Bài viết đánh giá nguy cơ phát tán các đặc tính kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn trong nghiên cứu này, các cơ chế phân tử (gene kháng kháng sinh, plasmid) của việc khuếch tán các hoạt tính kháng kháng sinh cần phải được nghiên cứu cụ thể hơn nữa trong các nghiên cứu tiếp theo. Mời các bạn cùng tham khảo!
ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ ĐẶC TÍNH XÂM NHIỄM CỦA VI KHUẨN KHÁNG ĐA KHÁNG SINH PH N LẬP TỪ CÁ RÔ ĐỒNG (ANABAS TESTUDINEUS) Nguyễn Thành Luân*, Đặng Lê Thị Hồng Liên, Tiêu Yến Hoa, Trần Thị Ánh Linh Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH, Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh * Email: nt.luan@hutech.edu.vn TĨM TẮT Một số vi khuẩn gây bệnh phân lập từ cá rô đồng (Anabas testudineus), nhiên có nghiên cứu đặc tính kháng kháng sinh chủng độc lực Trong nghiên cứu này, khảo sát đặc điểm chủng vi khuẩn Vibrio non-Vibrio phân lập từ cá rô đồng cách kiểm tra độ nhạy với loại kháng sinh kiểm tra độc lực gây chết cá Tổng số 30 chủng vi khuẩn Vibrio (10 chủng) non-Vibrio (20 chủng) có biểu kháng với Amoxicillin, Ampicillin, Cefalexin, Cloramphenicol, Clindamycin, Doxycycline, Erythromycin, Tetveryline 11/12 chủng kháng với Clindamycin, 10/12 chủng kháng Ampicillin, 9/12 chủng kháng Tetveryline, 8/12 chủng kháng Cloramphenicol, 10/12 kháng Cefalexin, 4/12 chủng kháng Doxycycline Tất chủng khảo sát nhạy cảm với Ciprofloxacin việc sử dụng kháng sinh bị cấm Việt Nam 11/12 chủng có khả kháng với năm loại kháng sinh Những chủng kháng đa kháng kháng sinh gây chết cá rơ đồng giống (40-90%) thí nghiệm cảm nhiễm cách tiêm màng bụng 105CFU/con Nghiên cứu đặc biệt cho thấy việc sử dụng thuốc kháng sinh dự phòng điều trị bệnh nuôi trồng thủy sản Việt Nam cần phải kiểm soát nghiêm ngặt Để đánh giá nguy phát tán đặc tính kháng kháng sinh chủng vi khuẩn nghiên cứu này, chế phân tử (gene kháng kháng sinh, plasmid) việc khuếch tán hoạt tính kháng kháng sinh cần phải nghiên cứu cụ thể nghiên cứu Từ khóa: Antimicrobial susceptibility, Vibrio, Vietnamese Koi, virulence TỔNG QUAN Cá rô đồng, Vietnamese Koi (Anabas testudineus) loại cá sống tự nhiên nuôi phổ biến số tỉnh Đông Nam Bộ vùng ĐBSCL Tuy nhiên, với phát triển nhanh vùng nuôi mật độ nuôi cao, số dịch bệnh thường xuyên xảy "đóng nhớt, đen thân, mủ gan” gây thiệt hại kinh tế lớn Tỷ lệ cá chết sau đợt dịch bệnh cao giai đoạn ương giống nuôi thương phẩm, đặc biệt bệnh đen thân Cá ao hao hụt lên đến 20% sau đợt cá bị bệnh Hiện nay, giải pháp kháng sinh phòng điều trị bệnh sử dụng rộng rãi nuôi trồng thủy sản Việt Nam nhiên liều lượng sử dụng khơng xác (Van 2005) Trong nghiên cứu tiến hành phân lập đánh giá khả kháng loại kháng sinh thông thường chủng Vibrio spp non-vibrio thu từ cá thương mại nghi nhiễm bệnh Ngoài ra, chủng thể khả đa kháng kiểm tra độc lực gây chết cá Chúng đề xuất giải pháp phù hợp để hạn chế bùng phát bệnh sử dụng kháng sinh hợp lý 1056 VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP 2.1 Cá thí nghiệm Mười ba mẫu cá rô đồng thương phẩm cá giống có dấu hiệu lạ thu mua từ chợ Thủ Đức (~200g/con, con), chợ Lê Văn Sĩ, (~45g/con, con), trại cá ML (~4g/con, con) Tp.HCM Các mẫu