Tách chiết, tinh sạch ADN từ các mẫu bị phân hủy trong thực nghiệm

Bài viết nghiên cứu tiến hành trên 16 mẫu máu không bảo quản được xử lý ở nhiệt độ phòng trong các khoảng thời gian 2 tuần, 4 tuần, 8 tuần và 16 tuần, hoặc đun ở 1000C. Tiến hành tách chiết ADN bằng hạt từ tính, nhân gen GADPH, điện di kiểm tra sản phẩm PCR.

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH ADN TỪ CÁC MẪU BỊ PHÂN HỦY TRONG THỰC NGHIỆM Trần Văn Khoa*; Triệu Tiến Sang* Nguyễn Minh Hải**; Ngơ Trường Giang* TĨM TẮT Nghiên cứu tiến hành 16 mẫu máu không bảo quản xử lý nhiệt độ phòng khoảng thời gian tuần, tuần, tuần 16 tuần, đun 1000C Tiến hành tách chiết ADN hạt từ tính, nhân gen GADPH, điện di kiểm tra sản phẩm PCR Kết quả: phản ứng PCR cho sản phẩm đặc trưng Như vậy, tách chiết ADN hạt từ tính, mẫu ADN bị biến tính phần có đủ chất lượng ổn định, đủ điều kiện để tiến hành phân tích * Từ khoá: Nhận dạng cá thể; Mini STRs; Tách triết, tinh ADN DNA EXTRACTION AND PURIFICATION FROM EXPERIMENTALLY DEGRADED SAMPLES SUMMARY The study was carried out on 16 blood samples, which were not preserved for different period of time: weeks, weeks and 16 weeks in condition of 370C temperature with 100% humidity, and in boiling water for 30 minutes, hours, hours and hours DNA was extracted using both normal kit and magnetic particle based DNA IQ, Promega kit DNA samples were evaluated using Nano Drop 1000 DNA amplification for mini STR analysis was conducted using PowerPlex S5, Promega, USA Results: all mini STR markers were successfully amplified and informative thus it can be used for individual identification in case of samples partially degraded * Key words: Individual identification; Mini-STRs; DNA extraction and purification ĐẶT VẤN ĐỀ Trong lĩnh vực ADN pháp y, nhiều trường hợp mẫu bị biến tính sau thời gian định bị biến tính tác nhân lý hóa khác [3, 4] Chính vậy, việc tách chiết ADN đóng vai trò quan trọng để thu mẫu ADN * Học viện Quân y ** Viện Y học Hàng không Người phản hồi (Corresponding): Trần Văn Khoa (tranvankhoa@gmail.com) Ngày nhận bài: 8/10/2013; Ngày phản biện đánh giá báo: 30/10/2013 Ngày báo đăng: 7/11/2013 68 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 có đủ chất lượng số lượng cho trình phân tích (PCR) [2] Để đánh giá, lựa chọn phương pháp tách chiết ADN phù hợp, tiến hành xử lý mẫu máu điều kiện thời gian khác [1] ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu 16 mẫu máu nghiên cứu lấy chống đông EDTA ml/mẫu Chia mẫu máu làm lơ: có biến tính khơng biến tính Cách thức xử lý sau: mẫu máu đối chứng: Không xử lý gì, bảo quản nhiệt độ -800C tách chiết Mẫu xử lý: tạo mẫu ADN biến tính phần cách để mẫu mơi trường với thời gian dài (không bảo quản) Xử lý tạo mẫu ADN biến tính thực nghiệm theo mơ hình Dixon CS 2006 [3]: để mẫu môi trường 370C với độ ẩm 100% thời gian tuần, tuần, 16 tuần Tạo mẫu ADN biến tính phần tác nhân nhiệt độ 1000C 30 phút, giờ, Vật liệu nghiên cứu Nhóm hóa chất dùng cho tách chiết ADN: QIAamp ADN blood Mini Kit, ADN-IQ system, promega Nhóm