Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử cafein định hướng ứng dụng làm pha tĩnh trong kỹ thuật chiết pha rắn tách cafein có tính chọn lọc cao

Tp Hồ Chí Minh, 03/2019 Chủ nhiệm đề tài: TS Phan Văn Hồ Nam Mã số: PHA RẮN TÁCH CAFEIN CĨ TÍNH CHỌN LỌC CAO HƯỚNG ỨNG DỤNG LÀM PHA TĨNH TRONG KỸ THUẬT CHIẾT TỔNG HỢP POLYMER ĐÓNG DẤU PHÂN TỬ CAFEIN ĐỊNH ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BỘ Y TẾ BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG TỔNG HỢP POLYMER ĐĨNG DẤU PHÂN TỬ CAFEIN ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG LÀM PHA TĨNH TRONG KỸ THUẬT CHIẾT Mã số: Tp Hồ Chí Minh, 03/2019 Phan Văn Hồ Nam (ký, họ tên) Chủ nhiệm đề tài PHA RẮN TÁCH CAFEIN CĨ TÍNH CHỌN LỌC CAO DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Chủ nhiệm đề tài: TS Phan Văn Hồ Nam Thành viên tham gia đề tài: Nguyễn Như Quỳnh Đơn vị thực hiện: Bộ mơn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm, khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM i MỤC LỤC DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii DANH MỤC SƠ ĐỒ viii MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT MỤC TIÊU ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU – HÓA CHẤT – TRANG THIẾT BỊ Đối tượng nghiên cứu Dung mơi-hóa chất Trang thiết bị PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Tổng hợp polymer Khảo sát đồng tan hỗn hợp thành phần tổng hợp polymer Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình tổng hợp polymer Tổng hợp MIP Tổng hợp NIP Tạo màng polymer lam kính Tạo hạt i Quy trình tạo hạt polymer Khảo sát kích thước hạt Kiểm tra khả lưu giữ thuận nghịch cafein polymer Kiểm tra lưu giữ cafein polymer màng mỏng lam kính sử dụng phương pháp quang phổ UV-Vis Kiểm tra lưu giữ cafein polymer dạng hạt sử dụng phương pháp quang phổ UV-Vis Kiểm tra lưu giữ cafein polymer dạng hạt sử dụng phương pháp HPLC7 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 11 CHƯƠNG TỔNG HỢP POLYMER 11 1.1 Khảo sát đồng tan hỗn hợp thành phần tổng hợp polymer 11 1.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình tổng hợp polymer 11 1.2.1 Khảo sát trình tổng hợp NIP .11 1.2.2 Khảo sát trình tổng hợp MIP 13 1.3 Tạo màng polymer lam kính 15 1.4 Khảo sát kích thước hạt 15 CHƯƠNG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LƯU GIỮ THUẬN NGHỊCH CAFEIN CỦA POLYMER 20 2.1 Kiểm tra lưu giữ cafein polymer màng mỏng lam kính sử dụng phương pháp quang phổ UV-Vis 20 2.2 Kiểm tra lưu giữ cafein polymer dạng hạt sử dụng phương pháp quang phổ UV-Vis 20 2.3 Kiểm tra lưu giữ cafein polymer dạng hạt sử dụng phương pháp HPLC 24 2.3.1 Kiểm tra tính đặc hiệu qui trình định lượng cafein: 24 2.3.2 Kiểm tra tính tương thích hệ thống qui trình định lượng cafein .26 2.3.3 Kiểm tra tính tuyến tính qui trình định lượng cafein 26 2.3.4 Khảo sát hàm lượng cafein dịch rửa giải MIP/NIP: 28 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 30 KẾT LUẬN 30 ĐỀ NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 AIBN EDMA 4-VP MAA MIT NIP MIP High performance liquid chromatography Azobisisobutyronitril