Giá trị các mẫu bệnh phẩm và mật độ vi rút trong chẩn đoán và tiên lượng bệnh tay chân miệng

Nghiên cứu thực hiện những mục tiêu sau: 1) So sánh tỉ lệ dương tính với EV, EV71 ở các mẫu bệnh phẩm: Phết họng, phết bóng nước, phết trực tràng và dịch não tủy; 2) Phân tích sự thay đổi tỉ lệ EV71/EV theo tháng nhằm tìm hiểu mối tương quan giữa tỉ lệ nhiễm EV71 với dịch BTCM; 3) Phân tích tương quan giữa nồng độ vi rút trong các mẫu bệnh phẩm với biến chứng.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 GIÁ TRỊ CÁC MẪU BỆNH PHẨM VÀ MẬT ĐỘ VI RÚT TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ TIÊN LƯỢNG BỆNH TAY CHÂN MIỆNG Tăng Chí Thượng*, Nguyễn Thanh Hùng*, Lê Quốc Thịnh*, Trương Hữu Khanh*, Đỗ Văn Niệm*, Lê Anh Tuấn*, Nguyễn Thị Ngọc Dung*, Nguyễn Ngọc Hạnh* TÓM TẮT Mục tiêu: 1) So sánh tỉ lệ dương tính với EV, EV71 mẫu bệnh phẩm: phết họng, phết bóng nước (PBN), phết trực tràng (PTT) dịch não tủy (DNT); 2) Phân tích thay đổi tỉ lệ EV71/EV theo tháng nhằm tìm hiểu mối tương quan tỉ lệ nhiễm EV71 với dịch BTCM; 3) Phân tích tương quan nồng độ vi rút (NĐVR) mẫu bệnh phẩm với biến chứng Phương pháp: Nghiên cứu thực phản ứng RT-PCR Real-time RT-PCR trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm phết họng, phết trực tràng dịch não tủy bệnh nhân có biểu lâm sàng bệnh tay chân miệng, theo qui trình chuẩn đoạn mồi Viện nghiên cứu sức khỏe quốc gia Đài Loan – Trung Quốc cung cấp Kết quả: Phản ứng có độ lập lại tốt độ xác cao Mật độ vi rút bệnh phẩm có tương quan tuyến tính nằm giới hạn từ 102-105copies/ml Trong loại bệnh phẩm, mẫu phết họng có tỉ lệ dương tính cao (84,5%), phết trực tràng (55,2%) dịch não tủy (40,2%) Phân tích giá trị trung bình mật độ vi rút mẫu phết họng, phết trực tràng dịch não tủy cho thấy khơng có khác biệt nhóm có khơng có biến chứng Sự gia tăng tỉ lệ EV71/EV theo mốc thời gian năm có liên quan khơng rõ với cao điểm BTCM năm không tương quan với tỉ lệ biến chứng Kết luận: Qui trình chẩn đốn EV71 bước thiết lập có khả phát EV EV71 cao với tỉ lệ tương ứng 84,5% 36,7% mẫu bệnh phẩm phết họng Đây mẫu bệnh phẩm có tỉ lệ dương tính cao nhất, lấy mẫu đơn giản nên áp dụng thường qui lâm sàng Chưa thấy mối tương quan rõ NĐVR với khả gây biến chứng EV71 chưa xác định tương quan gia tăng tỉ lệ EV71/EV với cao điểm BTCM Từ khóa: enterovirus 71, bệnh tay chân miệng, Real-time RT-PCR ABSTRACT THE VALUE OF SPECIMENS AND VIRAL LOAD IN DIAGNOSIS AND PROGNOSIS OF HANDFOOT-MOUTH DISEASE Tang Chi Thuong, Nguyen Thanh Hung, Le Quoc Thinh, Truong Huu Khanh, Do Van Niem, Le Anh Tuan, Nguyen Thi Ngoc Dung, Nguyen Ngoc Hanh * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 94 - 101 Study objectives: 1) Determine EV and EV71- positive rates in various specimens: pharyngeal swab, vesicle swab, rectal swab abd cerebrospinal fluid; 2) Determine the correlation between EV71 infection and HFMD outbreak based on the the increased proportion of EV71 infections among all EV infections; 3) Analyze the correlation between virus load and the occurance of complications Method: Detection EV71-RNA directed from clinical