hóa chất dùng cho PCR: đệm enzyme Taq polymerase 10X, MgCl2 25 mM, dNTPs mM, Taq polymerase U/µl, nước cất khử ion khử trùng, nhóm hóa chất dùng cho điện di agarose, đệm TBE, ethidium bromide Nhóm hóa chất dùng cho phản ứng nhân gen phân tích mini STR: powerplex S5 - promega, POP-4™ polymer (P/N 4352755), HiDiTM formamide (P/N 4311320), máy ly tâm (Mikro 200 - Hittich, Đức), máy PCR 9700 (ABI, Mỹ), điện di agarose: nguồn 300V, bể điện di (biorad, Mỹ), buồng thao tác PCR, block gia nhiệt, máy khuấy từ, máy định lượng Nanodrop, máy điện di mao quản 3130XL Phƣơng pháp nghiên cứu * Tách chiết ADN: Tách chiết QIAamp ADN blood mini kit mẫu khơng biến tính theo quy trình nhà sản xuất Tách chiết ADN-IQ system, promega mẫu biến tính theo quy trình sau [5]: + Bước 1: chia nhỏ phần máu cho vào ống nghiệm + Bước 2: thêm lysis buffer, ủ 700C 30 phút để hoà tan mẫu + Bước 3: ly tâm để loại bỏ bớt tạp chất + Bước 4: thêm hạt từ tính để tạo phức hợp "hạt từ tính-thành phần tích điện (-)" 70 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 + Bước 5: đặt ống nghiệm vào giá từ tính để lọc lấy phức hợp + Bước 6: rửa nhiều lần wash buffer để thu phức hợp "hạt từ tính ADN" + Bước 7: để khơ nhiệt độ phòng để loại bớt nước Thành phần phản ứng PCR: Powerplex S5 5X Master Mix µl, Power Plex S5 10X Primer Pair Mix 2,5 µl, ADN khuôn 0,25 - 0,50 ng, nước cất vừa đủ 25 µl [6] Nhân gen máy PCR 9700 (ABI Mỹ) theo chu trình nhiệt NHIỆT ĐỘ THỜI GIAN SỐ CHU KỲ o 96 C phút chu kỳ 94oC 30 giây 60oC phút + Bước 9: thu dung dịch ADN 72oC 90 giây Sau thu mẫu ADN, chúng 60oC 45 phút chu kỳ 4oC ∞ chu kỳ + Bước 8: thêm elution buffer ủ 65 C phút để tách ADN khỏi hạt từ tính tơi tiến hành định lượng kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm phương pháp định lượng máy đo quang phổ Nanodrop * Phương pháp định tính, định lượng ADN: Sản phẩm ADN thu sau trình tách chiết định lượng máy Nanodrop bước sóng 260/280 nm nhằm kiểm tra độ tinh μl mẫu ADN sau tách chiết điện di gel agarose để kiểm tra chất lượng ADN Những mẫu có nồng độ thấp tiến hành nhân gen GADPH điện để đánh giá khả nhân gen với cặp mồi F-5’CCCCACACACATGCACTTACC-3’; R-5’CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3’ * Phản ứng PCR nhân gen mini STR: 30 chu kỳ Điện di mao quản tự động hệ thống máy giải trình tự AB 3130XL, phân tích alen: thêm µl sản phẩm PCR µl PowerPlex® S5 Allelic Ladder Mix Biến tính 95 phút, sau để đá phút trước tra mẫu điện di KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết tách chiết ADN Đối với lượng máu, hàm lượng ADN lớn nên tách xong, tiến hành kiểm tra nồng độ ADN máy Nano Drop, điện di gel agarose 0,8%, nhuộm dung dịch EtBr 10 µg/ml, sau quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm 71 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 Bảng 1: Kết đo nồng độ độ tinh ADN tách từ 16 mẫu máu không bị biến tính MẪU NỒNG ĐỘ ADN (µg/µl) 42,4 1,73 47,5 1,73 52,16 1,72 10 61,1 1,74 43,4 1,80 11 49,9 1,71 51,3 1,71 12 47,3 1,70 51,9 1,69 13 54,0 1,72 60,2 1,79 14 52,5 1,78 45,6 