Ethylen glycol dimethacrylat 4-vinylpyridine Metacrylic acid Molecular Imprinted Technology Non Imprinted Polymer Molecular Imprinted Polymer Từ tiếng Anh Thời gian lưu Sắc kí lỏng hiệu cao Kĩ thuật đóng dấu phân tử Polyme khơng đóng dấu phân tử Polyme đóng dấu phân tử Ý nghĩa tiếng Việt DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT HPLC Retention time Diện tích đỉnh STT Chữ tắt tR Peak Area Hệ số bất đối S Asymmetry factor Số đĩa lý thuyết Tử ngoại-khả kiến Af Theoretical Plates Độ lệch chuẩn UV-Vis Ultra Violet-Visible N Standard Deviation Trung bình SD TB i DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Công thức thành phần tổng hợp polymer Bảng Công thức thành phần tổng hợp polymer Bảng Khảo sát đồng tan thành phần tổng hợp polymer 11 Bảng Thể chất polymer trước đông thành khối cứng màu sắc polymer 12 Bảng Cảm quan polymer có tỷ lệ crosslinker:monomer khác .13 Bảng Thời gian tổng hợp polymer ảnh hưởng hàm lượng tác nhân mồi 14 Bảng Thời gian tổng hợp polymer ảnh hưởng hàm lượng VP 14 Bảng Hình dạng hạt kính hiển vi 16 Bảng Khảo sát kích thước hạt polymer tạo thành với dung mooi kết tủa khác 18 Bảng 10 Kiểm tra lưu giữ cafein polymer dạng hạt sử dụng phương pháp quang phổ UV-Vis (kết trình bày theo MIP/NIP công thức tương ứng) 21 Bảng 11 Tính tương thích hệ thống phương pháp HPLC mẫu chuẩn cafein 26 Bảng 12 Tương quan nồng độ diện tích đỉnh cafein 27 Bảng 13 Hàm lượng cafein (mg) dịch rửa giải MIP/NIP giai đoạn khác với lượng cafein thêm vào giai đoạn mg 28 DANH MỤC CÁC HÌNH i Hình Q trình tổng hợp MIP[2] Hình Phổ UV dịch tạo hạt MIP - NIP 22 Hình Phổ UV dịch rửa giải cafein MIP-NIP sau lần rửa n-butanol 22 Hình Phổ UV dịch rửa giải cafein MIP-NIP iso propanol 22 Hình Phổ UV dịch rửa giải cafein MIP-NIP methanol-acid (9:1) lần 22 Hình Phổ UV dịch rửa giải cafein MIP-NIP methanol-acid (9:1) lần 23 Hình Phổ UV MIP chưa polyme hóa methanol-acid (9:1) thêm cafein chuẩn .23 Hình Sắc ký đồ mẫu chuẩn 24 Hình Sắc ký đồ mẫu thử (có cafein) 24 Hình 10 Sắc kí đồ mẫu thử khơng có cafein 25 Hình 11 Phổ UV thời điểm khác đỉnh cafein mẫu trắng, chuẩn, thử có cafein, thử khơng có cafein 25 Hình 12 Đường biểu diễn tính tuyến tính cafein định lượng HPLC 27 DANH MỤC SƠ ĐỒ ii Sơ đồ Qui trình kiểm tra khả lưu giữ thuận nghịch cafein polymer Sơ đồ Qui trình rửa giải hạt polymer Hạt Kích thước MIP hạt (nm) MIP Mảnh NIP 600 Hình dạng hạt NIP trịn MIP MIP ++++ 500 Rời, đều, trịn 400- 500600 Dính, đều, K đều, dính 500- 500- Dính, đều, trịn Rời, đều, trịn 500- 500- Rời, đều, gần tròn 600 gần tròn 600 600 Rời, đều, tròn 800 500 500 600 đám,đều,tròn đều, tròn đều, trịn đều, trịn Đám lớn, gần trịn khơng đều, ngắn, hoặc dây Đám nhỏ tròn đều, gần Đám TB, đều, tròn Đám nhỏ, tròn 800 đều, tròn hoặc đám, Dây ngắn trịn Dính, đều, 700 500- 500- Dính, đều, 700 600 500- 400- 600 500- 500- Đám TB, k 600 500- 400- Đám TB, 700 600- 400- Dây dài hoặc 700 tròn 600- 600- Rời, đều, 600 600 tròn NIP NIP +++ ++++ Đều, gần + ++ ++ 500- 500- Đều, gần ++ + +++ tròn, rời MeOH +++ ++ ++ tròn, rời EtOH ++ + 600 Isopropanol Nhiều mảnh vỡ, không