Tổng hợp và đặc trưng màng hydroxyapatit pha tạp một số nguyên tố vi lượng trên nền thép không rỉ 316L định hướng ứng dụng làm nẹp vít xương

1. Tính cấp thiết của luận án Hiện nay, vật liệu được sử dụng phổ biến trong ngành chỉnh hình với mục đích làm nẹp vít xương chủ yếu là các kim loại trơ về mặt hóa học như thép không gỉ 316L, titan và các hợp kim của titan như TiN, TiO 2 và Ti 6 Al V... Các vật liệu nẹp vít xương làm từ titan và hợp kim của titan có độ bền cơ lý cao và khả năng tương thích tốt nhưng giá thành của các sản phẩm này rất cao. Do đó, để giảm giá thành của các dịch vụ y tế, ở Việt Nam hiện nay hầu hết các nẹp vít xương đều được làm bằng thép không gỉ 316L. Tuy nhiên, thép không gỉ 316L trong môi trường dịch cơ thể người thường bị hạn chế về khả năng chịu ăn mòn và tính tương thích sinh học. Khi tồn tại lâu trong cơ thể, thép không gỉ có thể xảy ra sự ăn mòn cục bộ và sản phẩm của quá trình ăn mòn là các hợp chất của crôm, niken, … gây độc cho các tế bào xương và gây dị ứng cho cơ thể [1]. Do đó, nhiều trường hợp nẹp vít xương làm bằng thép không gỉ sau một thời gian cấy ghép trong cơ thể có hiện tượng loãng xương và gây phù nề ở chỗ tiếp xúc giữa xương và nẹp vít. Vì vậy, để khắc phục những nhược điểm này các nhà khoa học đã nghiên cứu phủ lên nền thép không gỉ màng hydroxyapatit (HAp). 4 HAp tồn tại cả trong tự nhiên và nhân tạo. Trong tự nhiên, HAp là thành phần chính trong xương, răng và mô cứng của người và động vật có vú (trong xương, HAp chiếm khoảng 25-75% theo trọng lượng và 35-65% theo thể tích [2]). HAp tổng hợp có cấu trúc và hoạt tính sinh học tương tự HAp tự nhiên nên chúng có khả năng tương thích sinh học cao với các tế bào, các mô và không bị cơ thể đào thải. HAp được tổng hợp dưới các dạng khác nhau như dạng bột, dạng gốm, dạng compozit, dạng màng và ứng dụng nhiều trong lĩnh vực y sinh. Màng HAp được phủ lên nẹp vít xương và các vật liệu dùng trong cấy ghép xương nói chung có tác dụng kích thích tế bào xương phát triển, tăng độ bám dính và sự kết nối mạnh mẽ giữa xương vật chủ và vật liệu cấy ghép. Ngoài ra, màng HAp có khả năng bảo vệ kim loại nền chống lại sự ăn mòn trong môi trường sinh lý, hạn chế sự giải phóng ion kim loại từ nền vào môi trường. Tuy nhiên, màng HAp tổng hợp có độ hòa tan tương đối cao trong môi trường sinh lý và tính chất cơ lý kém. Nhược điểm này của HAp đã được các nhà khoa học nghiên cứu và khắc phục bằng cách pha tạp vào màng HAp một số nguyên tố vi lượng có mặt trong cơ thể như magiê, natri, sronti, flo, kẽm … Việc pha tạp được thực hiện bằng cách thay thế ion Ca 2+ bằng các cation và thay thế ion OH - bằng anion trong cấu trúc của HAp. Các nguyên tố này khi được đưa vào màng HAp với hàm lượng thích hợp sẽ tạo màng HAp pha tạp có thành phần tương tự xương tự nhiên, làm tăng hoạt tính sinh học cho màng. Ngoài ra, vấn đề nhiễm trùng sau phẫu thuật cũng quyết định tới sự thành công của việc cấy ghép. Do đó các nguyên tố có khả năng kháng khuẩn như đồng, bạc và kẽm cũng được nghiên cứu để đưa vào màng HAp. Sự có mặt của Ag, Zn và Cu trong cấu trúc của HAp có khả năng làm giảm độ bám dính của vi khuẩn, ngăn ngừa sự hình thành màng sinh học, từ đó làm ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn [3, 4]. Chính vì các lý do này mà nghiên cứu sinh đã lựa chọn đề tài luận án: “Tổng hợp và đặc trưng màng hydroxyapatit pha tạp một số nguyên tố vi lượng trên nền thép không gỉ 316L định hướng ứng dụng làm nẹp vít xương”. 2. Mục tiêu của luận án: - Chế tạo thành công màng NaHAp pha tạp riêng rẽ và đồng thời các nguyên tố vi lượng: magiê, stronti, flo, đồng, bạc và kẽm trên nền thép không gỉ 316L đáp ứng yêu cầu làm nẹp vít xương. - Nghiên cứu các đặc trưng hóa lý, nghiên cứu đánh giá độc tính, khả năng kháng khuẩn và khả năng tương thích sinh học của màng NaHAp pha tạp riêng rẽ và đồng thời các nguyên tố trên.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

VÕ THỊ HẠNH

TỔNG HỢP VÀ ĐẶC TRƯNG MÀNG HYDROXYAPATIT PHA TẠP MỘT SỐ NGUYÊN TỐ VI LƯỢNG TRÊN NỀN THÉP KHÔNG

GỈ 316L ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG LÀM NẸP VÍT XƯƠNG

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

HÀ NỘI – 2018

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Hiện nay, vật liệu được sử dụng phổ biến trong ngành chỉnh hình với mục đích làm nẹp vít xương chủ yếu là các kim loại trơ về mặt hóa học như thép không

gỉ 316L, titan và các hợp kim của titan như TiN, TiO2 và Ti6Al4V Các vật liệu nẹp vít xương làm từ titan và hợp kim của titan có độ bền cơ lý cao và khả năng tương thích tốt nhưng giá thành của các sản phẩm này rất cao Do đó, để giảm giá thành của các dịch vụ y tế, ở Việt Nam hiện nay hầu hết các nẹp vít xương đều được làm bằng thép không gỉ 316L Tuy nhiên, thép không gỉ 316L trong môi trường dịch cơ thể người thường bị hạn chế về khả năng chịu ăn mòn và tính tương thích sinh học Khi tồn tại lâu trong cơ thể, thép không gỉ có thể xảy ra sự ăn mòn cục bộ và sản phẩm của quá trình ăn mòn là các hợp chất của crôm, niken, … gây độc cho các tế bào xương và gây dị ứng cho cơ thể [1] Do đó, nhiều trường hợp nẹp vít xương làm bằng thép không gỉ sau một thời gian cấy ghép trong cơ thể có hiện tượng loãng xương và gây phù nề ở chỗ tiếp xúc giữa xương và nẹp vít Vì vậy, để khắc phục những nhược điểm này các nhà khoa học đã nghiên cứu phủ lên nền thép không gỉ màng hydroxyapatit (HAp)

HAp tồn tại cả trong tự nhiên và nhân tạo Trong tự nhiên, HAp là thành phần chính trong xương, răng và mô cứng của người và động vật có vú (trong xương, HAp chiếm khoảng 25-75% theo trọng lượng và 35-65% theo thể tích [2]) HAp tổng hợp có cấu trúc và hoạt tính sinh học tương tự HAp tự nhiên nên chúng

có khả năng tương thích sinh học cao với các tế bào, các mô và không bị cơ thể đào thải HAp được tổng hợp dưới các dạng khác nhau như dạng bột, dạng gốm, dạng compozit, dạng màng và ứng dụng nhiều trong lĩnh vực y sinh Màng HAp được phủ lên nẹp vít xương và các vật liệu dùng trong cấy ghép xương nói chung có tác dụng kích thích tế bào xương phát triển, tăng độ bám dính và sự kết nối mạnh mẽ giữa xương vật chủ và vật liệu cấy ghép Ngoài ra, màng HAp có khả năng bảo vệ kim loại nền chống lại sự ăn mòn trong môi trường sinh lý, hạn chế sự giải phóng ion kim loại từ nền vào môi trường

Tuy nhiên, màng HAp tổng hợp có độ hòa tan tương đối cao trong môi trường sinh lý và tính chất cơ lý kém Nhược điểm này của HAp đã được các nhà

khoa học nghiên cứu và khắc phục bằng cách pha tạp vào màng HAp một số nguyên tố vi lượng có mặt trong cơ thể như magiê, natri, sronti, flo, kẽm … Việc pha tạp được thực hiện bằng cách thay thế ion Ca2+ bằng các cation và thay thế ion

OH- bằng anion trong cấu trúc của HAp Các nguyên tố này khi được đưa vào màng HAp với hàm lượng thích hợp sẽ tạo màng HAp pha tạp có thành phần tương tự xương tự nhiên, làm tăng hoạt tính sinh học cho màng Ngoài ra, vấn đề nhiễm trùng sau phẫu thuật cũng quyết định tới sự thành công của việc cấy ghép Do đó các nguyên tố có khả năng kháng khuẩn như đồng, bạc và kẽm cũng được nghiên cứu để đưa vào màng HAp Sự có mặt của Ag, Zn và Cu trong cấu trúc của HAp có khả năng làm giảm độ bám dính của vi khuẩn, ngăn ngừa sự hình thành màng sinh học, từ đó làm ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn [3, 4]

Chính vì các lý do này mà nghiên cứu sinh đã lựa chọn đề tài luận án: “Tổng hợp và đặc trưng màng hydroxyapatit pha tạp một số nguyên tố vi lượng trên nền thép không gỉ 316L định hướng ứng dụng làm nẹp vít xương”

2 Mục tiêu của luận án:

- Chế tạo thành công màng NaHAp pha tạp riêng rẽ và đồng thời các nguyên

tố vi lượng: magiê, stronti, flo, đồng, bạc và kẽm trên nền thép không gỉ 316L đáp ứng yêu cầu làm nẹp vít xương

- Nghiên cứu các đặc trưng hóa lý, nghiên cứu đánh giá độc tính, khả năng

kháng khuẩn và khả năng tương thích sinh học của màng NaHAp pha tạp riêng rẽ và đồng thời các nguyên tố trên

3 Nội dung nghiên cứu của luận án:

Trên cơ sở mục tiêu nghiên cứu đề ra, nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm 7 nội dung chính sau:

- Khảo sát lựa chọn các điều kiện thích hợp tổng hợp màng NaHAp và NaHAp

pha tạp riêng rẽ và đồng thời các nguyên tố vi lượng: magiê, stronti và flo bằng phương pháp quét thế catôt, nghiên cứu đặc trưng hóa lý màng HAp pha tạp thu được

- Khảo sát lựa chọn các điều kiện thích hợp để tổng hợp màng NaHAp với sự

có mặt riêng rẽ và đồng thời các nguyên tố vi lượng bạc, đồng, kẽm trên nền

TKG316L bằng phương pháp trao đổi ion, nghiên cứu đặc trưng hóa lý màng HAp pha tạp thu được

- Kết hợp đồng thời hai phương pháp: điện hóa và trao đổi ion để tổng hợp

màng NaHAp pha tạp đồng thời các nguyên tố vi lượng: Mg, Sr, F, Cu, Ag

và Zn

- Nghiên cứu hoạt tính sinh học của vật liệu: TKG316L, NaHAp/TKG316L,

MgSrFNaHAp/TKG316L và MgSrFZnCuAgNaHAp/TKG316L trong dung dịch mô phỏng dịch cơ thể người (SBF)