1,73 15 59,8 1,83 42,4 1,73 16 40,23 1,61 A /A 260 280 MẪU NỒNG ĐỘ A /A 260 280 ADN (µg/µl) Từ kết ta thấy, nồng độ ADN cao, tỷ số A260/A280 số để đánh giá độ tinh ADN, nằm khoảng 1,6 - 1,8: chứng tỏ ADN có độ cần thiết cho nghiên cứu phân tích Với mẫu này, chúng tơi điện di agarose kiểm tra cho thấy kết tốt (hình 1) Như vậy, đánh giá quy trình tách chiết ADN khơng bị biến tính, khẳng định dùng kit thơng thường hồn tồn tốt Hình 1: Ảnh điện di kiểm tra ADN gel agarose 0,8% với mẫu khơng biến tính tách kit thông thường Bảng 2: Kết đo nồng độ tinh ADN tách chiết từ 16 mẫu máu biến tính nhiệt độ 1000C MẪU NỒNG NỒNG ĐỘ ĐỘ A260/A280 MẪU ADN ADN (µg/µl) (µg/µl) 1,57 2,29 3,01 1,48 1,77 2,89 2,61 2,90 1,63 1,78 1,76 1,62 1,92 1,75 1,93 1,90 10 11 12 13 14 15 16 1,67 2,64 3,39 2,22 1,86 3,33 1,55 2,23 A260/A280 1,60 1,66 1,81 1,75 1,81 1,85 1,64 1,72 Mặc dù mẫu bị biến tính thu nồng độ thấp mẫu khơng bị biến tính, đảm bảo tinh Đối với mẫu máu bị biến tính phần thực nghiệm, tiến hành tách chiết thu ADN hạt từ tính Sau tách chiết, điện di gel agarose kiểm tra không thấy xuất băng Để đánh giá khả nhân gen, sử dụng mồi GAPDH để nhân gen này, sản phẩm PCR có kích thước 97 bp Dưới hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm sau PCR Hình 2: Ảnh điện di mẫu biến tính tách kit thơng thường 72 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 Từ trái sang phải: chứng âm, chứng dương, marker ADN 100 bp, mẫu biến tính tuần: mẫu (+), mẫu (-), mẫu biến tính nhiệt 30 phút (+), mẫu biến tính nhiệt (-) Hình 3: Ảnh điện di mẫu biến tính tách hạt từ tính Từ trái sang phải: chứng âm, chứng dương, marker ADN 100 bp Hàng trên: mẫu biến tính tuần biến tính nhiệt giờ; hàng dưới: mẫu biến tính nhiệt Hình 4: Ảnh điện di mẫu biến tính tách hạt từ tính Từ trái sang phải: chứng âm, chứng dương, marker ADN 100 bp Hàng trên: mẫu biến tính tuần; hàng mẫu biến tính 16 tuần Kết bƣớc đầu xác định kiểu gen locus STR máy giải trình tự gen Với mẫu ADN thu được, tiến hành phản ứng nhân gen để xác định khả nhân gen phân tích mini STR Sử dụng kit nhân gen Powerplex S5 PCR Amplification kit Đây kit cho phép đồng khuếch đại phát triển locus bao gồm D8S1179, D18S51, FGA TH01 Đối với mẫu này, sau chạy điện di kết thu xử lý phần mềm Genemapper ID 3.2 Phần mềm so sánh kích thước băng ADN thu mẫu nghiên cứu với băng tương ứng thang alen chuẩn cho kết chi tiết kiểu gen locus hình minh họa hình sau Hình 5: Hình ảnh điện di mẫu số khơng bị biến tính 73 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 Hình 6: Ảnh điện di mẫu số bị biến tính phần nhiệt độ thang alen đặc trưng cho locus dye khác nhau, đem so sánh với thang alen chuẩn xác định kiểu gen Nhìn vào hình thấy locus Amello, D18S51, TH01, FGA dị hợp tử thực điện di xuất băng khác nhau, locus D8S1179 đồng hợp tử tiến hành điện di xuất băng Tiến hành điện di tương tự mẫu số 02 bị biến tính nhiệt độ thể hình 6, thấy kích thước băng điện di thấp so với kích thước điện di mẫu khơng bị biến tính xác định kiểu gen Qua phân tích, thu bảng số liệu gồm kiểu