samples as pharyngeal swab, rectal swab and CSF in patients with HFMD by RT-PCR and Real-time RT-PCR, following standard protocol and primer of Taiwan National Health Research Institute * Bệnh viện Nhi Đồng Tác giả liên lạc: ThS.BS Lê Quốc Thịnh ĐT: 0903645557 94 Email: thinhlequoc@yahoo.com Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng - Năm 2011 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học Results: the test has been proved with good iterativeness and high accuracy Virus load has linear correlation in range 102-105 copies/ml The means of virus load in pharyngeal swab, rectal swab and CSF are not statistically different between non-complication and complicated group The increase of EV71 infection proportion among all EV infections by time is unclearly related with HFMD outbreaks annually and not related with the occurance of complications Conclusions: the three-step diagnosis process for EV71 has been proved valid to detect EV and EV71 infections with the positive rate of 84.5% and 36.7% respectively in pharyngeal swab Pharyngeal swab is the specimen with highest positive rate and easy to take so it is applicable routinely in clinical setting The correlation between virus load and EV71-induced complications is not clear and it is the same with the correlation between the increase of EV71 infections among all EV infections with the outbreak of HFMD Key words: enterovirus 71, hand-foot-mouth disease, Real-time RT-PCR đốn với độ xác cao phương pháp ĐẶT VẤN ĐỀ khuếch đại chuỗi gen (Polymerase Chain Enteroviruses (EVs) giống thuộc họ Reation: PCR) trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm Picornaviridae Đây vi rút có so sánh với phương pháp nuôi cấy(1,8,10,11,12) chuỗi đơn RNA chia thành 68 týp huyết thanh, Nghiên cứu thực nhằm đánh gồm nhóm echoviruses, coxsackie virus, giá khả chẩn đoán phương pháp PCR polioviruses, enterovirus (EV) từ týp trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm, giúp chẩn đốn huyết 68 đến 71(3) Trong coxackie A16 nhanh góp phần dự báo dịch xác định mối (CA16) enterovirus 71 (EV71) hai tác nhân tương quan nồng độ vi rút với biến chứng gây bệnh tay chân miệng (BTCM) trẻ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU em(5,7) BTCM EV71 gây biến chứng nguy So sánh tỉ lệ dương tính với EV, EV71 hiểm viêm thân não, viêm tim, phù phổi mẫu bệnh phẩm: phết họng, phết bóng cấp; diễn tiến bệnh nặng nhanh tử vong nước (PBN), phết trực tràng (PTT) dịch não cao Từ năm 2002 – 2003, Bệnh Viện Nhi tủy (DNT) Đồng (BVNĐ1) phát nhiều ca viêm Phân tích thay đổi tỉ lệ EV71/EV theo não tối cấp, gây tử vong nhanh trẻ nhỏ tháng nhằm tìm hiểu mối tương quan tỉ lệ tuổi có liên quan đến BTCM(13,4).Qua nghiên nhiễm EV71 với dịch BTCM cứu BVNĐ1 phối hợp với Viện Pasteur TP Phân tích tương quan nồng độ vi rút Hồ Chí Minh (TP.HCM), lần phân (NĐVR) mẫu bệnh phẩm với lập EV71 phân trẻ BTCM có biến biến chứng chứng viêm não Việt nam vào ngày 04 tháng VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP năm 2003(4) Số ca mắc BTCM gia tăng hàng năm, với vài nghìn trường hợp nhập viện