- Nghiên cứu khả năng gây độc tế bào sợi của bột NaHAp, MgSrFNaHAp

bằng 2 phương pháp: Trypan blue và MTT

- Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của bột NaHAp, MgSrFNaHAp,

AgNaHAp, CuNaHAp, ZnNaHAp và MgSrFZnCuAgNaHAp đối với 3 chủng

khuẩn: P.aerugimosa, E.coli và E.faecalis bằng phương pháp khuếch tán đĩa

thạch

- Đánh giá khả năng tương thích sinh học của các vật liệu TKG316L không

phủ và có phủ màng NaHAp và MgSrFNaHAp trên cơ thể chó

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tính chất của HAp

1.1.1 Tính chất vật lý

HAp có màu trắng, trắng ngà, vàng nhạt hoặc xanh lơ, tuỳ theo điều kiện hình thành, có nhiệt độ nóng chảy 1760 oC và nhiệt độ sôi 2850 oC, độ tan trong nước 0,7 g/L, khối lượng mol phân tử 1004,60 g, khối lượng riêng là 3,08 g/cm3, độ cứng theo thang Mohs bằng 5 [5] Các tinh thể HAp thường tồn tại ở dạng hình que, hình kim, hình vảy, hình sợi, hình cầu, hình trụ (hình 1.1) [6]

nh 1.1 Hình ảnh SEM của các tinh thể HAp [6]

(a) - Dạng hình que (b) - Dạng hình trụ (c) - Dạng hình cầu

(d) - Dạng hình sợi (e) - Dạng hình vảy (f) - Dạng hình kim

HAp có hai dạng cấu trúc: dạng lục phương và dạng đơn tà Dạng lục phương thường được tạo thành trong quá trình điều chế ở nhiệt độ từ 25 o

C đến 100

oC Dạng đơn tà chủ yếu được sinh ra khi nung dạng lục phương ở 850 oC trong không khí sau đó làm nguội đến nhiệt độ phòng Giản đồ nhiễu xạ tia X của hai dạng này hoàn toàn giống nhau về số lượng và vị trí của các vạch nhiễu xạ Chúng chỉ khác nhau về cường độ của pic, dạng đơn tà cho các pic có cường độ yếu hơn so với dạng lục phương khoảng 1 % [7]

HAp tự nhiên có trong xương và ngà răng cũng như HAp tổng hợp thường ở dạng lục phương, thuộc nhóm không gian P63/m với các hằng số mạng a, b, c tương ứng là 0,9417; 0,9417 và 0,6875 nm, α = β = 90 o

và γ = 120 o Mỗi ô mạng cơ sở của tinh thể HAp gồm các ion Ca2+, PO43- và OH- được sắp xếp như hình 1.2 [5, 8]

nh 1.2 Cấu trúc của HAp [7]

Công thức cấu tạo của phân tử HAp được thể hiện trên hình 1.3 Có thể nhận thấy phân tử HAp có cấu trúc mạch thẳng, các liên kết Ca - O là liên kết cộng hoá trị, hai nhóm OH được gắn với hai nguyên tử P ở hai đầu mạch [9]

nh 1.3 Công thức cấu tạo của phân tử HAp [9]

1.1.2 Tính chất hóa học

HAp không phản ứng với kiềm nhưng phản ứng với axit tạo thành muối Ca2+:

Ca10(PO4)6(OH)2 + 2HCl  3Ca3(PO4)2 + CaCl2 + 2H2O (1.1) HAp tương đối bền nhiệt, bị phân huỷ chậm trong khoảng nhiệt độ từ 800 o

C đến 1200 o

C tạo thành ôxy - hydroxyapatit theo phản ứng:

Ca10(PO4)6(OH)2  Ca10(PO4)6(OH)2-2xOx + xH2O (0  x  1) (1.2)

Ở nhiệt độ lớn hơn 1200 oC, HAp bị phân huỷ thành β - Ca3(PO4)2 (β- TCP)

OH

-1.1.3 Tính chất sinh học

HAp là dạng canxi photphat có tỷ lệ Ca/P trong phân tử đúng như tỷ lệ trong xương và răng, nên HAp nhân tạo có tính tương thích sinh học cao Điều này dẫn đến khả năng ứng dụng cao của HAp trong y học

Hợp chất HAp tương đối bền với dịch men tiêu hoá, ít chịu ảnh hưởng của dung dịch axit trong dạ dày Ở dạng bột mịn kích thước nano, HAp được cơ thể người hấp thụ rất nhanh qua niêm mạc lưỡi và thực quản [10]

Ở dạng màng, HAp có thành phần hoá học và các đặc tính giống xương tự nhiên, các lỗ xốp liên thông với nhau làm cho các mô sợi, mạch máu dễ dàng xâm nhập Chính vì vậy mà vật liệu này có tính tương thích sinh học cao với các tế bào

và mô, có tính dẫn xương tốt, tạo liên kết trực tiếp với xương non dẫn đến sự tái sinh xương nhanh mà không bị cơ thể đào thải [11] Ngoài ra, HAp là hợp chất không gây độc, không gây dị ứng cho cơ thể người và có tính sát khuẩn cao [9]

10Ca(NO3)2 + 6(NH4)2HPO4 + 8NH3 + 8 H2O  Ca10(PO4)6(OH)2 +

20NH4NO3 + 6H2O (1.5) 10Ca(OH)2 + 6H3PO4  NH3H2O

Ca10(PO4)6(OH)2 + 18H2O (1.6) Hơn nữa, với phương pháp kết tủa hóa học dễ dàng tổng hợp bột HAp pha tạp bằng cách cho thêm muối NO3- của ion cần pha tạp vào dung dịch ban đầu theo phản ứng (1.7) [14, 17]:

10Ca(NO3)2 + xM(NO3)n + 6(NH4)2HPO4 + (8+xn)NH3 + (8+xn) H2O 

1000 oC Kết quả thu được mẫu HAp dạng khối độ xốp 47 %, kích thước lỗ xốp khoảng 50 - 120 nm, ứng suất kéo mẫu 4 - 21 MPa [18]

1.2.3 Dạng compozit

HAp dạng compozit được tổng hợp từ nguyên liệu ban đầu HAp dạng bột và chất nền là các phân tử polyme, các polyme sinh học được ưu tiên sử dụng làm chất nền như polylactic [21], polyamit [22], collagen [23, 24], chitosan [25], chitin [26], pectin [23], … Các polyme này thuận lợi cho việc gia công, chế tạo các chi tiết, đồng thời còn có khả năng liên kết với các tế bào sinh học thông qua các nhóm chức Ngoài ra, có thể tạo nano compozit HAp bằng cách phân tán đều ion Ca2+trong mạng lưới polyme, sau đó các anion PO43- và OH- được đưa vào dưới dạng dung dịch để phản ứng tạo thành các nano tinh thể

1.2.4 Dạng màng

Trong ngành phẫu thuật chỉnh hình các kim loại như titan, các hợp kim của titan và TKG thường được sử dụng để thay thế hay nối ghép các bộ phận xương Mặc dù các kim loại này có độ bền cao nhưng khả năng tương thích sinh học còn hạn chế, bị ăn mòn theo thời gian nên các mô tế bào không có khả năng phát triển trên các kim loại, do đó rất khó hình thành liên kết hóa học với xương tự nhiên Vì vậy, để cải thiện những hạn chế này các nhà khoa học đã nghiên cứu tổng hợp màng HAp trên nền kim loại cấy ghép: trên nền Titan và hợp kim của Titan [27-31], nền TKG316L [32-35], nền Co [36], hợp kim của Mg [37, 38], Màng HAp khi phủ lên vật liệu y sinh đã cải thiện được hoạt tính sinh học cho vật liệu, giúp cho quá trình liền xương nhanh hơn và thúc đẩy xương non phát triển

Màng HAp thường được phủ trên kim loại nền bằng các phương pháp:

phương pháp vật lý (plasma [6, 39, 40], phún xạ magnetron [41-43], mạ xung laze

[44-46], bốc bay chân không [47]), phương pháp hồ quang điện [38, 48], phương

pháp điện di [33, 49, 50], phương pháp sol-gel [1, 51, 52] và phương pháp điện hóa

[28, 29, 33, 36, 49, 52] Các phương pháp trên đều có ưu và nhược điểm riêng Các

phương pháp vật lý và phương pháp sol - gel có ưu điểm dễ dàng chế tạo được màng

HAp có chiều dày cỡ µm Tuy nhiên, màng được tạo ra có độ bám dính không cao

với vật liệu nền, khó điều chỉnh được chiều dày màng, hơn nữa do quá trình được

thực hiện ở nhiệt độ cao nên sản phẩm thường bị lẫn các tạp chất của vật liệu nền và

ở nhiệt độ cao HAp dễ bị phân hủy dẫn đến tỷ lệ Ca/P bị thay đổi Còn phương pháp

điện di và hồ quang điện được thực hiện ở hiệu điện thế rất cao dẫn đến chi phí lớn

Để khắc phục các hạn chế nêu trên, các nhà khoa học đã sử dụng phương pháp điện

hóa để chế tạo màng HAp trên các vật liệu nền khác nhau, phương pháp này có nhiều

ưu điểm như nhiệt độ phản ứng thấp, cho phép điều khiển được chiều dày màng,

màng tạo ra có độ tinh khiết và độ bám dính cao, hệ phản ứng đơn giản [36, 37]

Sự hình thành màng HAp bằng phương pháp kết tủa catôt trong dung dịch

chứa Ca(NO3)2 + NH4H2PO4 + NaNO3 có thể xảy ra một số phản ứng như sau [35,

Ngoài ra, với phương pháp điện hóa còn dễ dàng đưa thêm một số nguyên tố

vi lượng có mặt trong cơ thể như Mg, Sr, F… pha tạp vào màng HAp bằng cách đưa muối M(NO3)n vào dung dịch tổng hợp để tạo màng HAp pha tạp theo phương trình phản ứng (1.16):

(10-x)Ca2+ + 6PO43- + (2-y)OH- + xM2+ + yX-  Ca10-x M x(PO4)6(OH)2-yXy (1.16)

Tuy nhiên, bằng phương pháp điện hóa rất khó tổng hợp màng HAp pha tạp các nguyên tố có thế khử lớn như Cu, Ag, Zn Do đó, các nguyên tố này được nghiên cứu

để pha tạp vào màng HAp bằng phương pháp trao đổi ion

1.3 Tính chất và các phương pháp tổng hợp HAp pha tạp

Màng HAp pha tạp các nguyên tố Na, Mg, Sr, F, Cu, Ag, Zn có nhiều ưu điểm vượt trội hơn so với màng HAp nguyên chất như: độ hòa tan màng giảm; sự trao đổi chất, khả năng tương thích sinh học và hoạt tính sinh học của màng tăng

1.3.1 Pha tạp natri

Natri là một nguyên tố phổ biến bên cạnh sự hiện diện của nguyên tố canxi và phôtpho trong khoáng xương và răng tự nhiên Tỷ lệ nguyên tố Na trong xương, men răng và ngà răng tương ứng là 0,7; 0,5 và 0,8 % [54] Sự hiện diện của natri trong apatit sinh học có thể tăng cường bám dính các tế bào và thúc đẩy sự chuyển hóa xương, tăng quá trình trao đổi chất và kích thích tế bào xương phát triển