gen alen locus mẫu khơng bị biến tính, bị biến tính nhiệt độ bị biến tính mơi trường (số liệu trình bày chung cho điều kiện biến tính) Các locus mang kiểu gen dị hợp tử có hai băng có kích thước khác nhau, locus có kiểu gen đồng hợp tử thu băng Khi tiến hành điện di huỳnh quang với mẫu số 02 không bị biến tính, thu Bảng 3: Kiểu gen dựa marker mini STR 16 mẫu MẪU AMELLO D18S51 D8S1179 TH01 FGA X X Y Y 15 14 21 18 10 12 10 10 21 24 25 27 X X Y Y 14 15 15 16 12 10 17 13 10 9.3 17 25 24 25 X X Y Y 16 15 19 20 13 10 13 14 9 18 21 22.2 25 X X X Y Y Y 14 13 14 16 15 15 12 12 11 15 14 15 7 9.3 20 23 21 21 25 22 10 X Y 12 15 11 15 10 17 21 11 12 X X Y Y 13 13 21 17 14 10 14 15 21 19 23 21 74 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) 13 X Y 15 16 10 10 10 21 22 14 X Y 14 19 11 16 19 23 15 X Y 14 15 10 19 7 21 24 16 X Y 13 16 13 15 22 23 X Y 14 16 12 15 7 20 21 X Y 13 15 12 14 9 23 25 X Y 14 15 11 15 9.3 21 22 10 X Y 12 15 11 15 10 17 21 11 X Y 13 21 14 14 21 23 Kết nghiên cứu với mẫu bình thường mẫu bị biến tính điều kiện khác thu thông tin cần thiết Như vậy, kết luận phương pháp tách chiết mẫu bị biến tính hồn tồn tốt Một số tác giả sử dụng tách hạt từ cho kết tốt [1] Các locus gen có tỷ lệ dị hợp tử cao, bước đầu đánh giá khả nhận dạng mẫu nghiên cứu KẾT LUẬN Qua tách chiết đánh giá chất lượng 16 mẫu ADN bị phân huỷ phần thực nghiệm, rút kết luận: sử dụng phương pháp tách chiết hạt từ tính mẫu ADN bị phân huỷ phần thu mẫu ADN đủ điều kiện phân tích mini STR công tác nhận dạng cá thể TÀI LIỆU THAM KHẢO Barbara Haak, Andrea Porsche, Kai Vollack, Peter Zimmermann, Werner Pflug Evaluation of a semi-automated, magnetic bead-based DNA extraction method for genetic fingerprinting of forensic casework samples Forensic Science International: Genetics Supplement Series 2008, pp.35-36 Carracedo A and Lareu MV Proceedings of the ninth international symposium on human indentification Madison WI: Promega corporation 1998, pp.89-107 Dixon LA, Dobbins AE, Pulker HK et al Analysis of artificially degraded DNA using STRs and SNPs - results of a collaborative European (EDNAP) exercise Forensic Science International 2006, 164, pp.33-44 Madisen L, Hoar DI, Holroyd CD, Crisp M, ADN Hodes ME DNA Banking: the effects of storage of blood and isolated DNA on the integrity of DNA Am Z Med Genet 1987, 27, p.379 Promega Technical Bullentin for use with DNA IQ Promega Technical manual PowerPLexS5 System 75 ... 1,72 Mặc dù mẫu bị biến tính thu nồng độ thấp mẫu khơng bị biến tính, đảm bảo tinh Đối với mẫu máu bị biến tính phần thực nghiệm, tiến hành tách chiết thu ADN hạt từ tính Sau tách chiết, điện... tra ADN gel agarose 0,8% với mẫu khơng biến tính tách kit thông thường Bảng 2: Kết đo nồng độ tinh ADN tách chiết từ 16 mẫu máu biến tính nhiệt độ 1000C MẪU NỒNG NỒNG ĐỘ ĐỘ A260/A280 MẪU ADN ADN... chiết Mẫu xử lý: tạo mẫu ADN biến tính phần cách để mẫu mơi trường với thời gian dài (không bảo quản) Xử lý tạo mẫu ADN biến tính thực nghiệm theo mơ hình Dixon CS 2006 [3]: để mẫu môi trường 370C