Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm phân tích đặc điểm và phân bố mất đoạn nhỏ nhiễm sắc thể Y ở bệnh nhân vô sinh nam không có tinh trùng và ít tinh trùng. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.
TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 ĐẶC ĐIỂM VÀ PHÂN BỐ MẤT ĐOẠN NHỎ NHIỄM SẮC THỂ Y Ở BỆNH NHÂN VÔ SINH NAM KHƠNG CĨ TINH TRÙNG VÀ ÍT TINH TRÙNG TrÇn Văn Khoa*; Triệu Tiến Sang*; Quản Hồng Lâm* Ngơ Trường Giang*; Nguyễn Thị Việt Hà* TĨM TẮT Phân tích đoạn gen vùng yếu tố vô tinh trùng (TT) nhiễm sắc thể (NST) Y phương pháp PCR công cụ sàng lọc quan trọng điều trị vô sinh nam Nghiên cứu sử dụng phương pháp multiplex PCR để phân tích đoạn nhỏ NST Y sử dụng 19 trình tự mồi phát (STSs) thuộc ba gen vùng yếu tố vơ TT hc Ýt TT 323 bệnh nhân (BN) đối tượng nam khơng có TT có NST bình thường phân tích Kết quả: phát 17/323 nam giới vô sinh (5,26%) bị đoạn nhỏ NST Y Trong đó, BN đoạn AZFa, BN đoạn AZFb, 11 BN đoạn AZFc+d, BN đoạn AZFa+b+c BN đoạn AZFa+b+c+d Hai tổ hợp multiplex PCR thiết kế sử dụng trình tự mồi (STSs) phát cách hiệu đoạn phổ biến NST Y đối tượng vô sinh nam * Từ khố: Vơ sinh nam; Vơ tinh trùng; Mất đoạn nhỏ nhiễm sắc thể Y CHARACTERISTICS AND DISTRIBUTION OF MICRODELETIONS ON Y CHROMOSOME in infertile azoospermia men Summary Analysis of the microdelection in azoospermia factor (AZF) region of Y chromosome by PCR is an important screening tool in treatment of infertile males In the present study, the Y chromosome microdeletions were analyzed by PCR, using primers corresponding to 19 sequence tagged sites (STSs) on three genes of the AZF region A total of 323 azoospermic male showing normal karyotype were included in the study Results: Y chromosome microdeletions were observed in 17 out of 323 (5.26%) infertile males Of the seventeen subjects, had deletions in AZFa, in AZFb, 11 in AZFc+d, in AZFa+b+c regions and in AZFa+b+c+d Two multiplex PCRs were designed using STSs markers, which could detect efficiently almost Y chromosome microdeletions in infertile males * Key words: Male infertile; Azoospermia; Micro-deletions in the Y-chromosome ĐẶT VẤN ĐỀ Tỷ lệ vô sinh chiếm khoảng - 10% cặp vợ chồng độ tuổi sinh sản Khoảng 40% nam giới, 40% nữ 20% lại hai [3] Trong số trường hợp vơ sinh nam, tỷ lệ khơng có TT chiếm khoảng 10 - 15% Khoảng 10% trường hợp vô sinh khơng có TT khơng rõ ngun nhân Phân tích di truyền cho thấy vùng không chồng NST Y gọi vùng yếu tố vô TT AZFa, AZFb AZFc [10] Mất đoạn nhỏ số gen liên quan đến suy giảm sinh tinh vô sinh nam [1, 4, 6, 8] * Học viện Quân y Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: GS TS Hoàng Văn Lương GS TS Nguyễn Đình Tảo TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QN SỰ SỐ - 2013 Những nghiên cứu tần số đoạn nhỏ NST Y chủng tộc giới cho thấy kết đoạn nhỏ NST Y nam giới khơng TT TT khơng rõ nguyên nhân dao động từ - 55% Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu đoạn nhỏ NST Y BN vô sinh nam Việt Nam Nghiên cứu thực nhằm: Phân tích đặc điểm phân bố đoạn nhỏ NST Y BN nam khơng có TT ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu 323 nam giới vơ sinh, khơng TT hc Ýt TT, có vợ bình thường, đến khám Trung tâm Công nghệ Phôi, Học viện Quân y, Bộ môn Y sinh học - Di truyền, Đại học Y Hà Nội Viện Nam học Hiếm muộn Hà Nội thời gian 2010 - 2011 Sau khám xét lâm sàng, xét nghiệm hormon kiểm tra hệ thống sinh dục, lựa chọn nam vô sinh khơng có TT làm đối tượng nghiên cứu Lấy tinh dịch xét nghiệm sau kiêng sinh hoạt tình dục vòng ngày Phân tích mẫu tinh dịch theo tiêu chí Tổ chức Y tế Thế giới * Tiêu chí loại trừ: vơ sinh thứ phát, có bất thường quan sinh dục, bất thường NST Phƣơng pháp nghiên cứu Mô tả cắt ngang * Tách AND: Sử dụng kit ADN Blood Minikit (Qiagen) để tách ADN theo quy trình hướng dẫn nhà sản suất Kiểm tra nồng độ, độ tinh mẫu ADN thu hệ thống Nano-Drop 1000, USA Kiểm tra mẫu đạt nồng độ, độ tinh dùng cho phản ứng PCR * Lựa chọn cặp mồi nhân đoạn gen AZF: - Tiêu chí lựa chọn: mồi nhân trình tự đặc hiệu vùng AZF thuộc nhánh dài NST Y Mỗi vùng AZF a, b, c có hai trình tự mồi, đặc biệt vị trí hay xảy đứt gãy, đoạn gen Các mồi có nhiệt độ gắn mồi tương đương Chúng lựa chọn 19 cặp mồi nhân vùng gen AZZF cặp mồi SRY nhân đoạn gen nhánh ngắn NST Y làm nội chứng dương * Multiplex PCR: Dựa vào kích thước sản phẩm PCR, tổ hợp mồi vào ống phản ứng để chạy multiplex PCR Mỗi phản ứng bao gồm μl mastermix, - μl ADN khuôn, 0,25 - 0,5 μl mồi, nước cất vừa đủ đến 15 μl Phản ứng thực qua 35 chu kỳ Chu trình nhiệt cho chu kỳ sau: 940C 45 giây, 570C 45 giây 720C phút Chương trình đặt biến tính lần đầu trước 940C 11 phút cuối nối dài 720C phút SRY (472 bp) SRY (472 bp) SRY (472 bp) DBY (689 bp) SRY (472 bp) sY254 (350 bp) sY84 (326 bp) sY143 (311 bp) SRY (472 bp) USP9Y (249 bp) sY86 (320 bp) sY134 (301 bp) sY128 (228 bp) sY157 (285 bp) sY81 (209 bp) sY127 (274 bp) sY153 (139 bp) sY130 (173 bp) AZFa (220 bp) sY133 (177 bp) sY124 (109 bp) sY121 (190 bp) sY255 (126 bp) sY152 (125 bp) * Điện di: TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 Điện di sản phẩm PCR gel agarose 2%, với hiệu điện 100 V cường độ dòng điện 100 mA, nhuộm ethidium bromide, soi UV, chụp hình phân tích KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Sử dụng phản ứng multiplex PCR khảo sát đoạn nhỏ NST Y vùng AZF 329 BN vơ sinh nam khơng có TT, kết sau: Tỷ lệ đoạn vùng AZF BN vô sinh nam Với 323 BN vô sinh nam kiểm tra khơng có bất thường kiểu nhân, tiến hành phân tích ADN, chạy multiplex PCR với 19 cặp mồi nêu Kết cho thấy: tổng số 323 BN xét nghiệm ADN, 17 BN (5,26%) bị đoạn vùng AZF Đối chiếu với kết số tác giả khác khu vực giới thấy: Bảng 1: Tỷ lệ đoạn nghiên cứu so với số nghiên cứu khác TÁC GIẢ Martinez M.C, 2000 (Tây Ban Nha) [6] Canan F, 2004 (Thổ Nhĩ Kỳ) [3] A Zhou Can, 2006 (Trung Quốc) [2] Anurag Mitra, 2008 (Ấn Độ) [1] Nghiên cứu n SỐ STSs TỶ LỆ (%) 57 10 14 47 4,26 220 15 170 5,29 323 20 5,26 Tỷ lệ đoạn NST dao động nghiên cứu khác Tuy nhiên, tỷ lệ nghiên cứu chúng tơi nằm giá trị trung bình so với nghiên cứu khác nước khu vực châu Âu, cho thấy việc lựa chọn cặp mồi để phát đoạn nhỏ phù hợp với đối tượng nam vô sinh không TT người Việt Nam Phân bố đoạn theo vùng AZFa, AZFb, AZFc Bảng 2: Phân bố tỷ lệ đoạn vùng AZF nghiên cứu số nghiên cứu khác NGHIÊN CỨU NÀY MATINEZ (TÂY BAN NHA) [6] CANAN F THỔ NHĨ KỲ [3] A ZHOU CAN (TRUNG QUỐC) [2] ANURAG (ẤN ĐỘ) [1] Mất đoạn vùng AZFa (17,65%) 0 Mất đoạn vùng AZFb (5,88%) 1 Mất đoạn vùng AZFc 