Các nhà khoa học đã nghiên cứu pha tạp Na vào màng HAp trên nền compozit C/C bằng phương pháp áp dòng catôt [55] Màng NaHAp có khả năng tương thích sinh học cao trong dung dịch SBF, thể hiện bằng khả năng hình thành màng apatit dày đặc hơn so với màng HAp nguyên chất sau 14 ngày ngâm vật liệu Hơn nữa, kết quả nghiên cứu của tác giả cho thấy sự phát triển của tế bào tạo xương

MC3T3-E1 trên màng NaHAp nhanh hơn so với màng HAp nguyên chất Điều này

chứng tỏ sự có mặt Na trong màng đã làm tăng tính tương thích sinh học cho màng NaHAp [55]

1.3.2 Pha tạp magiê

Magiê là một trong những yếu tố cần thiết cho tất cả các sinh vật sống, hơn

100 enzym cần sự có mặt của ion magiê cho quá trình xúc tác [1] Sự có mặt của

Mg trong xương đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành các mô xương và thúc đẩy sự canxi hóa, đồng thời giúp cho các chất vôi (canxi) được trải đều trong

mô xương Thiếu magiê sẽ ảnh hưởng đến tất cả các giai đoạn chuyển hóa xương gây ngừng phát triển xương, giảm tế bào xương và hoạt động của tế bào xương [56] Magiê cũng ngăn ngừa các nguy cơ có thể gây loãng xương trong cơ thể người Hơn nữa, sự kết hợp của các ion magiê trong HAp sẽ làm giảm độ hòa tan,

do đó nâng cao kết dính tế bào và cải thiện hoạt tính sinh học cho HAp [57] Vì vậy, HAp pha tạp Mg được nghiên cứu tổng hợp ở nhiều dạng khác nhau: dạng bột được tổng hợp bằng phương pháp kết tủa hóa học [17], phương pháp sol-gel [58] ; dạng gốm xốp tổng hợp bằng phương pháp thiêu kết [58]; dạng màng được tổng hợp bằng phương pháp điện hóa [57], phương pháp mạ xung laze [56], phương pháp sol-gel [1]

Nhà khoa học Yajing Yan và cộng sự pha tạp tổng hợp màng MgHAp và HAp trên nền Ti bằng phương pháp kết tủa điện hóa trong dung dịch điện ly gồm: Ca(NO3)2 0,036 M + NH4H2PO4 0,025 M + Mg(NO3)2 0,0084 M sao cho tỉ lệ (Ca + Mg)/P = 1,67; ở pH 4,2; nhiệt độ 65 oC; mật độ dòng không đổi 0,85 mA/cm2 và thời gian lắng đọng 2100 giây Kết quả nghiên cứu hình thái bề mặt của màng cho thấy, các tinh thể MgHAp có dạng hình tấm và dày đặc với chiều dày 21,2 µm, trong khi đó tinh thể HAp có hình kim và kém dày đặc hơn Các nghiên cứu về độ bám dính cho kết quả màng MgHAp có độ bám dính là 18,1 MPa, cao hơn so với màng HAp có độ bám dính khoảng 17,3 MPa [57]

Màng MgHAp tạo ra được nghiên cứu khả năng tương thích sinh học trong dung dịch SBF cho thấy sự phát triển apatit trên màng MgHAp tốt hơn so với màng HAp nguyên chất [1, 56] Sự có mặt của Mg trong màng HAp đã cải thiện được độ bám dính của tế bào nguyên xương so với màng HAp tinh khiết [56]

1.3.3 Pha tạp stronti

Stronti được biết đến là một trong những cation quan trọng trong xương, hoạt động để thúc đẩy tăng trưởng xương Stronti thúc đẩy sự sinh trưởng của tế bào tạo xương, có khả năng ức chế hoạt động của hủy cốt bào, ức chế tái hấp thu xương và giảm hoạt động của tế bào hủy xương Hàm lượng tối ưu của stronti cho hoạt động nâng cao tế bào tạo xương được xác định khi pha tạp vào HAp từ 3 – 7 % về khối lượng [59]

Nhà khoa học Kaihui Nan và cộng sự đã tổng hợp màng SrHAp trên nền Ti bằng phương pháp hồ quang điện trong dung dịch điện li có chứa canxi axetat,

stronti axetat và muối đinatri pentahydrat phôtphat β - glyxerol ở nhiệt độ 40 oC, điện áp 400 V, mật độ dòng điện 0,5 A/cm2 trong 15 phút [60] Kết quả cho thấy màng SrHAp tạo thành có cấu trúc xốp và lỗ, các lỗ được phân phối đồng đều trên bề mặt màng với đường kính dao động 5 - 10 µm, chiều dày màng khoảng 15 - 25 nm

Màng SrFHAp cũng được nghiên cứu và tổng hợp trên nền kim loại Ti bằng phương pháp điện hóa trong dung dịch điện ly gồm: Sr(NO3)2 + Ca(NO3)2 + (NH4)2HPO4 + NaF ở pH bằng 4, nhiệt độ 60 oC, mật độ dòng 9,4.10-4 A/cm2 trong

40 phút [59] Màng SrFHAp thu được có công thức Ca9,5Sr0,5(PO4)6(OH)1,35F0,65, cấu trúc nhẵn, đồng nhất, không bị phân lớp, so với màng HAp nguyên chất màng SrFHAp dày đặc hơn và độ xốp thấp hơn; trong dung dịch nước muối sinh lý (NaCl 0,9 %), hàm lượng ion Ca2+ bị hòa tan từ màng SrFHAp chậm hơn nhiều so với màng HAp nguyên chất; trong dung dịch SBF, giá trị điện thế ăn mòn Ecorr của vật liệu SrFHAp/Ti dịch chuyển về phía dương hơn so với vật liệu HAp/Ti và nền Ti không phủ, giá trị mật độ dòng ăn mòn icorr của vật liệu SrFHAp/Ti giảm khoảng 24 lần so với nền Ti và giảm hơn 5 lần so với vật liệu HAp/Ti Như vậy, sự có mặt của

Sr và F trong màng đã làm giảm khả năng hòa tan màng HAp trong môi trường sinh

lý, màng SrFHAp có thể ngăn chặn sự khuếch tán ion gây ăn mòn và có khả năng bảo vệ cho bề mặt kim loại nền

1.3.4 Pha tạp flo

Flo là nguyên tố vi lượng tồn tại trong men răng và xương, flo đóng vai trò thiết yếu chống lại sự hòa tan apatit và có thể kích thích sự kết tinh khoáng muối Ca-P trong quá trình hình thành xương [59] Sự hiện diện của FHAp trong tinh thể men răng làm tăng sự ổn định, giúp chống lại sự hòa tan trong môi trường miệng có tính axit Màng hydroxyapatit pha tạp flo được tổng hợp bằng nhiều phương pháp khác nhau: phương pháp bốc bay chân không [47], phương pháp sol - gel [1], phương pháp điện hóa [61-63], sự có mặt F đã làm giảm khả năng hòa tan màng

và tăng khả năng tương thích sinh học cho màng FHAp so với màng HAp nguyên chất [1, 47, 59]

1.3.5 Pha tạp đồng

Đồng là nguyên tố vi lượng cần thiết cho cơ thể, với hàm lượng nhỏ nhưng rất quan trọng cho nhiều hoạt động sống của sinh vật Ngoài ra, đồng còn có khả năng kháng khuẩn cao

Vật liệu Ti chứa hàm lượng đồng 2 % về khối lượng có thể chống được 57 %

khuẩn E.coli và 79 % khuẩn S.aureus [64] Bằng phương pháp đồng kết tủa các nhà

khoa học người Ấn độ đã tổng hợp bột CuHAp, CuFHAp và nghiên cứu hoạt động kháng khuẩn của chúng bằng cách thử nghiệm chống lại vi khuẩn gram âm và gram dương Kết quả cho thấy bột CuFHAp ứng với công thức Ca10-xCux(PO4)6(F)2 (x =

0,15-0,5) có thể chống được 100 % vi khuẩn E.coli và bột CuHAp ứng với công

thức Ca10-xCux(PO4)6(OH)2 (x = 0,2) chống được 98 % vi khuẩn S.aureus [2] Gần

đây, nhà khoa học Yong Huang và các cộng sự đã tổng hợp màng CuSrHAp trên nền Ti với mục đích tăng tính tương thích sinh học và tăng khả năng kháng khuẩn cho màng HAp Kết quả cho thấy lớp phủ CuSrHAp có khả năng chống ăn mòn cao trong dung dịch SBF, tăng khả năng bám dính của tế bào tạo xương và với sự có

mặt của đồng có thể làm chết khuẩn E.coli trong một vài ngày đầu tiên [65]

1.3.6 Pha tạp bạc

Bạc được biết đến với hoạt động kháng khuẩn phổ rộng chống lại vi khuẩn gram dương và vi khuẩn gram âm, nấm, động vật nguyên sinh và virus, kể cả các chủng kháng thuốc kháng sinh [4] Do đó việc đưa bạc vào màng HAp nhằm mục đích kháng khuẩn được các nhà khoa học quan tâm

Màng HAp pha tạp Ag được nhà khoa học tổng hợp trên nền Ti bằng phương pháp phún xạ magnetron [66, 67], phương pháp plasma [68], trên nền TKG316L bằng phương pháp đồng kết tủa [69]… Các kết quả thử nghiệm khả năng kháng

khuẩn cho thấy màng nano AgHAp có khả năng kháng 98 % vi khuẩn S.aureus và

hơn 99 % vi khuẩn E.Coli trong vòng 24 giờ [64, 70, 71], có khả năng kháng khuẩn

tốt đối với vi khuẩn S.pyogenes và S.typhimurium [64]

1.3.7 Pha tạp kẽm

Kẽm là nguyên tố vi lượng cần thiết trong cơ thể Sự có mặt của Zn trong xương có tác dụng kích thích sự hình thành xương và ức chế quá trình hủy xương Nếu thiếu Zn sẽ làm tăng nguy cơ loãng xương, làm cho xương giòn, xốp và dễ gãy

[72] Hạt nano ZnHAp chứa 1,6 % Zn về khối lượng đã cho thấy khả năng tăng hoạt tính sinh học, có khả năng kháng khuẩn và không độc hại cho các tế bào [73]

Màng ZnHAp đã được tổng hợp trên nền TKG304 bằng phương pháp điện di [73] Các nghiên cứu về độ bám dính và khả năng tương thích trong dung dịch SBF cho thấy: ZnHAp tạo ra có dạng hình kim và độ bám dính giữa màng và kim loại nền đạt 16,9 ± 1,9 MPa, sau khi ngâm 7 ngày trong dung dịch SBF một màng apatit mới đã được hình thành trên bề mặt của mẫu, chứng tỏ màng ZnHAp có hoạt tính sinh học tốt trong dung dịch SBF

Nhóm nghiên cứu người Ấn Độ đã nghiên cứu sự phát triển vi khuẩn

P.gingivalis (tác nhân chính gây bệnh sâu răng) trên màng FHAp và ZnFHAp tổng

hợp trên nền Ti bằng phương pháp sol - gel và trên màng TiN Kết quả chỉ ra khả năng ức chế vi khuẩn của màng ZnFHAp lớn hơn màng FHAp và lớn hơn màng TiN [74]