lách, thận, mang gan mẫu cá cịn sống thu nhận vơ trùng cấy lên đĩa môi trường Trypton Soy agar (TSA, Himedia, India), TCBS (TMMedia, India) Đĩa cấy ủ 24 28°C Các khuẩn lạc làm bảo quản môi trường TSA + 15% glycerol Các vi khuẩn tăng sinh TSA 24 trước sử dụng cho thử nghiệm 2.2 Phƣơng pháp thử độ nhạy với kháng sinh Thử nghiệm độ nhạy với kháng sinh thực môi trường thạch Muller-Hinton Agar (HiMedia, India) theo phương pháp đĩa khuếch tán kháng sinh Kirby-Bauer Theo đó, dung dịch kháng sinh bổ sung vào giếng (d = mm) chuẩn bị sẵn đĩa thạch trải vi khuẩn (108CFU/ml) để đạt nồng độ cuối tương ứng với loại Amoxicillin (25µg), Ampicillin (10µg), Cefalexin (30µg), Chloramphenicol (30µg), Ciprofloxacin (5µg), Clindamycin (10µg), Doxycycline (30µg), Erythromycin (15µg), Tetracyline (30µg) mua từ cơng ty Mekophar, Việt Nam Sau đó, đĩa thạch ủ 24 28°C ghi nhận kháng theo phương pháp đề xuất CLSI (2008) 2.3 Thử nghiệm độc lực chủng đa kháng Cá thí nghiệm (~4g/con), màu sắc tươi sáng, phản ứng linh hoạt ni thích nghi tuần hệ thống bể 300L, sục khí 24/24 Thí nghiệm bố trí hệ thống bể 15L, sục khí 24/24 giờ, 10 con/bể, gồm nghiệm thức: (1) nghiệm thức đối chứng, tiêm dung dịch nước muối sinh lý 0,85% NaCl (0.1 ml/cá); (2) nghiệm thức cảm nhiễm tiêm (0.1 ml/cá) dung dịch chủng vi khuẩn (Bảng 1) Theo sinh khối vi khuẩn sau tăng sinh TSA 24 28°C huyền phù điều chỉnh mật độ ~106 CFU/ml nước muối sinh lý 0,85% NaCl Mật độ gây cảm nhiễm 105 CFU/cá phương pháp tiêm xoang bụng Mật độ vi khuẩn xác định phương pháp đếm số khuẩn lạc TSA Các biểu cá sau tiêm theo dõi ngày Đối với cá chết thí nghiệm thu nhận gan thận để tái phân lập lại vi khuẩn gây bệnh cách kiểm tra đồng kiểu hình với chủng gây bệnh KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Dấu hiệu bệnh lý Cá thí nghiệm có biểu bên ngồi thể cá có màu đen bất thường, nhiều trường hợp cá xuất huyết đầu (Hình 1A, B), bơi bất thường mặt nước Các biểu bên gan có đốm trắng lạ (Hình 1C) Các vi khuẩn phân lập có đồng cao (Hình 1D) Hình Cá rơ đồng biểu thân đen sậm (A), hình dạng khuẩn lạc mơi trường TCBS TSA (B), gan có dấu hiệu lạ (C) khuẩn lạc mọc đồng môi trường TSA 1057 3.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa vi khuẩn phân lập từ cá rô đồng Tổng cộng 12/30 chủng vi khuẩn phân lập từ gan, thận, lách, mang mẫu cá nghi nhiễm bệnh môi trường TSA (20 chủng) TCBS (10 chủng) (Bảng 1) chọn để kiểm tra đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Hầu hết xuất khuẩn sau 24 - 36 h ủ nhiệt độ 28°C (Hình 1D) Đa số vi khuẩn phân lập chứa hai loại tế bào vi khuẩn Gram âm, gram dương, dương tính với Catalase Oxidase (Bảng 1) Kết nghiên cứu tìm thấy vi khuẩn mẫu phân lập thuộc nhóm Vibrio (3/12 cá bị nhiễm) khuẩn lạc vàng (Hình 1) Vi khuẩn phát triển môi trường TSA sau 24 h 28°C, đường kính khuẩn lạc khoảng – mm bao gồm khuẩn lạc màu trắng đục suốt, bề mặt trơn láng lồi (Bảng 1) Các vi khuẩn phân lập có khả phát triển đa dạng mơi trường TSB có bổ sung NaCl (16%) (Bảng 1) Bảng Đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập từ cá rô đồng STT Code Địa điểm Trọng lƣợng (g) Dấu bệnh Hình thái# Conc Of NaCl (%) Gram/ Catalase/ Oxidase V2L Chợ, Q3 