Đang tải... (xem toàn văn)
Mục tiêu nghiên cứu nhằm phát hiện và tiến hành phân tích gene tổ hợp BCR-ABL bao gồm BCR-ABL b2a2 và BCR-ABL b3a2 để xác định sự hiện diện của nhiễm sắc thể Philadelphia trong máu ngoại biên của bệnh nhân CML. Nghiên cứu tiến hành trên 60 bệnh nhân được xác định chẩn đoán là CML với tủy đồ dương tính và đang được điều trị trị ngoại trú tại Khoa Huyết Học Bệnh viện Chợ Rẫy từ 05.08.2009 đến 19.11.2009
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ Số * 2010 Nghiên cứu Y học PHÁT HIỆN NHIỄM SẮC THỂ PHILADELPHIA TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ BẠCH CẦU MÃN TÍNH DỊNG HẠT BẰNG KỸ THUẬT PCR Phan Đình Điền*, Phạm Hùng Vân**, Nguyễn Thái Sơn** TĨM TẮT Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu: Nhiễm sắc thể Philadelphia diện máu ngoại biên tủy xương bệnh nhân ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt (Chronic Myeloid Leukemia-CML) với tỷ lệ lớn 95%, ñây sản phẩm chuyển đoạn t(9;22), ABL proto-oncogene từ nhiễm sắc thể số đến gắn vào vị trí 5’ gene BCR nhánh dài nhiễm sắc thể số 22 (q34;q11) Với kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction), ñây RT-PCR phát gene tổ hợp BCR-ABL nhiễm sắc thể Philadelphia Mục tiêu nghiên cứu nhằm phát tiến hành phân tích gene tổ hợp BCR-ABL bao gồm BCR-ABL b2a2 BCR-ABL b3a2 ñể xác ñịnh diện nhiễm sắc thể Philadelphia máu ngoại biên bệnh nhân CML Đối tượng nghiên cứu: 60 bệnh nhân ñược xác ñịnh chẩn đốn CML với tủy đồ dương tính ñang ñược ñiều trị ngoại trú Khoa Huyết Học Bệnh viện Chợ Rẫy từ 05.08.2009 ñến 19.11.2009 Phương pháp mẫu nghiệm nghiên cứu: Chúng sử dụng phương pháp nghiên cứu cắt ngang, mô tả 04 ml máu ngoại biên bệnh nhân ñược lấy cho vào tube có chất chống đơng EDTA Máu tồn phần trích ly RNA, khuếch đại types gene tổ hợp BCR-ABL b2a2 b3a2 kỹ thuật RT-PCR, tiến hành xét nghiệm ñịnh lượng Real-Time PCR nhờ 03 nồng ñộ chuẩn gene β-glucuronidase (GUS) S1:100.000 copies/ml, S2: 10.000 copies/ml S3:1.000 copies/ml, ñược phát real time với mẫu nghiệm Phân tích kết phần mềm iQ5 Real-Time PCR System Software Kết quả: Phát ñược gene tổ hợp BCR-ABL máu ngoại biên bệnh nhân CML với tỷ lệ 98.33% (59/60 BN) BCR-ABL b2a2: 32.20 %, BCR-ABL b3a2: 44.07 % dạng kết hợp BCR-ABL b2a2 + b3a2 chiếm tỷ lệ 23.73 % Kết luận: Những kết cho thấy dùng kỹ thuật PCR để phát nhiễm sắc thể Philadelphia Việc so sánh ñối chiếu kết với tác giả khác ngồi nước bàn luận để khẳng định giá trị kỹ thuật Từ khóa: Ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt, Gene tổ hợp BCR-ABL, Hoạt tính Tyrosine Kinase, Protein P210, Xét nghiệm RT-PCR ABSTRACT DETECTION AND QUANTITATIVE THE PHILADELPHIA CHROMOSOME BY PCR TECHNIQUE IN CHRONIC MYELOID LEUKEMIA PATIENTS Phan Dinh Dien, Pham Hung Van, Nguyen Thai Son * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 14 - Supplement of No - 2010: 565 - 569 Background: The BCR-ABL fusion gene, formed by rearrangement of the breakpoint cluster region (bcr) on chromosome 22 with the abl proto-oncogene on chromosome 9, is present in virtually all Chronic Myeloid Leukemia (CML) patients The t(9;22) (q34;q11) translocation associated with BCR-ABL leads to a cytogenesis aberration known as Philadelphia chromosome, and it could be detected by PCR technique Objective: To detect and quantitative analysis for fusion genes BCR-ABL including BCR-ABL b2a2 and BCR-ABL b3a2 transcripts to confirm