Đang tải... (xem toàn văn)
Lan một lá (Nervilia fordii (Hance) Schlechter) thuộc chi Lan một lá (Nervilia), họ Lan (Orchidaceae) chứa terpenoids, flavonoid, axit amin và một số loại dầu dễ bay hơi. Các hợp chất này có hoạt tính dược lý chống viêm, chống virus và giảm đau, giảm ho, hen suyễn và viêm phế quản mãn tính. Sử dụng phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, kết hợp với phân tích trình tự ITS của 2 mẫu Lan một lá thu thập tại Cao Bằng và Thái Nguyên cho thấy, các mẫu đều thuộc loài N. fordii (Hance) Schlechter.
BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ DOI: 10.15625/vap.2020.00026 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ TRÌNH TỰ ITS CỦA LAN MỘT LÁ (Nervilia fordii (Hance) Schlechter) THU THẬP TẠI CAO BẰNG VÀ THÁI NGUYÊN Nguyễn Thị Tâm1,*, Trần Thị Thùy Linh2 Tóm tắt: Lan (Nervilia fordii (Hance) Schlechter) thuộc chi Lan (Nervilia), họ Lan (Orchidaceae) chứa terpenoids, flavonoid, axit amin số loại dầu dễ bay Các hợp chất có hoạt tính dược lý chống viêm, chống virus giảm đau, giảm ho, hen suyễn viêm phế quản mãn tính Sử dụng phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, kết hợp với phân tích trình tự ITS mẫu Lan thu thập Cao Bằng Thái Nguyên cho thấy, mẫu thuộc lồi N fordii (Hance) Schlechter Hình thái hai mẫu Lan LML-01-TN thu Thái Nguyên LML-02-CB thu Cao Bằng giống Trình tự vùng ITS hai mẫu Lan thu thập Cao Bằng Thái Nguyên có hệ số tương đồng 100% so với trình tự vùng ITS N fordii (Hance) Schlechter mang mã số JX011630 GenBank Từ khóa: Nervilia fordii, hình thái, ITS, Lan lá, Cao Bằng, Thái Nguyên MỞ ĐẦU Lan (Nervilia fordii (Hance) Schlechter) thuộc chi Nervilia, họ Lan (Orchidaceae) phân bố rải rác tỉnh miền núi phía Bắc Lan thường mọc kẽ núi đá, nơi thấp ẩm ướt, bóng to đám cỏ dày đặc Lan chứa terpenoids, flavonoid, axit amin số loại dầu dễ bay Các hợp chất có hoạt tính dược lý chống viêm, chống vi rút giảm đau, giảm ho, hen suyễn viêm phế quản mãn tính Do nạn chặt phá rừng bị khai thác để bán làm thuốc khiến cho loài trở nên quý có nguy bị đe dọa tuyệt chủng Lan ghi vào danh sách loài cần bảo vệ “Sách Đỏ Việt Nam” Bộ Khoa học Công nghệ (2007) Gần đây, nghiên cứu phân loại thực vật mức độ loài, vùng ITS (Internal transcribed spacer) locus giải mã phổ biến Ở mức độ loài, vùng ITS có độ đa dạng cao (khoảng 13,6% loài gần gũi) Vùng gen ITS bao gồm locus riêng biệt ITS1 ITS2 nối với qua locus 5.8S Nghiên cứu Huang et al (2012) cho thấy, phương pháp nhận dạng Nervilia fordii thơng qua phân tích trình tự ITS2 ITS2 thị sinh học hiệu việc nhận dạng Nervilia fordii Huang et al (2013) nghiên cứu mã vạch DNA phổ biến ITS2, rbcL, matK LSUD1-D3 để xác định loài Nervilia fordii sáu loài chi Nervilia Kết cho thấy, ITS2 có khả phân biệt lồi chi Nervilia đứng sau matK, rbcL LSU D1-D3 1Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên Trung học phổ thông Gang thép Thái Nguyên *Email: tamnt@tnue.edu.vn 2Trường PHẦN I NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 217 Cho đến nay, Việt Nam chưa có cơng trình nghiên cứu đặc điểm trình tự ITS Lan N fordii (Hance) Schlechter Nghiên cứu đề cập đến số đặc điểm hình thái trình tự vùng ITS Lan với mục tiêu góp phần tư liệu hóa nguồn gen loại xây dựng mã vạch DNA VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu: Mẫu Lan thu thập hai khu vực xã Bộc Nhiêu, huyện Định Hóa, tỉnh Thái Nguyên (LML-01-TN) xã Bình Dương, huyện Hịa An, tỉnh Cao Bằng (LML-02-CB) dùng làm vật liệu nghiên cứu Phương pháp xác định tên khoa học: Để xác định tên khoa học Lan lá, sử dụng phương pháp so sánh hình thái Căn vào đặc điểm quan sinh dưỡng quan sinh sản, đối chiếu với mẫu type chuẩn tài liệu chuyên khảo họ Lan (Orchidaceae) Phạm Hoàng Hộ (2003), Chen et al (2009) Bộ Khoa học Công nghệ (2007) để định loại Phương pháp xác định trình tự vùng ITS: DNA tổng số tách chiết Kit GeneJET Plant Genomic DNA Purification (K0791) DNA tổng số sau kiểm tra điện di bảo quản -20C cho thí nghiệm Vùng ITS khuếch đại kĩ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu (ITS-F, ITS-R) công bố website: http://www.kew.org/barcoding/protocols.html có trình tự: ITS-F 5’ ATGCGATACTTGGTGAAT 3’ ITS-R 5’ GACGCTTCTCCAGACTACAAT 3’ Kích thước đoạn DNA dự kiến khoảng 500bp Tổng thể tích phản ứng PCR 15 µl, bao gồm: 7,5 µl PCR Masster Mix 2X, 0,5 µl mồi xi 10 pmol/µl, 0,5 µl mồi ngược 10 pmol/µl, 0,5 µl DNA khn 50-100 ng/µl, µl nước cất khử ion vô trùng Phản ứng thực máy PCR eppendorf (Đức) Chu trình nhiệt: Biến tính 95 oC phút, 35 chu kỳ [95 oC 30 giây, 56 oC 30 giây, 72 oC 30 giây], 72 oC 10 phút lưu giữ oC Sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 0,8% đệm TAE 1X Bản gel nhuộm ethidium bromide 3-5 phút, soi ánh sáng tử ngoại 254 nm Sản phẩm PCR tinh Kit GenJET PCR Purification theo hướng dẫn hãng Thermo Scientific Trình tự nucleotit vùng ITS xác định máy giải trình tự ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer, sử dụng Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing với cặp mồi đặc hiệu (ITS-F, ITS-R) Sau phân tích, so sánh chương trình Bioedit, BLAST, DNAstar KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Đặc điểm hình thái mẫu Lan thu thập Thái Nguyên Cao Bằng Để xác định tên khoa học, mô tả chi tiết đặc điểm hình thái quan sinh dưỡng quan sinh sản mẫu thu Thái Nguyên Cao Bằng (Bảng 1) Căn vào đặc điểm hình thái, đối chiếu với mẫu type chuẩn tài liệu chuyên khảo họ Orchidaceae Phạm Hoàng Hộ (2003), Chen et al (2009), Bộ Khoa học Công nghệ (2007), kết luận rằng, hai mẫu thu Thái Nguyên BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM 218 Cao Bằng có hình thái hồn toàn giống loài Lan với tên khoa học N fordii (Hance) Schlechter Bảng Các đặc điểm hình thái mẫu Lan thu Thái Nguyên Cao Bằng Đặc điểm hình thái Mẫu LML-01-TN thu Mẫu LML-02-C B thu Thái Nguyên Cao Bằng Chiều cao 10 – 20 cm 10 – 20 cm Số lượng củ/1 (số có củ) (số có củ) Màu sắc củ Trắng xám Trắng xám Hình dạng đường kính củ Trịn bầu dục Tròn bầu dục 0,7 - 1,2 cm 0,7 - 1,2 cm Số đốt phần củ 3-5 3-5 Hình dạng Tim rộng Tim rộng Đường kính 3-6 cm 3-6 cm Màu sắc Mặt màu xanh nhạt, mặt Mặt màu xanh nhạt, (mặt mặt dưới) màu tía mặt màu tía Kích thước cuống - 18 cm - 18 cm Kiểu gân Hình chân vịt tỏa từ gốc Hình chân vịt tỏa từ đến mép gốc đến mép Đặc điểm mép Uốn lượn Uốn lượn Kích thước cụm hoa 13-18 cm 13-18 cm Màu sắc hoa Trắng có đốm tím hồng Trắng có đốm tím hồng Đặc điểm cánh hoa môi thuỳ, thuỳ nhọn trịn, mơi thuỳ, thuỳ nhọn trịn, có lơng có lơng Quả Nang, hình thoi có múi Nang, hình thoi có múi a b c Hình Ảnh chụp Lan (N fordii (Hance) Schlechter) (a) hình thái thân, rễ, lá, củ (b, c) Đặc điểm hình thái Lan (N fordii (Hance) Schlechter): Cây thân thảo, chiều cao từ 10 - 20 cm Mỗi có 1-2 củ; củ có màu trắng xám, hình trịn, đường kính từ 0,7 1,2 cm, phần củ có - đốt, có số rễ ngắn số rễ dài; củ hình thành đầu tận rễ dài Mỗi có lá; có dạng hình tim, đường kính từ - cm, có màu xanh nhạt mặt; cuống dài từ - 18 cm; gân hình chân vịt PHẦN I NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 219 tỏa từ gốc đến mép lá; mép uốn lượn Hoa mọc thành chùm , màu trắng có đốm tím hồng, xuất trước mọc Lá đài cánh hoa giống Cánh môi thuỳ, thuỳ nhọn trịn, có lơng dày Quả nang, hình thoi có múi 3.2 Đặc điểm trình tự vùng ITS phân lập từ mẫu Lan thu thập Thái Nguyên Cao Bằng Kết nhân vùng ITS phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu ITS-F/ITS-R từ DNA hệ gen hai mẫu LML-01-TN LML-02-CB kiểm tra điện di gel agarose 0,8% cho thấy, mẫu Lan xuất băng DNA với kích thước ước tính khoảng 500bp (Hình 2) Sau khuếch đại, sản phẩm PCR tinh xác định trình tự máy giải trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer, sử dụng Kit BigDye®Terminator v3.1 Cycle Sequencing Hình Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân vùng ITS (M: DNA marker; 1: vùng ITS từ mẫu LML-01-TN ; 2: vùng ITS từ mẫu LML-02-CB) Kết xác định trình tự vùng ITS từ mẫu LML-01-TN mẫu LML-02-CB có 450 nucleotit Số lượng, tỉ lệ loại nucleotit thể bảng Bảng Số lượng tỉ lệ loại nucleotit vùng ITS từ mẫu LML-01-TN mẫu LML-02-CB ITS-02-CB ITS-01-TN Nucleotit Số lượng Tỉ lệ % Số lượng Tỉ lệ % A 84 18,67 85 18,89 C 131 29,11 132 29,33 G 164 36,44 161 35,78 T 71 15,78 72 16,00 Tiến hành phân tích tương đồng trình tự vùng ITS mẫu Lan LML-01TN LML-02-CB với 13 trình tự vùng ITS GenBank chương trình so sánh tương đồng BLAST NCBI thu kết Hình Hình Kết cho thấy, trình tự vùng ITS phân lập từ mẫu Lan LML-01-TN LML-02-CB có độ tương đồng 90% so với 13 trình tự vùng ITS GenBank mẫu thuộc chi Nervilia Như vậy, kết so sánh BLAST NCBI khẳng định trình tự phân lập từ mẫu Lan LML-01-TN LML-02-CB vùng ITS Kết so sánh trình tự ITS cho biết mẫu nghiên cứu thuộc chi Nervilia 220 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Hình Kết phân tích tương đồng trình tự vùng ITS Lan LML-02-CB với số trình tự vùng ITS GenBank BLAST NCBI Hình Kết phân tích tương đồng trình tự vùng ITS Lan LML-01-TN với số trình tự vùng ITS GenBank BLAST NCBI Kết so sánh trình tự nucleotit vùng ITS hai mẫu Lan LML-01TN, LML-02-CB với hai trình tự vùng ITS mang mã số JX011630 JX011631 GenBank phần mềm BioEdit thể Hình Kết so sánh trình tự nucleotit Hình cho thấy, trình tự vùng ITS hai mẫu Lan LML-01-TN, LML-02-CB so với trình tự JX011630 khơng có sai khác nào, so với trình tự JX011631 khác vị trí nucleotit vị trí nucleotit thứ 173 (C thay G) Đặc biệt, trình tự vùng ITS hai mẫu LML-01-TN mẫu LML-02- PHẦN I NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 221 CB có hệ số tương đồng 100 % so với trình tự vùng ITS loài N fordii (Hance) Schlechter mang mã số JX011630 GenBank Từ kết xác định, so sánh trình tự vùng gen ITS xác định mẫu loài N fordii (Hance) Schlechter phù hợp với định danh hình thái Hình So sánh trình tự ITS mẫu LML-01-TN, LML-02-CB hai trình tự mang mã số JX011630 JX011631 GenBank KẾT LUẬN