45 ND Tròn, trắng đục, lồi –/+/+ + + + + + – – V2T Chợ, Q3 45 ND Tròn, trắng đục, lồi –/+/+ + + + + + – – V7G Chợ, Q3 200 Thân đen Tròn, trắng đục +/+/+ + + + + + + – V7L Chợ, Q3 200 Thân đen Tròn, trắng đục –/+/+ + + + + + + – V3G Chợ, Q3 45 ND Trong suốt –/+/+ + + + + + + – V3T Chợ, Q3 45 ND Trịn, st –/+/+ + + + + + – – NV5G Chợ, Q3 200 Gan mủ Tròn, trắng đục –/+/+ + + + + + + – NV5M Chợ, Q3 200 Gan mủ Tròn, trắng đục –/+/+ + + + + + – – Đ1 ML, Q9 Bơi lờ đờ Tròn, suốt +/+/+ + + + + + + + 10 Đ2T ML, Q9 Bơi lờ đờ Tròn, trắng đục +/+/+ + + + + + + + 11 Đ2V ML, Q9 Bơi lờ đờ Tròn, trắng đục –/+/+ + + + + + + + 12 Đ3 ML, Q9 Bơi lờ đờ Tròn, trắng đục –/+/+ + + + + + + + #, khuẩn lạc mọc mơi trường TSA; dương tính, kháng: +; âm tính, khơng kháng: –; ND, khơng xác định; nt: 3.3 Kết kiểm tra độ nhạy kháng sinh Kết kiểm tra độ nhạy 12 chủng Vibrio non-Vibrio với loại kháng sinh cho kết kháng hầu hết loại kháng sinh (Bảng 1), cụ thể Clindamycin (11/12 chủng), Ampicillin (10/12), Tetracyline (9/12 chủng), Chloramphenicol (8/12 chủng), Cefalexin (10/12 chủng), Doxycycline (4/12 chủng) Mặc dù chủng phân lập nghiên cứu nhạy cảm với Ciprofloxacin (0/12), loại kháng sinh bị cấm sử dụng sản xuất kinh doanh thủy sản (Thông tư số 10/2016/TTBNNPTNT ngày 01/6/2016 Bộ Nơng nghiệp PTNT) (Bảng 3) Trong đó, hầu hết chủng vi khuẩn phân lập từ cá rô đồng nhạy cảm với kháng sinh Erythomycin (10/12 chủng) ngoại trừ chủng V3T NV5G, nhạy cảm với Amoxicillin (9/12) ngoại trừ chủng Đ1, Đ2T, Đ3, hai kháng sinh thuộc danh hạn chế sử dụng Tuy nhiên, theo kết nghiên cứu chúng tôi, chủng V2L, V2T, 1058 V7G, V7L, V3G, NV5G, NV5M kháng hoàn toàn với kháng sinh Amoxicillin (đường kính vịng kháng = 0), tương tự chủng Đ1, Đ2T, Đ2V, Đ3 phân lập từ cá rô đồng giống (Bảng 2) kháng hoàn toàn với kháng sinh Erythomycin Điều cho thấy rằng, cần nâng mức độ cảnh báo đề xuất cấm sử dụng hai loại kháng sinh Amoxicillin Erythomycin nuôi trồng thủy sản Đặc biệt, chủng vi khuẩn phân lập từ cá thương mại nghiên cứu nhạy cảm với kháng sinh Doxycycline (hiện không thuộc danh mục cấm hay hạn chế sử dụng), nhiên chủng Đ1, Đ2T, Đ2V Đ3 phân lập từ cá rô đồng giống (Bảng 2) có khả kháng loại kháng sinh này, cho thấy Doxycycline sử dụng điều trị bệnh cá rô đồng bắt đầu xuất chủng kháng Doxycycline Do đó, đề nghị cần thực thêm đánh giá nhiều chủng vi khuẩn phân lập từ lồi thủy hai sản có khà kháng Doxycycline Bảng Đặc điểm kháng kháng sinh chủng vi khuẩn phân lập từ cá rơ đồng Thí nghiệm Nồn g độ V2L V2T V7G V7L V3G V3T NV5G NV5M Đ1 Đ2T Đ2V Đ3 Các chủng phân lập từ cá rơ đồng Tình trạng# Kháng NaCl 4% + + + + + + + + + + + + 5% – – + + + – + – + + + + 6% – – – – – – – – + + + + Kháng sinh Clindamycin 10µ g - R R R R R R S R R R R R Ampicillin 10µ g Cấm R R R R R R R R S S R R Amoxicillin 25µ g Hạn chế R R R R R R R R S S R I Chloramphen icol 30µ g Cấm R R I R S R S R R S R R Ciprofloxacin 5µg Cấm S S S S S S S S S S S S Erythromycin 15µ g Hạn chế R R R R R S S R R R R R Doxycycline* 30µ g - S S S S S S S S R R R R Cefalexin 30µ g - R I R R R R S R R R R R Ratio (R/9) 7 *, following Biorad disc test with strain E coli ATCC 25922; +, kháng; –, không kháng S = Susceptible, I = Intermediate, R = Resistant; # Thông tư số 10/2016/TT-BNNPTNT ngày 01/6/2016 Bộ Nông nghiệp PTNT 1059 3.4 Kết thí nghiệm độc lực Kết cảm nhiễm nhân tạo 12 chủng vi khuẩn phân lập từ cá rơ đồng cho thấy 10/12 chủng gây chết cá với tỉ lệ chết từ 40-90% (Hình 2A) Theo kết trình bày hình 2, chủng Đ2V, Đ3, V7G, V3G cá bắt đầu chết ngày thứ sau tiêm Sau ngày tiêm, tỉ lệ cá chết 50% ghi nhận nhóm cá gây nhiễm Đ3, 60% nhóm tiêm V3G V7L Sau ngày cảm nhiễm, tỉ lệ cá chết cao ghi nhận nhóm gây nhiễm với chủng Đ2T (80%); V3G (80%); NV5M (90%); V7L (90%) mật độ 106 CFU/ml Trong đó, lơ đối chứng V2L, V2T cá hoạt động bình thường suốt thời gian thí nghiệm Vi khuẩn tái phân lập từ mẫu cá chết có tính đồng bước đầu xác định với đặc điểm hình thái giống chủng vi khuẩn gây cảm nhiễm ban đầu (Hình 2B, C) Mặc dù hai chủng Vibrio spp V2L V2T không gây chết cá thí nghiệm này, chúng thể khả kháng tương ứng 6/9 7/9 loại kháng sinh khảo sát Điều cho thấy khả chúng mang plasmid có nhiều loại gene kháng kháng sinh khác chuyển sang lồi vi khuẩn khác sau làm tăng cường độc lực loài gây bệnh (Aoki 1988, Cabello cộng sự, 2013) Ví dụ, plasmid chứa gene kháng với chloramphenicol, trimethoprim, sulphonamide tetracycline xác định mầm bệnh cá (McPhearson et al 1991) Các plasmid chuyển gene kháng với loại kháng sinh xác định từ vi khuẩn gây bệnh hai nhóm cá biển cá nước Vibrio anguillarum, V salmonicida, Aeromonas salmonicida, A hydrophila, Edwarsiella tarda Yersinia ruckeri (Aoki et al 1987; Crumlish et al 2002; Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 2008) Hình Kết gây cảm nhiễm với vi khuẩn phân lập từ cá rô đồng A, Tỉ lệ chết cá tiêm với 12 chủng vi khuẩn kháng đa kháng sinh B, Hình thái chủng NV5G C, Hình thái vi khuẩn tái phân lập từ cá chết nhóm cảm nhiễm với chủng NV5G Một số nhà nghiên cứu vấn đề nuôi trồng thủy sản nuôi trồng với mật độ cao, xuất nhiều trang trại tự phát thiếu biện pháp vệ sinh trại tạo điều kiện cho lây lan nhanh chóng tác nhân gây bệnh dẫn đến việc sử dụng kháng sinh dự phòng (Cabello 2006; Sørum 2006; Van 2005) Quá trình dẫn tới số bất lợi xuất vi khuẩn kháng kháng sinh môi trường nuôi trồng thủy sản xuất chủng kháng kháng sinh gây bệnh cá Điều 1060 dẫn đến việc chuyển gene kháng thuốc từ thủy sản sang nhóm vi khuẩn động vật cạn gây bệnh người, làm thay đổi hệ vi sinh vật trầm tích cột nước (Cabello 2004; Huys et al 2001; Holmström et al 2003; Lê cộng 2005) KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Nghiên cứu 30 chủng phân lập từ cá rơ đồng chủng Vibrio (10/30 chủng) non-Vibrio (20 chủng) 11/12 chủng có khả kháng với NaCl 4%, kháng năm loại kháng sinh (trong tổng số loại kháng sinh thử nghiệm) Những chủng vi khuẩn có khả gây chết cá thí nghiệm cảm nhiễm với cá rơ đồng Do đó, chủng vi khuẩn kháng kháng sinh gây bệnh đặc biệt khó kiểm sốt Hiện tượng chí trở nên nghiêm trọng thực tế nhiều gene kháng thuốc truyền plasmid gây ảnh hưởng hiệu điều trị bệnh thủy sản (Aoki 1988) Quá trình dẫn tới số bất lợi xuất vi khuẩn kháng đa kháng sinh môi trường nuôi trồng thủy sản xuất chủng kháng kháng sinh gây bệnh cá nghiên cứu Để hiểu rõ nguy phát tán đặc tính kháng kháng sinh chủng