19 Mất đoạn vùng AZFd - - - (2) (3) (4) 5) (6) PHÂN BỐ (1) TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 Mất đoạn vùng AZFa+b 0 0 Mất đoạn vùng AZFb+c Mất đoạn vùng AZFc+d 11 (64,71%) - - - Mất đoạn vùng AZFa+b+c (5,88%) - - Mất đoạn vùng AZFa+b+c+d (5,88%) - - - Tổng số 17/323 8/57 2/47 33/220 9/170 Mất đoạn AZFc+d thường chiếm tỷ lệ cao Điều lý giải vùng AZFd vùng chồng lấn AZFb c, đó, số tác giả gộp vùng AZFb với c thành vùng AZFc Chỉ BN đoạn vùng AZFa+b+c vïng AZFa+b+c+d Mir Davood Omrami CS [7] nghiên cứu, 99 BN khơng có TT TT sử dụng 20 cặp mồi khác kỹ thuật multiplex PCR phát 17 BN đoạn gen Trong đó, 15 BN có đoạn, BN có hai đoạn BN ba đoạn Những đoạn chủ yếu vùng AZFc (21/17 BN) Nghiên cứu chúng tôi: điểm tương đồng tỷ lệ đoạn AZFc+d chủ yếu [1, 2, 3] Tuy nhiên, tỷ lệ đoạn AZFa nghiên cứu cao nghiên cứu khác đối tượng tham gia nghiên cứu chưa đại diện tiêu biểu cho cộng đồng dân cư tồn quốc, thơng thường, trường hợp đến khám điều trị trung tâm khám điều trị nhiều nơi khác không đạt kết mong muốn Phân bố đoạn theo STS Bảng 3: Phân bố tỷ lệ BN vô sinh nam theo STS nghiên cứu a b d c sY AZFa 81 84 86 DBY UPSP9Y 121 124 127 128 130 133 134 143 152 153 254 255 157 Tổng 0 0 2 1 15 14 14 14 14 (n = 83) Thống kê theo STS nghiên cứu vùng AZF thấy: đoạn sY152, sY153, sY254, sY255, sY157 chiếm tỷ lệ cao nhất, 71/83 BN đoạn loại, tiếp đến đoạn sY84, sY127, sY121, sY130, sY133, s134, lại khơng phát thấy đoạn sY khác A Zhou-Cun [2] nghiên cứu 358 trường hợp, đó, 256 BN khơng TT 102 BN TT phát 319 BN khơng có bất thường nhiễm sắc, 220 BN không TT 99 BN TT, sử dụng 12 cặp mồi sàng lọc đoạn nhỏ NST Y, 46 BN (14,4%) có đoạn 33/220 BN khơng TT (15%) đoạn Trong đó, tỷ lệ đoạn cao liên quan TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 đến sY: 152/254/255 (20/33 BN) Tiếp theo, sY84 (127/134 BN), sY86 gặp BN Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ đoạn AZFc liên quan đến sY: 152/153/254/255/157 cao Canan Figen Sargın CS (2004) [3], nghiên cứu 60 BN, 48 BN khơng TT, 13 BN TT, phát thấy BN (3,3%) có đoạn Trong đó, BN đoạn liên quan sY127/254 sY84/134 sY86 Nhiều nghiên cứu thấy đoạn hoàn toàn vùng AZFa chắn dẫn tới hội chứng SCOS [1, 4, 6, 8] Ở BN này, việc chọc hút hay sinh thiết mào tinh để lấy TT hoàn tồn vơ ích Do vậy, nên khun BN nhận ni thay theo đuổi phương pháp điều trị Đối với trường hợp đoạn vùng AZFb gây tượng kìm hãm trình sinh tinh, trường hợp BN đoạn AZFb+c dẫn tới hội chứng SCOS tượng kìm hãm sinh tinh [4] Trong nghiên cứu chúng tôi, trường hợp hai STS sY127, sY134 vùng AZFb Đối với BN bị AZFb AZFb/c không thấy TT áp dụng kỹ thuật TESE Hopp CS [4] chứng minh, đoạn AZFa, AZFb, AZFb+c, khơng có khả tách TT sử dụng kỹ thuật TESE, đó, đoạn AZFc, khả tách TT từ tinh hoàn thành công lên đến 75% Tương đồng với kết nghiên cứu trên, Krausz [5] phát 50% xuất TT trường hợp đoạn thuộc vùng AZFc đoạn thuộc vùng AZFa, AZFb tách TT từ tinh hồn Vì vậy, phát đoạn AZF khác liên quan đến tiên lượng định điều trị Giữa tỷ lệ đoạn nhỏ phát STS sử dụng nghiên cứu có mối quan hệ chặt chẽ với Vì vậy, nghiên cứu thêm để đưa STS phù hợp nhằm có kết cao điều cần thiết [9] Dưới số kết điện di nghiên cứu: Hình 1: Ảnh điện di BN phát đoạn sY84, sY86 