1.4 Thử nghiệm hoạt tính sinh học của HAp

1.4.1 Thử nghiệm in vitro

Khả năng tương thích của vật liệu cấy ghép với xương tự nhiên được quan tâm nghiên cứu bằng nhiều phương pháp khác nhau Một trong số các phương pháp tiếp cận quan trọng nhất là nghiên cứu sự hình thành màng apatit trên bề mặt của vật liệu khi ngâm trong môi trường SBFhoặc thử nghiệm trên cơ thể động vật sống

Khả năng chống ăn mòn, bảo vệ của màng HAp cho vật liệu nền được nghiên cứu bằng các phương pháp điện hóa (đo điện thế mạch hở, đo phổ tổng trở,

đo đường cong phân cực ngoại suy Tafel) khi ngâm vật liệu trong dung dịch SBF [57, 59, 75] hoặc dung dịch muối Ringer (NaCl 0,86 % + KCl 0,03 % + CaCl2 0,033

%) ở 37oC %) [1, 76]

Để nghiên cứu khả năng hòa tan, các nhà khoa học xác định hàm lượng ion

Ca2+ hòa tan từ màng HAp hoặc HAp pha tạp và nồng độ ion kim loại nền hòa tan khi ngâm vật liệu trong dung dịch muối sinh lý [59] hoặc dung dịch muối Ringer ở

37 oC [1, 76]

Đánh giá hoạt tính sinh học của vật liệu bằng cách nghiên cứu khả năng phát triển của tế bào tạo xương MC3T3 - E1 khi được nuôi cấy trên bề mặt vật liệu [54,

57, 59, 61]

1.4.1.1 Trong dung dịch mô phỏng dịch cơ thể người

Để nghiên cứu khả năng tương thích sinh học của vật liệu Ti có phủ màng MgHAp, nhà khoa học Yajing Yan và cộng sự đã tiến hành ngâm vật liệu trong dung dịch SBF [57] Kết quả nghiên cứu hình thái bề mặt màng sau khi ngâm 4 ngày trong dung dịch SBF cho thấy có sự hình thành màng apatit dày đặc trên màng MgHAp (hình 1.4)

nh 1.4 Hình ảnh SEM của màng MgHAp trước và sau 4 ngày ngâm trong

1.4.1.2 Trong dung dịch Ringer và dung dịch muối sinh lý

Khả năng chống ăn mòn và khả năng hòa tan của vật liệu TKG 316L không phủ và có phủ màng MgFHAp với thành phần khác nhau được nghiên cứu bằng cách ngâm trong dung dịch muối sinh lý và dung dịch muối Ringer [1] Kết quả đo đường cong phân cực của vật liệu cho thấy tất cả vật liệu phủ màng MgFHAp đều cho mật độ dòng ăn mòn thấp hơn từ 2,1 ÷ 2,6 lần trong dung dịch muối Ringer và

từ 2,2 ÷ 2,4 lần so với TKG316 không phủ và thấp nhất ứng với mẫu phủ màng MgFHAp ứng với công thức Ca9Mg(PO4)6F2 (FA10Mg)

Hình ảnh SEM của mẫu sau khi đo đường cong phân cực ở khoảng thế từ -400

mV đến 1000 mV cho thấy trên nền TKG316 không phủ có sự ăn mòn cục bộ xảy ra

rõ với các lỗ ăn mòn chiều rộng lên tới 50 - 100 µm, còn vật liệu TKG 316L có phủ màng FA10Mg thì sự ăn mòn xảy ra không rõ với các lỗ ăn mòn có chiều rộng 5 - 15

µm Kết quả này chứng tỏ màng FA10Mg có năng bảo vệ tốt cho kim loại nền, ngăn

chặn sự giải phóng các ion kim loại từ nền vào môi trường và cải thiện khả năng

tương thích sinh học cho nền TKG316L khi cấy ghép trong cơ thể người

1.4.1.3 Thử nghiệm tế bào

Nhà khoa học Yong Huang và các cộng sự đã nuôi cấy tế bào MC3T3 - E1 trên bề mặt vật liệu Titan có phủ màng SrFHAp, HAp và không phủ trong 24 giờ, ở

37oC Hình ảnh SEM (hình 1.5) cho thấy, trên bề mặt vật liệu có phủ màng SrHAp,

tế bào xuất hiện nhiều hơn và lan truyền tốt hơn so với vật liệu phủ HAp nguyên chất và nền Ti không phủ Điều này chứng tỏ màng SrFHAp có hoạt tính sinh học tốt và có khả năng tăng cường độ kết dính với tế bào [59]

nh 1.5 Hình ảnh SEM của tế bào MC3T3 - E1 phát triển trên: màng HAp

(a), màng SrFHAp (b) và nền Ti (c) [59]

1.4.2 Thử nghiệm in vivo

Tại Viện công nghệ Massachusetts (Mỹ), các nhà khoa học đã nghiên cứu và

so sánh sự hình thành xương non của chân chó khi được cấy ghép bởi ba loại vật liệu: Ti6Al4V không phủ, Ti6Al4V phủ HAp tổng hợp bằng phương pháp phun plasma (PSHA) và Ti6Al4V phủ HAp tổng hợp bằng phương pháp điện hóa (EDHA) [77] Trong khoảng thời gian từ 6 giờ đến 7 ngày cấy ghép, trên cả ba loại vật liệu sớm hình thành các cụm khoáng Từ 7 ngày đến 14 ngày, mô xương mới được hình thành với các sợi collagen tự kết nối bởi các tiểu cầu HAp Tuy nhiên, thời gian hình thành mô xương có sự khác biệt giữa hai vật liệu phủ màng PSHA và EDHA: trên màng PSHA, quá trình hình thành mô xương diễn ra sớm, sau 7 ngày cấy hình ảnh TEM cho thấy một lớp mô khoáng dày đặc hình thành ngay trên bề mặt màng; ngược lại, quá trình hình thành mô xương diễn ra trên màng EDHA

chậm hơn trong 7 ngày đầu, nhưng sau 7 ngày các mô khoáng mới trên màng EDHA hình thành một cách nhanh chóng với cấu trúc dải đặc trưng của lớp collagen được nhìn thấy trong lớp mô xương mới Sau 14 ngày, lớp mô xương mới hình thành trên cả hai màng EDHA và PSHA là như nhau và cao hơn nhiều so với vật liệu Ti6Al4V không phủ màng HAp Như vậy, sự có mặt của HAp đã giúp cho

sự hình thành xương non diễn ra nhanh hơn

Để nghiên cứu sự ăn mòn và viêm tại chỗ của màng octacanxi phôtphat (OCP) và HAp, nhóm tác giả Sachiko Hiromoto đã phủ màng OCP hoặc HAp trên

hợp kim magiê (AZ31) và tiến hành thử nghiệm in vivo bằng cách cấy vào dưới da

của chuột chuyển gen [78] Kết quả cho thấy màng HAp và OCP đều có khả năng chống ăn mòn cao, trong đó vật liệu AZ31 có phủ màng HAp cho tỷ lệ ăn mòn thấp hơn 20% so với màng OCP Sau 16 tuần cấy, một lớp mô mềm đã được hình thành xung quanh màng HAp hoặc OCP/AZ31 (hình 1.6) và không có hiện tượng viêm nhiễm, còn trên chuột có cấy vật liệu AZ31 không phủ thì có sự hình thành lớp mô mềm tuy nhiên lại có hiện tượng viêm tại chỗ cấy ghép

nh 1.6 Sự hình thành mô mềm trên AZ31 (a) và HAP/AZ31 (b) ở dưới da

khi cấy vào chuột sau 16 tuần [78]

1.5 Ứng dụng của HAp và HAp pha tạp

HAp tổng hợp có cấu trúc và hoạt tính sinh học tương tự HAp tự nhiên nên HAp được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y sinh dưới dạng bột, dạng gốm, dạng compozit và dạng màng HAp được dùng để chế tạo vật liệu cấy vào cơ thể sinh vật, làm chất gắn kết trong xương, làm dược phẩm, thuốc trong y tế

1.5.1 Làm thuốc bổ sung canxi

Canxi đóng vai trò rất quan trọng trong nhiều hoạt động của cơ thể như tham gia vào quá trình co cơ, dẫn truyền thần kinh, giải phóng các hormon và đông máu Ngoài ra, nó còn tham gia vào quá trình điều hoà nhiều enzym khác nhau trong cơ thể Nếu cơ thể thiếu canxi có thể gây ra các bệnh như còi xương, loãng xương,

Vì vậy, việc bổ sung canxi là rất quan trọng và cần thiết cho sức khỏe con người, đặc biệt cho trẻ em và người cao tuổi

Có thể bổ sung canxi cho cơ thể người bằng cách dùng thức ăn, thuốc tiêm hoặc truyền huyết thanh, … Tuy nhiên, canxi có trong thức ăn hoặc thuốc thường nằm ở dạng hợp chất hòa tan nên khả năng hấp thụ của cơ thể không cao và thường phải dùng kết hợp với vitamin D nhằm tăng cường việc hấp thụ và chuyển hoá canxi thành HAp Do đó phương pháp hữu hiệu để bổ sung canxi là sử dụng HAp ở dạng bột mịn, kích thước nano [10]

Trong thành phần của HAp chứa rất nhiều canxi và hợp chất HAp được cơ thể người hấp thụ trực tiếp mà không cần chuyển hóa Vì thế, bột HAp kích thước nano được dùng làm thuốc bổ sung canxi với hiệu quả cao

1.5.2 Làm các bộ phận để cấy ghép vào cơ thể

1.5.2.1 Làm răng giả và sửa chữa những khuyết tật của răng

Các nhà khoa học Nhật Bản đã thành công trong việc tạo ra một hỗn hợp gồm HAp tinh thể kích thước nano và polyme sinh học có khả năng phủ và bám dính trên răng theo cơ chế “mọc ghép”, nghĩa là tinh thể HAp mới tạo thành lớp men răng cứng chắc, “bắt chước” theo đúng tinh thể HAp của lớp men răng tự nhiên [79] Quá trình này gồm 2 giai đoạn:

Giai đoạn a: Lớp men HAp cũ, cần thay thế trên bề mặt răng bị phân huỷ bởi dung dịch H2O2 + H3PO4 Hợp chất H2O2 còn có tác dụng loại bỏ các chất bẩn tồn tại trên răng

Giai đoạn b: Các ion Ca2+, PO43-, OH- trong các polime sinh học dạng bột nhão tạo thành vi tinh thể HAp kích thước nano Hỗn hợp này được phủ lên bề mặt răng cũ để tạo thành lớp men răng mới

1.5.2.2 Làm mắt giả

Vật liệu gốm xốp HAp có cấu trúc xốp bền vững, nhẹ và đặc biệt là có nhiều

lỗ liên thông với nhau, tạo thuận lợi cho sự xâm nhập của mô sợi và mạch máu, không độc, không dị ứng và có khả năng thích ứng cao với cơ thể Nhà khoa học Ấn