vi khuẩn nghiên cứu này, nghiên cứu cần làm sáng tỏ chế làm xuất hiện tượng siêu kháng, phân tích đặc điểm phân tử gene kháng thuốc Ngồi ra, có nhu cầu nghiêm ngặt để kiểm sốt việc sử dụng thuốc dự phịng chữa bệnh chất chống vi trùng nuôi trồng thủy sản Việt Nam Cùng quan điểm với Lim cs (2016), kết luận yêu cầu nghiêm ngặt để kiểm soát việc sử dụng kháng sinh dự phòng điều trị bệnh nuôi trồng thủy sản Việt Nam cần thiết hạn chế bùng phát dịch bệnh cộng đồng tổn thất kinh tế gây chủng có độc lực cao kháng đa loại kháng sinh TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Al Faruk; Amir Hossain; et al 2018 Asian Australas J Biosci Biotechnol 3(2): 93-105 [2] Nguyễn Hữu Thịnh, Bùi Thị Kim Cương, Đỗ Viết Phương, 2011 Khoa Thủy Sản, Trường Đại học Nông Lâm TP HCM [3] Nguyễn Duy Khương, 2011 Luận văn tốt nghiệp đại học Đại học Cần Thơ [4] Phạm Thị Thùy Mỹ, 2011 Luận văn tốt nghiệp đại học Đại học Cần Thơ [5] Từ, T.D., Huỳnh, T.N.T Nguyễn, K.D Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 26 (2013): 96-103 [6] Đặng, T.H.O, Trương, Q.N., Nguyễn, Đ.H Tạp chí Khoa học 2012:22c 194-202 [7] Hossain, M.S., et al 2017 International Journal of Fisheries and Aquatic Studies 5(3): 520-524 [8] Dung T.T, Haesebrouck, F., Tuấn N.A., Sorgeloos P., Baele M., Decostere A 2010 Tạp chí Khoa học ĐH Cần Thơ:15a 162-171 [9] Cabello F.C, Godfrey H.P, Tomova A., Ivanova L., Dölz H., Millanao A., Buschmann A.H 2013 Environ Microbiol 15:1917–1942 [10] Aoki T 1988 Microbiol Sci 5: 219-223 [11] Mc Phearson, R.M., et al Aquaculture 99, Issues 3–4, December 1991, Pages 203-211 [12] Aoki T and Takahashi A 1987 Antimicrob Agents and Chemother 31: 1278-1280 1061 [13] Crumlish M., Dung T.T., et al 2002 J Fish Dis 25: 733- 736 [14] Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 2008 Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, USA [15] Cabello F.C 2006 Environ Microbiol 8: 1137-1144 [16] Sørum H 2006 American Society for Microbiology Press, Washington, DC, USA, pp 213-238 [17] Van P.T 2005 Chiang May, Thạland ISBN 88-901344-3-7 [18] Holmstrưm K., Graslund S., Wahlstrom A., Poungshompoo S., Bengtsson B and Kautsky N 2003 In J Food Sci Tech 38: 255-266 [19] Huys, G., Gevers D., Temmerman R., Cnockaert M., Denys R., Rhodes G., Pichup R., McGann P., Hiney M., Smith P and Swings J 2001 Syst Appl Microbiol 24: 122-130 [20] Le, T.X., Munekage Y., Kato S.I 2005 Total Environ 349: 95-105 [21] Cabello, F.C 2004 Fundacion Terram Analisis de Politicas Publicas 17: 11-16 [22] Lim, Y.J., Kim, D.H., et al 2016 Aquacult Int 24, 1153-1161 1062 ... 2008) Hình Kết gây cảm nhiễm với vi khuẩn phân lập từ cá rô đồng A, Tỉ lệ chết cá tiêm với 12 chủng vi khuẩn kháng đa kháng sinh B, Hình thái chủng NV5G C, Hình thái vi khuẩn tái phân lập từ cá. .. Các vi khuẩn phân lập có khả phát triển đa dạng mơi trường TSB có bổ sung NaCl (16%) (Bảng 1) Bảng Đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập từ cá rô đồng STT Code Địa điểm. .. cần thực thêm đánh giá nhiều chủng vi khuẩn phân lập từ lồi thủy hai sản có khà kháng Doxycycline Bảng Đặc điểm kháng kháng sinh chủng vi khuẩn phân lập từ cá rơ đồng Thí nghiệm Nồn g độ V2L V2T