the presentation of Philadelphia chromosome in CML patients *Khoa Sinh Hóa Bệnh viện Chợ Rẫy ** Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh Tác giả liên hệ: TS Phạm Hùng Vân, ĐT: 0903698920, Email: phhvan.nkbiotek@gmail.com Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2010 565 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ Số * 2010 Nghiên cứu Y học Subjects: 60 cases of CML patients in chronic phase (CP) were confirmed by positive bone marrow smears that were undergoing treated in out patient department of Cho Ray hospital Method and specimens: 04ml peripheral blood in an EDTA tube was collected, in this quantitative assay; extracted RNA is subject to Real-Time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) to amplify 02 types of BCR-ABL fusion transcripts: b2a2 and b3a2 An additional amplification of the GUS gene (β-glucuronidase) is performed as a control for sample RNA quality and as a reference for relative quantification Results: Results show that the BCR-ABL fusion gene was found in 59 (98.33%) of these 60 blood samples In these 59 positive cases, BCR-ABL b3a2 type has the highest rate of 44.07%, followed by BCR-ABL b2a2 type with 32.2%, and BCR-ABL b2a2 + b3a2 combinative type with 23,73% Conclusion: These results indicate that PCR technique can be used to detect Philadelphia chromosome We also compare our results with other local and foreign researchers to confirm the accuracy of this technique Keywords: Chronic Myeloid Leukemia, BCR-ABL, Tyrosine kinase, Protein P210, RT-PCR ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt (Chronic Myeloid Leukemia – CML) bệnh ác tính hệ tạo máu với đặc điểm tăng sinh dòng bạch cầu hạt Trong bệnh CML có biến đổi nhiễm sắc thể ñặc trưng ñó nhiễm sắc thể Philadelphia (Ph)(4), ñây sản phẩm chuyển ñoạn nhiễm sắc thể số nhiễm sắc thể số 22 ký hiệu t(9;22)(5) Theo khảo sát nhà nghiên cứu khoa học giới, nhiễm sắc thể Philadelphia diện máu ngoại biên tuỷ xương bệnh nhân CML lớn 95%(3,1) Nghiên cứu mặt sinh học phân tử cho thấy chất gene nhiễm sắc thể Philadelphia gene tổ hợp BCR-ABL(6) ñược tạo thành chuyển ñoạn ABL proto-oncogene từ nhiễm sắc thể số đến gắn vào vị trí 5’ BCR gene nhánh dài nhiễm sắc thể số 22 (q34;q11) Trong bệnh CML, gen tổ hợp BCR-ABL chủ yếu tạo loại protein có hoạt tính Tyrosine Kinase protein P210 (protein có trọng lượng phân tử 210 KD) protein nguyên nhân chủ yếu gây bệnh CML(7) Tùy theo vị trí xếp điểm gãy (breakpoints) khác BCR-gene ABL-gene ta có sản phẩm BCR-ABL khác nhau: BCR-ABL b2a2 vị trí xếp ñiểm gãy nằm exon 13 14, hay ñó BCR-ABL b3a2 vị trí xếp ñiểm gãy nằm exon 14 15(6) Phát ñược gene tổ hợp BCR-ABL máu ngoại biên bệnh nhân CML ñồng nghĩa với phát ñược nhiễm sắc thể Philadelphia Do việc tiến hành xây dựng kỹ thuật ñể phát diện nhiễm sắc thể Philadelphia máu ngoại biên bệnh nhân CML ñiều cần thiết chẩn đốn điều trị Hình Sự tạo thành gen BCR-ABL (Salesse et al 2002) Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2010 566 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ Số * 2010 Nghiên cứu Y học ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNGPHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng 60 bệnh nhân (bao gồm 32 nữ, chiếm tỉ lệ 53.33% 28 nam, chiếm tỉ lệ 46.67 %) với ñộ tuổi nhỏ 20 ñến lớn 74 tuổi, chẩn đốn ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt (Chronic Myeloid