tạo hạt ++++ +++ ++ Rời, đều, n-Butanol +++ ++++ ++++ 400- 400- Dính, đều, ACN ++ + 500 Aceton + + +++ ++ +++ +++ +++ Dietyl ete ++ +++ ++ +++ ++++ ++ ++ +++ ++ ++ +++ ++ +++ ++ +++ EtOH MeOH Etyl acetat Dung mơi Bảng Khảo sát kích thước hạt polymer tạo thành với dung mooi kết tủa khác Tỉ lệ 1:50 1:100 Isopropanol n-Butanol + ++ + + 19 + ++++ ++++ ++++ +++ ++++ ++++ + Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh ACN Aceton Dietyl ete +++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ ++ ++ ++++ +++ ++ MeOH ++ ++ ++ EtOH + ++++ ++ Etyl acetat Isopropanol +++ ++ +++ +++ +++ + n-Butanol ACN(mật + +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++++ +++ ++ ++ ++ 1:200 độ polymer thấp) Aceton Dietyl ete Etyl acetat (rất mẫu) 500 đều, gần tròn 400- 400- Đám lớn, 500 600 Đám lớn,đều, gần tròn Rời hay đám đều, tròn đám TB, Rời hoặc tròn đám nhỏ, k Rời hay đều, tròn đám nhỏ, Rời hoặc tròn Rời, đều, nhỏ, đều, đều, tròn Rời, k đều, gần tròn 500- 500- Rời, đều, 600 500 400- 400500 600 400- 400500 500- 600- Rời, đều, tròn tròn 600 Rời, đều, 700 500- 400- Rời, đều, tròn tròn 600 Rời, k đều, 500 400- 400- Rời, k đều, gần trịn trịn 500 Dính, k 600 400- 500- Dính, đều, trịn trịn đều, trịn 600 trịn Rời hay 600 Rời hay đám đám nhỏ, Rời, đều, 600 TB, k đều, TB,đều, gần Rời hay đám đều, tròn đám TB, k Rời hay Rời, tròn, gần tròn 400- 500- Rời, đều, 500 500 400- 400600 600 tròn 500- 500- Rời, tròn, 600 600 400- 400500 20 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh CHƯƠNG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LƯU GIỮ THUẬN NGHỊCH CAFEIN CỦA POLYMER 2.1 Kiểm tra lưu giữ cafein polymer màng mỏng lam kính sử dụng phương pháp quang phổ UV-Vis Khi rửa giải dung môi cloroform, polymer bị hủy hòa tan trở lại, dung dịch rửa giải trở nên đục Khi sử dụng dung mơi có methanol, polymer sẽ bị gãy vụn thành mảnh nhỏ, hoặc tách thành mảng lớn khơng thể bám dính bề mặt lam kính Do khơng thể tạo màng mỏng polymer lam kính để khảo sát phổ UV-Vis polymer, tức khảo sát trực tiếp diện cafein cấu trúc polymer phổ UV-Vis 2.2 Kiểm tra lưu giữ cafein polymer dạng hạt sử dụng phương pháp quang phổ UV-Vis − Do cloroform có bước sóng cực đại 245 nm, mà cafein có bước sóng hấp thu cực đại 273, nên tiến hành tổng hợp MIP theo công thức B3 Bảng để tiến hành đo quang phổ UV − Sau tổng hợp MIP NIP theo công thức B1, B2, B4, B7, B8, B9, B10, B11 Bảng tạo hạt với dung môi iso propanol, tiến hành rửa giải với dung môi theo thứ tự bảng đo quang phổ UV-Vis ta thu kết Bảng 10 Thay iso propanol dung môi tạo hạt n-butanol, ethanol, methanol, dietyl ete, kết thu tương tự Bảng 10, cho thấy dung môi tạo hạt – cần khơng phá hủy polymer (ví dụ cloroform) sử dụng Dung mơi tạo hạt không ảnh hưởng đến khả rửa giải tái hấp phụ cafein polymer 21 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Bảng 10 Kiểm tra lưu giữ cafein polymer dạng hạt sử dụng phương pháp quang phổ UV-Vis (kết trình bày theo MIP/NIP công thức tương Methanol Ethanol Iso propanol n-butanol Dịch tạo hạt +/- -/- -/- -/- +/- +/- B1 +/- -/- -/- -/- +/- +/- B2 +/- -/- -/- -/- +/- +/- B4 +/- -/- -/- -/- +/- +/- B7 +/- -/- -/- -/- +/- +/- B8 +/- -/- -/- -/- +/- +/- B9 +/- -/- -/- -/- +/- +/- B10 +/- -/- -/- -/- +/- +/- B11 ứng) Methanol-acid (9:1) Ethanol Iso propanol n-butanol -/- -/- -/- +/+ +/+ -/- -/- -/- +/+ +/+ -/- -/- -/- +/+ +/+ -/- -/- -/- +/+ +/+ -/- -/- -/- +/+ +/+ -/- -/- -/- +/+ +/+ -/- -/- -/- +/+ +/+ -/- -/- -/- +/+ Tái hấp phụ cafein Methanol +/+ + : dương tính, có diện cafein Methanol-acid (9:1) Chú thích: - : âm tính, khơng có diện cafein Hình Phổ UV dịch tạo hạt MIP - cafein MIP-NIP sau lần rửa n- Hình Phổ UV dịch rửa giải 22 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh NIP cafein MIP-NIP iso Hình Phổ UV dịch rửa giải acid (9:1) lần cafein MIP-NIP methanol- Hình Phổ UV dịch rửa giải butanol propanol 23 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Hình Phổ UV dịch rửa giải Hình Phổ UV MIP chưa thêm cafein chuẩn cafein MIP-NIP methanol- polyme hóa methanol-acid (9:1) acid (9:1) lần Từ Hình cho thấy MIP thu cịn phần cafein dung mơi tạo hạt, dịch tạo hạt NIP âm tính với cafein Sau tiếp tục rửa MIP NIP n-butanol thêm lần nữa, đảm bảo MIP NIP đã rửa hoàn toàn cafein n-butanol, tiếp tục rửa dung mơi khác Hình cho thấy khơng cafein thơi từ MIP Hình cho thấy dung mơi iso propanol, methanol, ethanol khơng có khả rửa giải cafein cịn lại MIP/NIP Hình 5, Hình cho thấy cafein tiếp tục rửa giải dung dịch methanol-acid (9:1) Hình chứng dương, cho thấy mơi trường có monomer, chất liên kết chéo, chất khơi mào, phổ UV cafein có thay đổi bước sóng cực đại bước sóng dài Bước sóng hấp thu cực đại MIP cafein dung dịch methanol acid 24 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh (9:1) q gần nhau, làm sai lệch kết quả, cần tiến hành phương pháp định lượng sắc kí lỏng hiệu cao để chắn 2.3 Kiểm tra lưu giữ cafein polymer dạng hạt sử dụng phương pháp HPLC 2.3.1 Kiểm tra tính đặc hiệu qui trình định lượng cafein: Tính đặc hiệu tiến hành mẫu: trắng, chuẩn, thử có cafein, thử khơng có cafein (Hình 8, Hình 9, Hình 10) Phổ UV thời điểm khác đỉnh cafein Hình Sắc ký đồ mẫu thử (có cafein) Hình Sắc ký đồ mẫu chuẩn ghi nhận lại (Hình 11) Kết cho thấy đỉnh có hình dạng giống 25 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Mẫu trắng Mẫu thử khơng có cafein Mẫu chuẩn Hình 10 Sắc kí đồ mẫu thử khơng có cafein Mẫu thử có cafein chuẩn, thử có cafein, thử khơng có cafein Hình 11 Phổ UV thời điểm khác đỉnh cafein mẫu trắng, 26 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Kết luận: Qui trình định lượng cafein có tính đặc hiệu 2.3.2 Kiểm tra tính tương thích hệ thống qui trình định lượng cafein Dung dịch hỗn hợp chất đối chiếu dung dịch thử bơm lần liên tiếp vào hệ thống HPLC kết Bảng 11 Bảng 11 Tính tương thích hệ thống phương pháp HPLC mẫu chuẩn cafein SD TB 0,06 0,003 4,730 4,726 4,727 4,732 4,729 4,732 4,734 0,64 172 26709 26881 26708 26692 26469 26921 26585 S 0,27 2471 2481 2470 2475 2461 2473 2467 H 0,9755 0,969 0,979 0,975 0,985 0,962 0,983 Af 1,31 60,552 4613 4603 4704 4614 4573 4531 4654 N Lần tiêm mẫu tR RSD% Nhận xét: Các thông số nằm giới hạn quy định có RSD