Độ B.Kundu đã chế tạo mắt nhân tạo từ gốm xốp HAp được tổng hợp từ san hô và

thử nghiệm in vivo trên chó Kết quả cho thấy mắt nhân tạo này cho phép các mạch

máu tiếp nhận và phát triển thành các mô cấy, có khả năng thích ứng tốt trong cơ thể mà không bị nhiễm trùng, các kết quả thực nghiệm này mở ra khả năng ứng dụng mắt nhân tạo trên cơ thể người [80]

Ngoài ra, việc sử dụng loại vật liệu này đã khắc phục được hiện tượng sụp

mi do trọng lượng, hạn chế các phản ứng của cơ thể và làm tăng thời gian sử dụng của mắt giả

1.5.2.3 Làm vật liệu thay thế và sửa chữa những khuyết tật của xương

Tuỳ thuộc vào mục đích cấy ghép hoặc thay thế, người ta có thể chế tạo ra các sản phẩm gốm HAp có kích thước và độ xốp khác nhau [81] Sau đó, gia công các sản phẩm này thành các chi tiết phù hợp hoặc có thể sử dụng gốm HAp ở dạng hạt để điền đầy những chỗ khuyết tật của xương [82]

Tuy nhiên, gốm y sinh HAp nguyên chất không phù hợp với những vùng xương phải chịu tải trọng nặng của cơ thể bởi tính cơ lý kém, độ bền cơ học thấp trong môi trường cơ thể người, ngoài ra nếu sử dụng ở dạng khối hoặc hạt thì HAp không thể phân hủy trong cơ thể người Do đó trong nhiều năm trở lại đây, compozit tạo nên bởi các hạt HAp và polyme phân hủy sinh học (polyaxit lactic, polyacrylic axit, chitosan, polyvinyl ancol và các đồng phân polyme của nó) đã nhận được rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học vì tính dẫn xương tốt, khả năng phân hủy sinh học và độ bền cơ học cao Ngoài ra, các polyme này còn có khả năng liên kết với các tế bào sinh học thông qua các nhóm chức của mình Đây cũng

là ưu điểm vượt trội của vật liệu compozit chứa HAp [83-85]

J Huang và các cộng sự đã chế tạo xương nhân tạo từ vật liệu compozit của polyaxit lactic và HAp (PLLA/HAp và PLA/HAp) bằng phương pháp trộn nóng chảy [86] Kết quả nghiên cứu hình thái cấu trúc bằng các phương pháp TEM và XRD cho thấy nano HAp là các tinh thể hình kim có kích thước 50 - 200 nm gần giống với xương người, cả PLLA và HAp đều giữ nguyên cấu trúc kết tinh trong

vật liệu nanocompozit PLLA/HAp Thử nghiệm hoạt tính sinh học của vật liệu PLLA/HAp được tiến hành bằng cách ngâm chúng vào dung dịch SBF với tỷ lệ rắn/lỏng là 1,5 mg/mL Sau 7 ngày thử nghiệm, quan sát ảnh SEM của vật liệu cho thấy cấu trúc lỗ xốp của HAp đã thiêu kết không thay đổi Tuy nhiên, trên bề mặt của compozit xuất hiện một vài cặn đọng của HAp với kích thước khoảng 100 nm Ngoài ra, từ phổ năng lượng tán xạ tia X của vi cấu trúc khung compozit PLLA/HAp sau 7 ngày ngâm trong SBF có thể phát hiện sự có mặt của Ca và P với

tỷ lệ Ca/ P bằng 1,65 gần với cấu trúc của apatit

Ngoài ra, màng HAp được phủ lên nẹp vít xương nhằm mục đích làm tăng khả năng chống ăn mòn và tăng cường tính tương thích sinh học của nẹp vít khi đưa vào cơ thể Màng HAp có khả năng định hình, tạo liên kết chặt chẽ giữa xương của vật chủ và vật liệu cấy ghép, thúc đẩy quá trình liền xương [69]

1.6 Tình hình nghiên cứu HAp ở trong nước

Trong nước, một số nhóm nghiên cứu đã tiến hành nghiên cứu tổng hợp HAp Tuy nhiên, các nghiên cứu về HAp mới chỉ dừng lại ở dạng bột, dạng gốm, dạng compozit và dạng màng HAp nguyên chất Cho đến nay, chưa có công trình nào công bố về tổng hợp màng HAp pha tạp Sau đây là một số nghiên cứu về HAp tiêu biểu ở trong nước:

Bộ môn Hóa vô cơ, Khoa Hóa học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã nghiên cứu tổng hợp bột HAp bằng phương pháp kết tủa hóa học [13, 87, 88] Nhóm nghiên cứu cũng tổng hợp thành công vật liệu HAp phủ trên màng polyme sinh học PVA [89]

Nhóm nghiên cứu của TS Đỗ Ngọc Liên, Viện Công nghệ xạ hiếm đã triển khai đề tài nghiên cứu cấp Bộ về tổng hợp bột và chế thử gốm xốp HAp [90] Bên cạnh đó, nhóm nghiên cứu cũng tạo màng HAp bằng phương pháp sol-gel trong dung môi etanol [91]

Nhóm nghiên cứu của cố TS Đào Quốc Hương, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã thực hiện một số đề tài nghiên cứu tổng hợp HAp dạng bột, những kết quả ban đầu đã mở ra triển vọng ứng dụng bột HAp làm nguyên liệu trong việc bào chế thuốc chống loãng xương [12] và HAp dạng gốm xốp với mục đích dùng làm vật liệu nối xương trong phẫu thuật chỉnh hình [92], tuy nhiên,

Luận án tiến sĩ của Vũ Duy Hiển đã tổng hợp thành công vật liệu HAp đơn pha dạng khối xốp bằng phương pháp thủy nhiệt trực tiếp từ khung xương mai mực [93] Gốm xốp nhận được sau khi thiêu kết vẫn giữ được cấu trúc xốp tự nhiên của mai mực ban đầu Những thử nghiệm trong dung dịch SBF đã khẳng định mẫu gốm xốp HAp đều có tính tương thích sinh học

Nhóm nghiên cứu của PGS.TS Nguyễn Kim Ngà, Viện Kỹ thuật hóa học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã nghiên cứu tổng hợp compozit của HAp và polyaxit lactic (PDLA) để làm khung xương nhân tạo bằng cách đúc với chất tạo xốp NaCl Kết quả thử nghiệm trong môi trường SBF cho thấy, sau 7 ngày ngâm vật liệu có sự hình thành màng apatit dạng hoa Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu khả năng kết dính và phát triển của dòng tế bào người MG63 cho thấy có sự phát triển của tế bào tốt nhất đối với vật liệu có chứa 30 % HAp [89]

Nhóm nghiên cứu của PGS TS Đinh Thị Mai Thanh, Viện Kỹ thuật nhiệt đới đã thực hiện một số đề tài nghiên cứu tổng hợp màng HAp trên nền TKG304, TKG316L, TiN/TKG316L, Ti, Co bằng phương pháp kết tủa điện hóa trong dung dịch chứa muối Ca2+ và H2PO4- Kết quả đã lựa chọn được điều kiện thích hợp để tổng hợp màng HAp và HAp thu được có cấu trúc tinh thể, đơn pha dạng cầu, que

và xương rồng [94] Sự tương thích của vật liệu phủ màng HAp được thử nghiệm trong dung dịch SBF Kết quả thử nghiệm cho thấy màng HAp tổng hợp có khả năng bảo vệ cho vật liệu nền, đồng thời màng apatit được hình thành có dạng tinh thể, đơn pha, cấu trúc xương rồng [95-98] Nhóm nghiên cứu cũng đã nghiên cứu tổng hợp bột HAp pha tạp Mg, Al, Ba và bột nano compozit HAp/Chitosan bằng phương pháp kết tủa hóa học để định hướng xử lý flo và một số ion kim loại nặng trong nước [99-101] Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng đã chế tạo thành công compozit PLA/HAp bằng các phương pháp khác nhau và kết quả thử nghiệm 3 tháng trong xương chân chó cho thấy vật liệu có khả năng tương thích tốt, không gây phù nề, phát triển xương mới và mạch máu rất mạnh [102]

Từ việc phân tích tổng quan ở trên cho thấy:

Trong nước chưa có công bố nào về tổng hợp màng HAp pha tạp Trên thế giới, màng HAp pha tạp đã được nghiên cứu tổng hợp bằng nhiều phương pháp khác nhau, kết quả thử nghiệm in vitro và in vivo cho thấy màng HAp pha tạp một

số nguyên tố như Na, Mg, Sr, F đã làm tăng hoạt tính sinh học, làm giảm độ hòa tan cho màng HAp và có khả năng bảo vệ tốt cho kim loại nền Các nghiên cứu cũng cho thấy với sự có mặt của nguyên tố Cu, Ag, Zn trong màng HAp đã làm tăng khả năng kháng khuẩn từ đó giúp cho việc cấy ghép vật liệu y sinh có phủ màng HAp thành công hơn Tuy nhiên, các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc pha tạp riêng rẽ các nguyên tố mà chưa tiến hành pha tạp đồng thời các nguyên tố vào màng HAp Chính vì vậy, trong luận án này sẽ trình bày chi tiết quá trình tổng hợp màng NaHAp và NaHAp pha tạp riêng rẽ và đồng thời các nguyên tố vi lượng (Mg,

Sr, F) nhằm mục đích tạo màng HAp có thành phần tương tự như xương tự nhiên,

từ đó làm tăng hoạt tính sinh học và tính cơ lý cho màng Ngoài ra, với mục đích tăng khả năng kháng khuẩn cho vật liệu khi cấy ghép vào cơ thể, màng NaHAp được bổ sung các nguyên tố có khả năng kháng khuẩn cao như Cu, Ag, Zn

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Hóa chất và điều kiện thực nghiệm

2.1.1 óa chất

Hóa chất: Ca(NO3)2.4H2O, NH4H2PO4, NaNO3, Mg(NO3)2, Sr(NO3)2, NaF, Cu(NO3)2, Zn(NO3)2, AgNO3, NaCl, NaHCO3, KCl, Na2HPO4.2H2O, MgCl2.6H2O, CaCl2, KH2PO4, MgSO4.7H2O, đường glucozơ C6H12O6, NaOH Các hóa chất này đều là hóa chất tinh khiết của Merk (CHLB Đức)

2.1.2 Vật liệu nền

Mẫu TKG316L với thành phần hóa học: 0,27 % Al; 0,17 % Mn; 0,56 % Si; 17,98 % Cr; 9,34 % Ni; 2,15 % Mo; 0,045 % P; 0,035 % S và 69,45 % Fe có kích thước là 1×10×0,2 cm, được đánh bóng bằng giấy nhám loại 320, 400 của Trung Quốc và đánh lại bằng giấy nhám tinh loại 600, 800 và 1200 của Nhật Bản Sau đó, mẫu được rửa sạch bằng nước cất trong bể rửa siêu âm, tráng lại bằng cồn, rồi để khô ở nhiệt độ phòng và được giới hạn diện tích làm việc 1cm2

cm2, điện cực so sánh calomen bão hoà KCl (SCE) và điện cực làm việc là TKG316L Các thí nghiệm điện hóa được thực hiện trên thiết bị Potentiostat Autolab PGSTAT 30 (Hà Lan) tại Viện Kỹ thuật nhiệt đới - Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam

2.1.3.2 Tổng hợp màng HAp pha tạp natri

Màng NaHAp được tổng hợp bằng phương pháp quét thế catôt trong dung dịch có thành phần và điều kiện tổng hợp như sau:

