƣợng bê ta-Agonist (Clenbuterol salbutamol) thịt gà thịt heo thị trƣờng thành phố Cần Thơ Luận án tiến sĩ Đại học Y Dƣợc Cần Thơ TP Cần Thơ Phan N, Sussitz H, Lieberzeit (2014) Polymerization Parameters Influencing the QCM Response Characteristics of BSA MIP Biosensors 4(2):161-171 Qiao F, Sun H, Yan H, Row KH (2006) Molecularly Imprinted Polymers for Solid Phase Extraction Chromatographia 64(1112):625-634 Ngày nhận báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o đăng: 15/03/2018 TÀI LIỆU THAM KHẢO Cục Quản lý Chất lƣợng Nông lâm sản thủy sản (2014) Thực Phẩm - X{c Định Dƣ Lƣợng β – Agonist Trong Thịt Gia Súc – Chuyên Đề Dƣợc 215 ... Kỹ thuật đóng dấu phân thử Polymer đóng dấu phân tử salbutamol MIP đƣợc tạo thành trình polymer hóa (salbutamol- MIP) giải ph{p đơn giản hóa có diện chất ph}n tích đƣợc chọn trƣớc quy trình phân. .. b n đầu KẾT QUẢ Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử salbutamol (salbutamol- imprinted polymer salbtamol-MIP) polymer trắng (nonimprinted polymer - NIP) Hạt polymer thu đƣợc hình có kích thƣớc khoảng... ứng dụng hiển vi Olympus CH2 - Nhật, SPE Manifold MIP chiết tách chọn lọc làm giàu Waters - Mỹ salbutamol Phƣơng pháp nghiên cứu ĐỐI TƢỢNG – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Tổng hợp polymer đóng dấu phân