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 Hình 2: Ảnh điện di BN phát đoạn sY127 sY134 Từ kết trên, với đặc điểm phân bố STS vùng AZF, chúng tơi lựa chọn trình tự mồi có khả phát đoạn nhỏ NST Y thường gặp hai tổ hợp multiplex PCR (hình 5) Hình 5: Hai tổ hợp multiplex PCR Hình 3: Ảnh điện di BN phát đoạn sY84, sY134 sY153 Ống 1: 1: Marker 100 bp, 2: Multiplex 1; 3-8: PCR đơn mồi: sY134 (301bp), sY84 (326bp), sY254 (350bp), SRY (472bp), DBY (689bp) chứng âm Ống 2: 1: Marker 100bp, 2: Multiplex 2, 3-8: PCR đơn mồi: sY255 (126bp), USP9Y (249bp), sY127 (274bp), sY86 (320bp), SRY (472bp) chứng âm TÀI LIỆU THAM KHẢO Anurag M Rima D Rajeev K, et al Screening for Y-chromosome microdeletions in infertile Idian males: utility of simplified multiplex PCR Indian J Med Res 127 2008, pp.124-132 Hình 4: Ảnh điện di BN phát đoạn sY254 sY153 BN bước đầu phát thấy bị đoạn STS tiến hành kiểm tra lại PCR đơn mồi A Zhou-Cun, Yang Yuan, Zhang Si-Zhong, Zhang Wei, Lin Li Chromosomal abnormality and Y chromosome microdeletion in Chinese patients with azoospermia or severe oligozoospermia Acta Genetica Sinica 2006, February, 33 (2) I 1, pp.1-116 Canan Figen Sargın, et al AZF microdeletions on the Y chromosome of infertile men from Turkey Annales De Génétique 2004, 47, pp.61-68 Hopps C.V, Mielnik A, Goldstein M, Palermo G D, Rosenwaks Z and Schlegel P N TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 Detection of sperm in men with Y chromosome microdeletions of the AZFa, AZFb and AZFc regions Human Reproduction 2003, Vol 18, No 8, pp.1660-1665 Krausz C, McElreavey K Y chromosome and male infertility Frontiers in Bioscience 1999, 4, pp.1-8 Marti’nez M C et al Screening for AZF deletion in a large series of severely impaired spermatogenesis patients Journal of Andrology 2000, September/October, Vol 21, No 5, pp.651-655 Mir Davood Omrani, Saied Samadzadae, Mortaza Bagheri, Kiarash Attar Y chromosome microdeletions in idiopathic infertile men from West Azerbaijan Urology Journal UNRC/IUA 2006, Vol 3, No 1, pp.38-43 Peterlin B, Kunej T, Sinkovec J et al Screening for Y chromosome microdeletions in 226 Slovenian sub-fertile men Hum Reprod 2002, 17, p.17 Simoni M, Bakker E and Krausz C EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions State of Art 2004 International Journal of Andrology 2004, 27, pp.240-249 10 Vogt PH, Edelmann A, Kirsch S et al Human Y chromosome azoospermia factors (AZF) mapped to different subregions in Yq11 Hum Mol Genet 1996, 5, pp.933-943 Ngày nhận bài: 1/10/2012 Ngày giao phản biện: 28/11/2012 Ngày giao thảo in: 28/12/2012 TP CH Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 ... cứu đoạn nhỏ NST Y BN vô sinh nam Việt Nam Nghiên cứu thực nhằm: Phân tích đặc điểm phân bố đoạn nhỏ NST Y BN nam TT ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu 323 nam giới vô sinh, ... cứu vùng AZF th y: đoạn sY152, sY153, sY254, sY255, sY157 chiếm tỷ lệ cao nhất, 71/83 BN đoạn loại, tiếp đến đoạn sY84, sY127, sY121, sY130, sY133, s134, lại không phát th y đoạn sY khác A Zhou-Cun... với đối tượng nam vô sinh không TT người Việt Nam Phân bố đoạn theo vùng AZFa, AZFb, AZFc Bảng 2: Phân bố tỷ lệ đoạn vùng AZF nghiên cứu số nghiên cứu khác NGHIÊN CỨU N Y MATINEZ (T Y BAN NHA) [6]