Hình thái hai mẫu Lan LML-01-TN thu Thái Nguyên LML-02-CB thu Cao Bằng giống xác định thuộc loài Lan (N fordii (Hance) 222 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Schlechter) Kết so sánh trình tự vùng gen ITS xác định mẫu loài N fordii (Hance) Schlechter phù hợp với định danh hình thái Trình tự vùng ITS hai mẫu Lan thu thập Cao Bằng Thái Nguyên có hệ số tương đồng 100 % so với trình tự vùng ITS N fordii (Hance) Schlechter mang mã số JX011630 GenBank Trình tự ITS sử dụng thị quan trọng việc giám định mẫu Lan phục vụ bảo tồn phát triển nguồn gen Lan - loài dược liệu có nguy bị tuyệt chủng TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Khoa học Công nghệ (2007) Sách Đỏ Việt Nam (phần I: Thực vật) Nxb Khoa học tự nhiên Công nghệ, Hà Nội, 456 - 457 Chen X., Liu Z., Zhu G., Lang K., Ji Z., Luo Y B., Jin X., Cribb P.J., Wood J J., Gale S W., Ormerod P., Vermeulen J J., Wood H P., Clayton D & Bell A (2009) Orchidaceae: Flora of China, vol 25, Missouri Botanical Garden Press: 1- 45 Huang Q., Ma X., He R., Zhan R., Chen W., 2012 Molecular Identification of Nervilia fordii Hance Schltr and its adulterants based on lTS2 DNA barcodes Biotechnology Bulletin, 0(12), pp: 173-179 Huang Q., Liang L., He R., Ma X., Zhan R., Chen W., 2013 Applying DNA barcoding to identify Nervilia fordii and six congeneric species, POJ 6(5):325-332 ISSN:1836-3644 Phạm Hoàng Hộ, 2003 Cây cỏ Việt Nam, tập 3, Nhà xuất trẻ, Thành phố Hồ Chí Minh,760 - 968 MORPHOLOGICAL CHARACTERISTICS AND ITS SEQUENCE ISOLATED FROM Nervilia fordii (Hance) Schlechter COLLECTED IN CAO BANG AND THAI NGUYEN PROVINCE Nguyen Thi Tam1,*, Tran Thi Thuy Linh2 Abstract: Nervilia fordii (Hance) Schlechter, which belongs to the genus Nervilia in the family Orchidaceae, contains terpenoids, flavonoids, amino acids and some volatile oils These subtances have anti-inflammatory and anti-viral activities as well as reduce pain, cough, asthma and chronic bronchitis Combining the research results on morphological characteristics and ITS sequences analysis of samples collected in Cao Bang and Thai Nguyen province shows that the samples were both identified as N fordii (Hance) Schlechter Morphological characteristics of two samples, LML-01-TN collected in Thai Nguyen and LML-02-CB collected in Cao Bang, are similar ITS sequences of both samples have homologous rate of 100 % compared to that of N fordii (Hance) Schlechter in GenBank, which had accession number JX011630 Keywords: Nervilia fordii (Hance) Schlechter, ITS, morphology, Cao Bang province, Thai Nguyen province 1Thai Nguyen University of Education Nguyen Iron and Steel High School *Email: tamnt@tnue.edu.vn 2Thai ... danh hình thái Trình tự vùng ITS hai mẫu Lan thu thập Cao Bằng Thái Nguyên có hệ số tương đồng 100 % so với trình tự vùng ITS N fordii (Hance) Schlechter mang mã số JX011630 GenBank Trình tự ITS. .. (Hance) Schlechter Bảng Các đặc điểm hình thái mẫu Lan thu Thái Nguyên Cao Bằng Đặc điểm hình thái Mẫu LML-01-TN thu Mẫu LML-02-C B thu Thái Nguyên Cao Bằng Chiều cao 10 – 20 cm 10 – 20 cm Số lượng... danh hình thái Hình So sánh trình tự ITS mẫu LML-01-TN, LML-02-CB hai trình tự mang mã số JX011630 JX011631 GenBank KẾT LUẬN Hình thái hai mẫu Lan LML-01-TN thu Thái Nguyên LML-02-CB thu Cao Bằng