Leukemia, CML) với tủy đồ dương tính điều trị loại thuốc Hydrea (Không sử dụng loại thuốc ức chế hoạt tính tyrosine kinase Imatinib, Dasatinib hay Nilotinib…) phòng khám huyết học Bệnh Viện Chợ Rẫy từ 05.08.2009 ñến 19.11.2009 Phương pháp Lấy mẫu bảo quản mẫu Lấy 04ml máu tĩnh mạch ngoại biên, cho vào ống nghiệm có chất chống đơng EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetic acid), lắc nhẹ ñể trộn ñều máu với chất chống đơng, bảo quản nhiệt độ 4-8oC vòng 08 phải chuyển đến phòng thí nghiệm để xử lý mẫu Kỹ thuật xét nghiệm Máu tồn phần trích ly RNA với thuốc thử chuẩn hố Chomczynski (2) Khuếch đại types gene tổ hợp BCR-ABL b2a2 b3a2 kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) sau tiến hành xét nghiệm ñịnh lượng Real-Time PCR nhờ 03 nồng ñộ chuẩn gene β-glucuronidase (GUS) S1: 100.000 sao/ml, S2: 10.000 sao/ml S3:1.000 sao/ml, ñược phát real time với mẫu nghiệm Phân tích kết phần mềm iQ5 Real-Time PCR System Software KẾT QUẢ Tương quan ñộ tuổi bệnh CML (Chronic Myeloid Leukemia) Bảng Mối tương quan ñộ tuổi bệnh CML Độ tuổi < 30 30 – 40 41 – 50 51 – 60 61 – 74 Số lượng 12 / 60 11 / 60 12 / 60 17 / 60 08 / 60 Tỷ lệ % 20.00 18.33 20.00 28.33 13.33 Những kết ghi nhận ñược cho thấy ña số bệnh nhân CML ñều ñộ tuổi người ñã trưởng thành, ñặc biệt tỷ lệ cao tuổi trung niên (41 – 60) # 48.33% Kết phân tích mẫu gene BCR-ABL từ 60 bệnh nhân CML Qua phân tích mẫu máu ngoại biên 60 bệnh nhân CML xác định chẩn đốn với tủy đồ dương tính điều trị ngoại trú Bệnh Viện Chợ Rẫy TP.Hồ Chí Minh, thuốc ñiều trị chủ yếu Hydroxyure (Hydrea) Chưa có bệnh nhân ñược ñiều trị trị với loại thuốc ức chế hoạt tính Tyrosine Kinase Imatinib, Dasatinib hay Nilotinib Chúng tơi phát 59/60 trường hợp (98,33%) mẫu máu đem phân tích có diện gene BCR-ABL Tần suất xuất dạng chuyển ñoạn nhiễm sắc thể Philadelphia Bảng Tần suất xuất nhiễm sắc thể Philadelphia bệnh nhân CML Vị trí chuyển đoạn Của nhiễm sắc thể Philadelphia BCR-ABL b2a2 BCR-ABL b3a2 BCR-ABL b2a2 + b3a2 Mẫu nghiệm dương tính với BCR-ABL (n = 59) Số lượng phát Tỷ lệ % 19 32.20 26 44.07 14 23.73 Bằng kỹ thuật RT-PCR, gene tổ hợp BCR-ABL ñã xuất máu ngoại biên 59/60 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2010 567 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ Số * 2010 Nghiên cứu Y học bệnh nhân: 19 người mang BCR-ABL b2a2 (32.20 %); 26 người mang BCR-ABL b3a2 (44.07 %) 14 người mang dạng kết hợp b2a2 + b3a2 (23.73 %) Hình ảnh mẫu gene bình thường khảo sát RT-PCR STANDARD 1,2,3 GUS Hình Mẫu gene người bình thường (khơng có nhiễm sắc thể Philadelphia) Ở hình thấy diện ñường chuẩn: S1, S2, S3 Sự xuất GUS (gene bạch cầu bệnh nhân) nói lên q trình phiên mã ngược khuếch đại từ phản ứng RT-PCR thực thành cơng Không phát diện gene BCR-ABL Hình ảnh mẫu gene có chuyển đoạn dạng b2a2 BN.số 58 b2a2 = 291.000 copies/ml STANDARD 1,2,3 GUS b2a2 Hình Mẫu có phát nhiễm sắc thể Philadelphia với chuyển đoạn vị trí b2a2 Ở hình ngồi diện 03 đường chuẩn S1, S2, S3 GUS phát đuợc diện nhiễm sắc thể Philadelphia với chuyển ñoạn vị trí b2a2 chứng tỏ ñây mẫu máu bệnh nhân ñang mang bệnh Ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt (CML) Hình ảnh mẫu gene có chuyển đoạn dạng b3a2 BN.số:51 b3a2 = 367 copies/ml STANDARD 1,2,3 GUS b3a2 Hình Mẫu có phát nhiễm sắc thể Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2010 568 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ Số * 2010 Nghiên cứu Y học Philadelphia với chuyển đoạn vị trí b3a2 Tương tự phát diện nhiễm sắc thể Philadelphia có chuyển đoạn vị trí b3a2 Hình Hình ảnh mẫu gene có chuyển đoạn dạng kết hợp b2a2+b3a2 BN.số: 60 b2a2 = 552 copies/ml b3a2 = 195.600 copies/ml STANDARD 1,2,3 GUS b3a2 b2a2 Hình Mẫu có phát chuyển đoạn hai vị trí b2a2 b3a2 Trong số bệnh nhân, qua phân tích kết phần mềm iQ5 Real-Time PCR System Software, chúng tơi thấy có diện chuyển đoạn 02 vị trí b2a2 b3a2 nhiễm sắc thể Philadelphia BÀN LUẬN 60 bệnh nhân CML xác định chẩn đốn với tủy đồ dương tính từ phòng thí nghiệm huyết học bệnh viện Chợ Rẫy ñang ñược ñiều trị ngoại trú phòng khám huyết học bệnh viện Thuốc sử dụng ñiều trị chủ yếu Hydroxyure (Hydrea), ñây loại thuốc chống chuyển hoá, tác dụng nhanh, ñộc, gây suy tủy(8) Tuy nhiên loại thuốc khơng có khả loại bỏ hồn tồn tác nhân gây bệnh gene tổ hợp BCR-ABL(8), điều giải thích chúng tơi sử dụng kỹ thuật RT-PCR phát diện gen tổ hợp BCR-ABL 59/60 bệnh nhân CML (98.33%) Carol D Jone CS (2003)(3) Susan Branford 2006(1) cho tỷ lệ lớn 95% hoàn toàn tương đồng với kết chúng tơi Cũng từ kết thấy bệnh Ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt xuất chủ yếu người ñã trưởng thành, ñặc biệt ñộ tuổi trung niên (41 – 60) KẾT LUẬN Từ kết trên, chúng tơi cho rằng, hồn thiện quy trình xét nghiệm để sau ñem áp dụng sở khám chữa bệnh Điều giúp cho thầy thuốc lâm sàng có phương tiện đáng tin cậy để nhanh chóng xác định chẩn đốn bệnh Ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt, đồng thời có kế hoạch điều trị theo dõi ñáp ứng ñiều trị bệnh CML cách hiệu TÀI LIỆU THAM KHẢO Branford S and Hughes T (2006) Diagnosis and Monitoring of Chronic Myeloid Leukemia by Qualitative and Quantitative RT-PCR Methods in Molecular Medicine Vol 125:69-92 Chomczynski P, (1987) Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction Anal Biochem.Apr; 162(1): 156-9 Jones CD, Yeung C (2003) Comprehensive Validation of a Real-Time Quantitative bcr-abl Assay for Clinical Laboratory Use Am J Clin Pathol 120: 42-48 Nowel, PC and Hungerford D.A (1960) Chromosome studies on normal and Leukemic human leucocytes J Natl Cancer Inst 25: 85108 Rowley JD (1973) A new consisten chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukemia ideltified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining.Nature 243: 290-3 Salesse, S and Verfaillie CM (2002) BCR/ABL: from molecular Mechanisms of Leukemia induction to treatment of chronic myelogenous Leukemia.Oncogene 21 (56): 8547- 59 Sawyers, C.L (1999) Chronic myeloid leukemia The New England Journal of Medicine 340(17):1330-59 Tybor JG (2008) Targeted drugs in Chronic Myeloid Leukemia Current medicinal Chemistry, 15: 3036-3051 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2010 569 ... RT -PCR ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt (Chronic Myeloid Leukemia – CML) bệnh ác tính hệ tạo máu với đặc điểm tăng sinh dòng bạch cầu hạt Trong bệnh CML có biến đổi nhiễm sắc thể. .. đường chuẩn S1, S2, S3 GUS phát đuợc diện nhiễm sắc thể Philadelphia với chuyển đoạn vị trí b2a2 chứng tỏ mẫu máu bệnh nhân ñang mang bệnh Ung thư bạch cầu mãn tính dòng hạt (CML) Hình ảnh mẫu gene... 14 15(6) Phát ñược gene tổ hợp BCR-ABL máu ngoại biên bệnh nhân CML ñồng nghĩa với phát ñược nhiễm sắc thể Philadelphia Do việc tiến hành xây dựng kỹ thuật ñể phát diện nhiễm sắc thể Philadelphia