- Dung dịch tổng hợp:

DNa1: Ca(NO3)2 3.10-2 M + NH4H2PO4 1,8.10-2 M + NaNO3 4.10-2 M

DNa2: Ca(NO3)2 3.10-2 M + NH4H2PO4 1,8.10-2 M + NaNO3 6.10-2 M

DNa3: Ca(NO3)2 3.10-2 M + NH4H2PO4 1,8.10-2 M + NaNO3 8.10-2 M

- Điều kiện tổng hợp khác như: khoảng quét thế: 0 ÷ -1,5; 0 ÷ -1,7; 0 ÷ -1,9

và 0 ÷ -2,1 V/SCE; nhiệt độ: 25; 35; 50; 60 và 70 oC; pH = 4,0; 4,5; 5,0 và 5,5; số lần quét: 1, 3, 5, 7 và 10 lần; tốc độ quét: 3, 4, 5, 6 và 7 mV/s

2.1.3.3 Tổng hợp màng NaHAp pha tạp riêng rẽ magiê, stronti hoặc flo

Màng NaHAp pha tạp nguyên tố Mg, Sr hoặc F được tổng hợp bằng phương pháp quét thế catôt (ký hiệu chung là ĐNaHAp) ở 50 o

C trong 80 mL dung dịch có thành phần ở bảng 2.1 và các điều kiện thay đổi: khoảng quét thế: 0 ÷ -1,5; 0 ÷ -1,7;

0 ÷ -1,9 và 0 ÷ -2,1 V/SCE; số lần quét: 1, 3, 5, 7 và 10 lần; tốc độ quét: 3, 4, 5, 6 và

7 mV/s

Bảng 2.1 Thành phần dung dịch tổng hợp màng ĐNaHAp

2.1.3.4 Tổng hợp màng NaHAp pha tạp đồng thời magiê, stronti và flo

Màng MgSrFNaHAp được tổng hợp bằng phương pháp quét thế catôt ở 50

o

C trong 80 mL dung dịch có thành phần: DNa2 + NaF 2.10-3 M + Sr(NO3)2 5.10-5 M + Mg(NO3)2 1.10-3 M (được ký hiệu là DMgSrFNa) và trong điều kiện thay đổi: khoảng quét thế: 0 ÷ -1,5; 0 ÷ -1,7; 0 ÷ -1,9 và 0 ÷ -2,1 V/SCE; nhiệt độ: 25, 35, 50,

60 và 70 oC; số lần quét: 3, 4, 5, 6, 7 và 10 lần; tốc độ quét: 3, 4, 5, 6 và 7 mV/s

MgNaHAp

DMg1 DNa2+ Mg(NO3)2 1.10-4 M DMg2 DNa2+ Mg(NO3)2 5.10-4 M DMg3 DNa2+ Mg(NO3)2 1.10-3 M DMg4 DNa2+ Mg(NO3)2 5.10-3 M

SrNaHAp

DSr1 DNa2 + Sr(NO3)2 1.10-5 M DSr2 DNa2 + Sr(NO3)2 5.10-5 M DSr3 DNa2 + Sr(NO3)2 1.10-4 M DSr4 DNa2 + Sr(NO3)2 5.10-4 M

FNaHAp

DF1 DNa2 + NaF 5.10-4 M DF2 DNa2 + NaF 1.10-3 M DF3 DNa2 + NaF 2.10-3 M

2.1.4 Pha tạp một số nguyên tố vào màng NaHAp bằng phương pháp trao đổi ion

Chuẩn bị vật liệu: Màng NaHAp tổng hợp trên nền TKG316L bằng phương pháp quét thế catôt ở khoảng quét thế 0 ÷ -1,7 V/SCE; nhiệt độ 50 o

C, 5 lần quét với tốc độ quét 5 mV/s trong dung dịch DNa2

2.1.4.1 Tổng hợp màng NaHAp pha tạp nguyên tố đồng, bạc hoặc kẽm

Tiến hành ngâm vật liệu NaHAp/TKG316L trong 4 mL dung dịch Cu(NO3)2hoặc AgNO3 hoặc Zn(NO3)2 có nồng độ khảo sát được thể hiện ở bảng 2.2 và thời gian được khảo sát: 2,5; 5; 10; 20; 30; 60 và 80 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó vật liệu được lấy ra, rửa sạch bằng nước cất và để khô trong không khí

Bảng 2.2 Nồng độ ban đầu M(NO3)n được khảo sát

2.1.4.2 Tổng hợp màng NaHAp pha tạp nguyên tố đồng, bạc và kẽm

Thực hiện bằng cách ngâm vật liệu NaHAp/TKG316L trong 4 mL dung dịch

có chứa đồng thời Cu(NO3)2 0,02 M + AgNO3 0,001 M + Zn(NO3)2 0,05 M trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó, vật liệu được lấy ra, rửa sạch bằng nước cất và để khô trong không khí

2.1.5 Tổng hợp màng Ap pha tạp 7 nguyên tố magiê, stronti, flo, natri, đồng, bạc và kẽm

- Chuẩn bị vật liệu: màng MgSrFNaHAp tổng hợp trên nền TKG316L bằng phương pháp quét thế catôt tương ứng trong dung dịch DMgSrFNa, ở điều kiện: khoảng quét thế 0 ÷ -1,7 V/SCE; nhiệt độ 50 oC, 5 lần quét với tốc độ quét 5 mV/s

- Màng HAp với sự có mặt đồng thời tất cả các nguyên tố magiê, stronti, flo, natri, đồng, bạc kẽm (HApđt) được tổng hợp trên nền TKG316L bằng cách ngâm vật liệu TKG316L có phủ màng MgSrFNaHAp trong 4 mL dung dịch có chứa đồng thời Cu(NO3)2 0,02 M + AgNO3 0,001 M + Zn(NO3)2 0,05 M trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó vật liệu được lấy ra, rửa sạch bằng nước cất và để khô trong không khí

2.2 Các phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Các phương pháp điện hóa

Giá trị điện lượng của quá trình tổng hợp được xác định bằng cách lấy tích phân từ điểm đầu đến điểm cuối của toàn bộ quá trình trên đường cong phân cực

Các phép đo điện trở phân cực Tafel được thực hiện trong khoảng điện thế ± 0,5

V xung quanh điện thế mạch hở E0 trong dung dịch SBF với tốc độ quét 1 mV/s Từ

đó, xác định giá trị điện thế ăn mòn, mật độ dòng ăn mòn theo phương pháp ngoại suy Tafel và hiệu quả bảo vệ cho nền của màng HAp pha tạp theo công thức:

(%) 100

ln ,

ln ,

v corr

corr v corr i

i i



Trong đó: h là hiệu quả bảo vệ (%), icorr, vln và icorr lần lượt là mật độ dòng ăn mòn của vật liệu TKG316L không phủ và có phủ màng HAp pha tạp

2.2.1.2 Đo điện thế mạch hở theo thời gian

Phương pháp này cho phép theo dõi sự biến thiên của điện thế mạch hở theo thời gian của vật liệu TKG316L không và có phủ HAp pha tạp khi ngâm trong dung dịch SBF Các giá trị điện thế mạch hở thu được cho phép xác định một cách định tính vật liệu đang ở trạng thái ăn mòn hay được bảo vệ

2.2.1.2 Tổng trở điện hóa

Trong luận án các phép đo tổng trở điện hóa được thực hiện trong dải tần số

từ 100 kHz đến 10 mHz với biên độ thế ± 10 mV tại điện thế mạch hở Tổng trở điện hóa theo thời gian ngâm vật liệu TKG316L có và không phủ HAp hoặc HAp

pha tạp trong dung dịch SBF cho phép đưa ra sự biến thiên các thông số modun tổng trở Z, qua đó đánh giá được diễn biến ăn mòn của vật liệu và khả năng hình thành màng apatit trong dung dịch mô phỏng dịch thể người

2.2.2 Phương pháp trao đổi ion

Phương pháp trao đổi ion được thực hiện bằng cách ngâm vật liệu màng NaHAp và MgSrFNaHAp trên nền TKG316L trong dung dịch có chứa ion Mn+

cần trao đổi và trong khoảng thời gian xác định Phần dung dịch thu được sau khi ngâm được dùng để xác định nồng độ ion Mn+

còn lại bằng phương pháp hấp thụ nguyên

tử (AAS), từ đó xác định dung lượng trao đổi ion theo công thức:

1000

0 V m

C C

(2.1) Trong đó, q là dung lượng trao đổi ion (mmol/g), Co là nồng độ ban đầu của

Mn+ (mol/L), C là nồng độ Mn+ còn lại sau khi ngâm (mol/L), V là thể tích dung dịch (L), m là khối lượng màng NaHAp hoặc MgSrFNaHAp (g)

Dựa vào giá trị dung lượng trao đổi ion xác định số ion Mn+ trao đổi với ion

Ca2+ và từ đó xác định công thức phân tử của MNaHAp dựa vào công thức phân tử của NaHAp: Ca9,278-xMxNa0,722(PO4)6(OH)2 với x = q.MNaHAp.103 (MNaHAp: khối lượng phân tử của NaHAp)

2.2.3 Các phương pháp xác định thành phần và cấu trúc

2.2.3.1 Phổ hồng ngoại

Phổ hồng ngoại dùng để xác định cấu trúc phân tử của chất nghiên cứu dựa vào số sóng đặc trưng của các nhóm chức trên phổ Bột HAp pha tạp thu được bằng cách cạo từ màng HAp pha tạp trên nền TKG316L, được tiến hành đo phổ IR trên máy FT-IR Nicolet 6700 tại Viện Kỹ thuật nhiệt đới hoặc máy FT-IR Nicolet 5700 tại Trung tâm CIRIMAT - Trường Đại học Toulouse - Pháp với kỹ thuật ép viên KBr trong khoảng số sóng 4000 - 400 cm-1, độ phân giải 8 cm-1 và 64 lần quét

2.2.3.2 Nhiễu xạ tia X

Giản đồ nhiễu xạ tia X dùng để xác định thành phần pha của màng HAp pha tạp tổng hợp được trên nền TKG316L Mẫu HAp pha tạp trên nền TKG316L được ghi giản đồ XRD trên máy SIEMENDS D5005 Bruker-Germany tại viện Khoa học

vật liệu hoặc tại trường Đại học KHTN-ĐHQG Hà Nội và máy SIEMENDS D8

Bruker-Germany tại Trung tâm CIRIMAT - Trường Đại học Toulouse - Pháp với

các điều kiện: bức xạ Cu-Kα, bước sóng λ = 1,54056 Å, cường độ dòng điện 30

mA, điện áp 40 kV, góc quét 2 trong khoảng 10o 70o, tốc độ quét 0,030 o/giây

Từ giản đồ XRD có thể tính được đường kính trung bình của tinh thể HAp theo

công thức Scherrer [103]:



 cos B.

9 , 0



Trong đó: D – kích thước tinh thể (nm),  - bước sóng (nm); ở đây  =

0,15406 nm, B (rad): độ rộng của pic tại nửa chiều cao của pic đặc trưng, B (rad)

được tính từ B (o) theo công thức sau: B (rad) = B (o) × /180;  - góc nhiễu xạ (o) HAp có mạng tinh thể hệ lục giác với a = b # c, α = β = 90o, γ = 120o

Từ giản đồ XRD xác định được giá trị khoảng cách giữa các mặt phẳng tinh thể (d), từ đó xác

định được giá trị hằng số mạng a, b, c theo công thức 2.5 [104]

2.2.3.3 Hiển vi điện tử quét

Phương pháp hiển vi điện tử quét được sử dụng để xác định hình thái học bề

mặt của màng HAp pha tạp và màng apatit được hình thành trong dung dịch SBF,

được đo trên thiết bị kính hiển vi điện tử quét Hitachi S4800 của Nhật Bản tại Viện

Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Do màng HAp không dẫn điện nên trước khi phân tích

màng HAp pha tạp được phủ Pt trong chân không để tăng độ nét của hình ảnh SEM

2.2.3.4 Hiển vi lực nguyên tử

Độ gồ ghề bề mặt của vật liệu TKG316L có và không phủ HAp pha tạp được

xác định bằng phương pháp hiển vi lực nguyên tử trên thiết bị của Trung tâm

CIRIMAT - Trường Đại học Toulouse – Pháp

2.2.3.5 Tán xạ năng lượng tia X

Thành phần màng HAp pha tạp được xác định bằng phổ EDX Bột HAp pha tạp

thu được bằng cách cạo từ màng HAp pha tạp trên nền TKG316L được tiến hành đo

phổ EDX trên thiết bị JEOL 6490-JED 2300 của Nhật Bản tại Trung tâm đánh giá hư

hỏng vật liệu - Viện Khoa học Vật liệu hoặc thiết bị SEM-JSM-6510LV tại Viện Kỹ thuật nhiệt đới

2.2.3.6 Quang phổ hấp thụ nguyên tử

Hàm lượng nguyên tố Ca, Na và các nguyên tố vi lượng (Mg, Cu, Ag, Zn) có mặt trong màng HAp pha tạp Bột HAp pha tạp thu được bằng cách lấy bột được cạo

từ màng HAp pha tạp trên nền TKG316L hòa tan trong dung dịch HNO3 1 M Sau

đó, lấy dung dịch thu được để xác định hàm lượng ion Ca2+ và các ion cần pha tạp bằng phương pháp AAS trên máy Perkin - Elmer 3300 tại viện Hóa học hoặc máy ANALYTIK JENA tại Trung tâm CIRIMAT - Trường Đại học Toulouse - Pháp

2.2.3.7 Phổ khối lượng plasma cảm ứng

Nguyên tố vi lượng Sr có mặt trong màng HAp pha tạp với hàm lượng bé được xác định bằng phương pháp ICP-MS trên máy ELAN 9000 tại phòng phân tích chất lượng môi trường của Viện Công nghệ Môi trường

Bột HAp pha tạp thu được bằng cách cạo từ màng HAp pha tạp trên nền TKG316L được hòa tan trong dung dịch HNO3 1 M Sau đó, lấy dung dịch thu được

2.2.4 Các phương pháp xác định tính chất cơ lý

2.2.4.1 Xác định khối lượng màng HAp

Khối lượng của màng HAp pha tạp được xác định bằng cách cân khối lượng mẫu TKG316L trước và sau khi tổng hợp bằng cân phân tích Precisa (XR-205SM

PR, Thụy Sĩ) với sai số ± 0,01 mg Kết quả thu được là giá trị trung bình của 3 mẫu

đo

2.2.4.2 Xác định độ bám dính

Độ bám dính của màng HAp pha tạp với nền TKG316L được xác định bằng phương pháp kéo giật theo tiêu chuẩn ASTM D4541 sử dụng thiết bị Positest ATA [1] Kết quả thu được là giá trị trung bình của 3 lần đo

2.2.4.3 Xác định chiều dày màng

Chiều dày màng HAp pha tạp được xác định bằng phương pháp Stylus theo tiêu chuẩn ISO 4288-1998 trên hệ Alpha-Step IQ (KLA-Tencor - USA) tại Viện Khoa học Vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Thiết bị đo Anpha – Step IQ đo biến dạng bề mặt dựa vào kết quả quét của kim dò trên bề mặt mẫu theo một đường thẳng, có thể phát hiện sự khác biệt trên bề mặt mẫu từ 80 Ǻ đến 2 mm với độ chính xác cao

2.2.4.4 Xác định nồng độ Ca 2+ hòa tan

Vật liệu TKG316L có phủ màng NaHAp và MgSrFNaHAp tổng hợp ở điều kiện 50 oC, 5 vòng, quét thế từ 0 đến -1,7 V/SCE, 5 mV/s được ngâm trong dung dịch muối sinh lý NaCl 0,9 % trong 16 ngày Dung dịch sau khi ngâm được xác định nồng độ ion Ca2+

hòa tan từ màng bằng phương pháp hấp phụ nguyên tử AAS

2.2.4.5 Xác định tổng nồng độ sắt hòa tan

Để đánh giá khả năng che chắn cho nền TKG316L của màng NaHAp và MgZnFNaHAp, vật liệu TKG316L không phủ và có phủ màng NaHAp hoặc màng MgZnFNaHAp được ngâm trong dung dịch SBF trong 28 ngày Dung dịch sau khi ngâm được xác định tổng nồng độ Fe hòa tan từ nền TKG316L vào dung dịch theo thời gian ngâm mẫu bằng phương pháp AAS

2.2.5 Phương pháp thử nghiệm in vitro và in vivo

2.2.5.1 Thử nghiệm trong dung dịch mô phỏng dịch cơ thể người

Dung dịch mô phỏng dịch cơ thể người (SBF) được pha từ các hóa chất tinh khiết với hàm lượng được chỉ ra trên bảng 2.3 [103] Sau khi pha, dung dịch thu được trong suốt, không có kết tủa hay vẩn đục, có pH = 7,3 và được bảo quản ở nhiệt độ phòng [105-107]

2.2.5.2 Thử nghiệm tế bào

Trong phần này chúng tôi tiến hành nghiên cứu tính an toàn và tương thích sinh học của bột NaHAp và MgSrFNaHAp trên dong tế bào sợi bằng các phương pháp Trypan Blue và MTT Tế bào sợi được cung cấp từ phòng thử nghiệm tế bào của Viện bỏng Quốc gia, đây là tế bào tham gia vào các đáp ứng liền vết thương nên được lựa chọn để thử nghiệm

* Thử nghiệm Trypan Blue

Sử dụng 100 µL dung dịch chứa tế bào sợi với mật độ tế bào đạt 106 tế bào/mL cho vào từng giếng trên các đĩa nuôi cấy lần lượt chứa bột NaHAp hoặc bột MgSrFNaHAp với nồng độ lần lượt: 0,1; 0,2; 0,3 %; và ống đối chứng (không chứa bột NaHAp và MgSrFNaHAp) Các đĩa nuôi cấy được cho vào tủ ấm CO2 ủ trong vòng 1 giờ, sau đó bổ sung 100 µL dung dịch Trypan Blue 0,4 % đã được lọc qua màng lọc 0,45 µm vào từng giếng chứa tế bào trên Hút tế bào trong từng giếng cho vào buồng đếm Neubauer để đếm số lượng tế bào chết và tổng số tế bào có trong buồng đếm có thể tích 1 mm3 Tế bào chết sẽ bắt màu xanh đặc trưng của Trypan Blue, tế bào sống không bắt màu

* Thử nghiệm MTT

Tế bào sợi được đưa vào đĩa nuôi cấy 96 giếng với mật độ 2.103 tế bào/giếng Sau 24 giờ nuôi cấy, các tế bào bám dính vào đáy các giếng nuôi, hút bỏ môi trường nuôi cấy cũ thay bằng 200 µL môi trường nuôi cấy mới có chứa bột NaHAp hoặc MgSrFNaHAp nồng độ 0,3 % Tế bào trong các giếng nuôi cấy được cảm ứng với các mẫu nghiên cứu theo thời gian: 24, 48 và 72 giờ Tại mỗi thời điểm, môi trường nuôi cấy tế bào trong các giếng nuôi cấy được loại bỏ hoàn toàn,

và được thay bằng 90 µL môi trường nuôi cấy tương ứng và bổ sung thêm 10 µL dung dịch MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide), rồi được đặt trong tủ nuôi cấy tế bào trong 4 giờ để các tế bào chuyển hóa chất MTT màu vàng tạo thành các tinh thể màu tím nhờ hoạt động của ty thể

Sau đó, toàn bộ môi trường nuôi cấy được loại bỏ và cho thêm 100 µL dung dịch hòa tan tinh thể MTT Đĩa nuôi tế bào được cho vào máy lắc với tần số 20 chu kỳ/phút trong 10 phút để hòa tan các tinh thể và được đo mật độ quang ở bước sóng

570 nm trong máy Beckman counter DTX 880

2.2.5.3 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn

Khả năng kháng khuẩn của NaHAp, MNaHAp, MgSrFNaHAp và HApđt được thử nghiệm bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch Trước hết, ép bột HAp pha tạp thành các viên có chiều dày 1 mm và đường kính 10 mm, sau đó được hấp khử trùng ở 120 oC trong 30 phút

Chủng vi khuẩn được sử dụng để thử nghiệm gồm 3 chủng khuẩn: E.faecalis ATCC-29212, E.coli ATCC-25922™* và P.aerugimosa Chủng khuẩn

P.aerugimosa được phân lập từ da bệnh nhân tại Viện bỏng Quốc gia Các vi sinh vật

được nuôi cấy từ ống chủng gốc, trên môi trường LB đặc (bao gồm: peptone 10 g/L + vitamin và các nguyên tố vi lượng được chiết xuất từ nấm men 5 g/L + muối NaCl 10g/L) tại 37 oC, ủ qua đêm

Kỹ thuật khuếch tán được thực hiện bằng cách đổ thạch vào các đĩa Petri để tạo thành lớp dày 4 mm và cấy dày đặc của các vi sinh vật thử nghiệm Các mẫu HAp pha tạp được bố trí trên bề mặt thạch và ủ trong 24 giờ ở 37 oC

Hoạt tính ức chế khuẩn được đánh giá bằng cách đo bán kính vòng ức chế vi sinh vật (BK) bằng công thức: BK (mm) = VK - LK; trong đó VK: đường kính vòng vô

khuẩn và LK: đường kính lỗ khoan thạch Thí nghiệm được lặp lại ba lần và lấy giá trị bán kính trung bình

2.2.5.4 Thử nghiệm in vivo

* Phương pháp phẫu thuật đưa vật liệu vào dưới da vùng đùi trước

Chó khỏe mạnh được chia thành 3 nhóm, mỗi nhóm 6 con, được cấy 3 loại vật liệu: TKG316L (nhóm đối chứng), NaHAp/TKG316L (nhóm NaHAp) và MgSrFNaHAp/TKG316L (nhóm MgSrFNaHAp) Các vật liệu cấy ghép có kích thước 1×1×2 mm (rộng×cao×dài), được hấp vô khuẩn trước khi tiến hành phẫu thuật (hình 2.1) Đánh giá sự tương thích của vật liệu bằng phương pháp: quan sát tình trạng tại chỗ vết mổ, các chỉ số huyết học và sinh hóa, hình ảnh đại thể và vi thể ở vị trí cấy ghép

nh 2.1 Phẫu thuật đưa vật liệu vào tổ chức dưới da đùi trước của chó

* Phương pháp phẫu thuật đưa nẹp vít vào vùng xương đùi chó

Chó khỏe mạnh được chia thành 3 nhóm, mỗi nhóm 8 con Được ghép 3 loại vật liệu gồm: TKG316L (nhóm đối chứng), NaHAp/TKG316L (nhóm NaHAp) và MgSrFNaHAp/TKG316L (nhóm MgSrFNaHAp) Các vật liệu cấy ghép có kích thước 5×1×30 mm, được hấp vô khuẩn trước khi tiến hành phẫu thuật (hình 2.2) Đánh giá tính tương thích của vật liệu bằng phương pháp: quan sát tình trạng tại chỗ vết mổ, các chỉ số huyết học và sinh hóa, hình ảnh đại thể và vi thể ở vị trí cấy ghép

nh 2.2 Phẫu thuật đưa nẹp vít vào xương đùi chó

* Phương pháp lấy máu xét nghiệm

Máu tĩnh mạch được lấy vào thời điểm lúc 8 giờ sáng (trước khi ăn sáng) bằng sử dụng bơm tiêm 5 ml và ống nghiệm đựng máu xét nghiệm (được chống đông bằng EDTA) Máu xét nghiệm được lấy từ tĩnh mạch hiển, dùng kim tiêm (22G), lấy khoảng 4 ml máu/1 động vật Máu sau khi lấy sẽ được xác định thành phần các tế bào máu (chỉ số hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu), chức năng gan (định lượng GOT và GPT) và chức năng thận (định lượng ure và creatinin)

nh 2.3 Lấy máu làm xét nghiệm trên chó

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tổng hợp và đặc trưng của màng HAp pha tạp

3.1.1 Tổng hợp màng Ap pha tạp bằng phương pháp điện hóa

3.1.1.1 Màng HAp pha tạp natri

a Đường cong phân cực catôt

Hình 3.1 giới thiệu đường cong phân cực catôt của điện cực TKG316L trong

dung dịch DNa2, trong khoảng thế từ 0 ÷ -2,1 V/SCE với tốc độ quét thế 5 mV/s và

nhiệt độ 50 oC Từ hình dạng đường cong phân cực cho thấy:

- Khoảng điện thế 0 ÷ -0,7 V/SCE: mật độ dòng điện gần như không đổi và

xấp xỉ 0 vì không có phản ứng khử nào xảy ra

- Khoảng thế -0,7 ÷ -1,2 V/SCE: mật độ dòng tăng nhẹ tương ứng với quá

trình khử H+, khử O2 hoà tan trong nước theo phản ứng 3.1 và 3.2 [35, 61]

2H+ + 2e-  H2

(3.1)

O2 + 2H2O + 4e- 4OH- (3.2)

- Khoảng điện thế âm hơn -1,2 V/SCE: mật độ dòng điện tăng mạnh theo sự

tăng điện thế, ở giai đoạn này xảy ra phản ứng khử ion H2PO4-, khử NO3- và khử

4

HPO  + OH- 3

4

PO  + H2O (3.9) 10(Ca2+, Na+) + 6PO34 + 2OH− → (Ca, Na)10(PO4)6(OH)2 (3.10)

-2.2 -2.0 -1.8 -1.6 -1.4 -1.2 -1.0 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 -6.0

-5.5 -5.0 -4.5 -4.0 -3.5 -3.0 -2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0

b Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch

Kết quả phân tích thành phần các nguyên tố Ca, P và Na có trong màng NaHAp tổng hợp trong các dung dịch có nồng độ NaNO3 khác nhau DNa1, DNa2

và DNa3 bằng phương pháp AAS và UV-VIS được chỉ ra trong bảng 3.1 Với 3 nồng độ NaNO3 khác nhau, tỉ lệ nguyên tử (Ca + 0,5 Na)/P nằm trong khoảng 1,58

÷ 1,63, tỉ lệ này gần giống với tỉ lệ của Ca/P trong xương (1,67) Từ bảng 3.1 cũng cho thấy, tỉ lệ nguyên tử Na/Ca tăng với sự tăng nồng độ NaNO3

Bảng 3.1 Kết quả AAS của NaHAp tổng hợp khi thay đổi nồng độ NaNO3

DNa1 17,25 36,09 0,32 0,0155 1,63 Ca9,850Na0,150(PO4)6(OH)2DNa2 16,80 33,20 1,50 0,0785 1,61 Ca9,278Na0,722(PO4)6(OH)2DNa3 16,60 33,09 2,20 0,1156 1,58 Ca8,928Na1,072(PO4)6(OH)2

Tuy nhiên, để đáp ứng được yêu cầu màng thu được có tỉ lệ Na/Ca tương tự như trong xương tự nhiên (≤ 0,102 [108, 109]) thì dung dịch DNa1 và DNa2 thích hợp, còn dung dịch DNa3 có tỉ lệ Na/Ca vượt quá thành phần trong xương tự nhiên Ngoài ra, dựa vào vai trò của NaNO3: làm tăng độ dẫn và tạo ion OH-

(từ phản ứng khử ion NO3-), một tác nhân quan trọng để tạo màng HAp, nên nồng độ NaNO3càng lớn thì càng thuận lợi cho quá trình tạo màng HAp Do đó, dung dịch điện li

DNa2 được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo Màng NaHAp thu được trong điều kiện này có công thức phân tử tương ứng là Ca9,278Na0,722(PO4)6(OH)2

Màng NaHAp tổng hợp trong dung dịch DNa2 được xác định thành phần pha bằng nhiễu xạ tia X (hình 3.2) Từ giản đồ XRD cho thấy xuất hiện các pic đặc trưng cho tinh thể HAp và cho nền TKG316L mà không thấy sự có mặt của các pha khác (hình 3.2a) Hai pic nhiễu xạ đặc trưng cơ bản nhất của HAp ở vị trí góc nhiễu

xạ 2  32 o tương ứng với mặt tinh thể có chỉ số Miller (211) và ở vị trí 2  26 o tươngứng với mặt tinh thể có chỉ số Miller (002) [35, 59, 104] Ngoài ra, còn có các pic đặc trưng khác với cường độ nhỏ hơn ở vị trí 2 33, 46, 54 o tương ứng với các mặt (300), (222) và (004) [35, 59, 104] Bên cạnh đó các pic đặc trưng cho nền TKG316L vị trí 2  45 o (của Fe) và 2  44 và 51 o (của hỗn hợp ôxit CrO.19FeO.7NiO) [35, 69] Như vậy, màng NaHAp tổng hợp được có dạng tinh thể

và đơn pha của HAp

1

1 1 1 1 1

1 1

Từ giản đồ nhiễu xạ tia X tính được đường kính tinh thể NaHAp khoảng 106

nm theo công thức Scherrer (phương trình 1) và giá trị khoảng cách giữa các mặt phẳng tinh thể (d) tại mặt phẳng (002) và (211) thể hiện trên bảng 3.2 So sánh mẫu NaHAp tổng hợp được theo tiêu chuẩn NIST [104] cho thấy các giá trị khoảng cách

d giữa các mặt phẳng và các giá trị hằng số mạng a, b, c giảm Nguyên nhân do bán kính ion Na+ (0,95Ǻ) nhỏ hơn bán kính của Ca2+ (0,99Ǻ) [110] nên khi thay thế

Ca2+ bằng Na+ trong cấu trúc của HAp dẫn đến đường kính tinh thể NaHAp nhỏ hơn

HAp (NIST) Kết quả này cũng được thể hiện trên giản đồ XRD tại vị trí 2θ ≈ 26 o, pic của mẫu NaHAp tổng hợp được đã lệch đi so với HAp (NIST) khoảng +0,44 o(hình 3.2 b)

Bảng 3.2 Giá trị khoảng cách giữa các mặt phẳng tinh thể và các hằng số

mạng của màng NaHAp so với HAp [104]

4

PO [1, 75]; Pic hấp thụ ở vị trí 3441 và 1641 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị và dao động biến dạng của nhóm OH- [35] Ngoài ra, còn có pic đặc trưng của nhóm 2

c Ảnh hưởng của khoảng quét thế

Sự biến đổi điện lượng trong quá trình tổng hợp, khối lượng, độ bám dính và chiều dày của màng khi thay đổi khoảng quét thế được thể hiện ở bảng 3.3 Điện lượng của quá trình tổng hợp tăng khi mở rộng khoảng quét thế Theo định luật Faraday, điện lượng tổng hợp tăng, sinh ra nhiều ion OH-, 3

4

PO dẫn đến khối lượng NaHAp thu được tăng Tuy nhiên, khối lượng màng NaHAp thu được trên nền TKG316L chỉ tăng và đạt giá trị cực đại 2,45 mg/cm2 tương ứng với chiều dày màng 7,8 µm khi điện lượng tăng đến 3,23 C tương ứng khoảng quét thế mở rộng đến -1,7 V/SCE Nếu tiếp tục mở rộng khoảng quét thế, tương ứng điện lượng tổng hợp tăng nhưng khối lượng và chiều dày màng thu được trên bề mặt TKG316L giảm Hiện tượng này được giải thích: khoảng quét thế rộng về phía catôt, điện lượng của quá trình tổng hợp tăng dẫn đến sự hình thành các ion OH-

, 3 4

PO nhiều trên bề mặt điện cực, khuếch tán vào trong lòng dung dịch và kết hợp với Na+

, Ca2+tạo thành NaHAp ngay trong lòng dung dịch mà không bám lên nền TKG316L

Bảng 3.3 Sự biến đổi điện lượng, khối lượng, độ bám dính và chiều dày của

màng NaHAp tổng hợp trong dung dịch DNa2 ở khoảng quét thế khác nhau

Khoảng thế

(V/SCE)

Điện lƣợng Q (C)

Khối lƣợng

(mg/cm 2 )

Chiều dày (µm)

Độ bám dính (MPa)

Từ kết quả phân tích, để thu được màng NaHAp có chiều dày lớn và độ bám dính cao, khoảng quét thế 0 ÷ -1,7 V/SCE là phù hợp và được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo

d Ảnh hưởng của nhiệt độ

Hình ảnh SEM của màng NaHAp tổng hợp trong dung dịch DNa2 ở các nhiệt

độ khác nhau được chỉ ra trên hình 3.4 Kết quả cho thấy nhiệt độ tổng hợp có ảnh hưởng lớn đến hình dạng cũng như kích thước của NaHAp Ở nhiệt độ phản ứng 25

và 35 oC, màng NaHAp thu được ở dạng que và phiến nhỏ (hình 3.4 a, b) Khi nhiệt

độ tăng lên 50 oC, màng NaHAp có dạng tấm với kích thước lớn hơn và đồng đều (hình 3.4c) Ở 60 oC các tinh thể màng NaHAp thu được ở dạng phiến và xốp (hình 3.4d)

nh 3.4 Hình ảnh SEM của màng NaHAp tổng hợp trong dung dịch DNa2,

ở nhiệt độ: 25 oC (a), 35 oC (b), 50 oC (c), 60 oC(d) Các kết quả phân tích XRD cũng cho thấy nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến thành phần pha của màng (hình 3.5) Với màng tổng hợp 25 và 35 oC, thành phần chính của màng là đicanxi photphat đihyđrat (DCPD, CaHPO4.2H2O) với góc nhiễu