Bệnh phẩm năm Nghiên cứu tác nhân BTCM phối Các mẫu bệnh phẩm DNT, phết họng, PTT hợp BVNĐ1 Viện Pasteur TP.HCM năm lấy ngày thứ 2-4 bệnh, tách chiết 2005 phương pháp nuôi cấy xác định theo qui trình, lưu giữ nhiệt độ âm 70OC cho tác nhân CA16 EV71, tới thực phản ứng EV71 chiếm tỉ lệ 46%(9) Phương pháp nuôi cấy vi rút cần 1-2 tuần để thực hiện, với chi phí cao nên thực nghiên cứu có giá trị ứng dụng lâm sàng, khả dự báo dịch chậm Những nghiên cứu gần cho thấy khả chẩn Hệ thống chuẩn chứng dương Hệ thống chuẩn dựa vào chuẩn gốc Viện Nghiên Cứu Sức Khỏe Quốc Gia Đài LoanTrung Quốc (National Health Research Institute: NHRI) cung cấp dạng dung dịch có nồng Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng - Năm 2011 95 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 độ 1010 copies/ml Dùng chuẩn pha loãng thành nồng độ chuẩn cho phép định lượng EVs-RNA làm chứng dương cho phản ứng Revere transcriptase PCR (RT-PCR) định tính Để có mẫu chuẩn, chúng tơi dùng bệnh phẩm có phản ứng PCR dương tính mạnh với EV (băng điện di sáng rõ nét) trộn lẫn với (khoảng 5ml) bảo quản -70oC Sau ly trích RNA-EV bệnh phẩm theo phương pháp Boom (QIAmpMinElute Virus Kit), phân chia RNA ly trích thành nhiều tube 30 l, lưu giữ -70oC Lấy tube chạy RealTimePCR với chứng gốc pha lỗng tìm nồng độ mẫu chuẩn Pha loãng mẫu chuẩn chọn độ pha lỗng có nồng độ tương ứng từ 102 đến 107 copies/ml làm nồng độ chuẩn để thực gam chuẩn chứng dương cho phản ứng Realtime-PCR Ly trích EVs-RNA Dựa nguyên tắc điều kiện biến tính cao nhiệt độ nâng lên, tác động QIAGEN Protease dung dịch đệm AL với bất hoạt men RNAse làm màng tế bào vi rút bị phá vỡ để phóng thích RNA Các RNA gắn kết tối đa vào màng silica cho thêm ethanol vào phản ứng Các protein chất khác (làm ức chế phản ứng men chuỗi phản ứng PCR) không bám màng silica bị loại bỏ sau rửa ly tâm hai lần Cuối RNA tinh thu giữ dung dịch đệm thích hợp 8.000 rpm phút Chuyển qua tube thứ 4, cho thêm vào 500 l ethanol (96-100%), ly tâm 8.000 rpm phút Chuyển qua tube thứ 5, ly tâm 14.000 rpm phút Sau chuyển MinElute Column qua tube Eppendorf 1.5ml mới, mở nắp ủ nhiệt độ phòng thí nghiệm phút Thêm 30 l AE (nước cất khơng có RNAse), ủ nhiệt độ phòng thí nghiệm 10 phút Sau ly tâm 14.000 rpm phút, cẩn thận hút 30 l vào tube Eppendorf 1.5ml Dùng 10 l dung dịch cho phản ứng Realtime-PCR Chứng âm Sử dụng môi trường vận chuyển làm chứng âm ly trích dung dịch TE1X làm chứng âm cho phản ứng Realtime-PCR Định tính EV-RNA EV71-RNA kỹ thuật RT-PCR Hai cặp mồi đặc hiệu cho EV (EV-F EV-R) EV71 (F-primer1705 R-primer 2036) thiết kế nằm vùng VP1 EV EV71 genome cho sản phẩm khuếch đại theo thứ tự 148bp 331bp NHRI cung cấp Trình tự đoạn mồi sử dụng nghiên cứu cụ thể sau: EV-F: 5'-CCCCTGAATGCGGCTAATC-3' EV-R: 5'-GATTGTCACCATAAGCAGC-3' F-primer1705: GTGGCAGATGTGATTGAGAG-3' 5'5'- Cách thực R-primer 2036: GTTATGTCTATGTCCCAGTT-3' Cho vào tube Eppendorf nắp khóa 1,5ml: 200 l bệnh phẩm, 25 l Protease, 200 l dung dịch đệm AL (chứa RNA carrier) Vortex kỹ 15 giây, sau ủ 56OC 15 phút Ly tâm nhẹ, cho thêm vào 250 l ethanol nồng độ từ 96-100% Vortex kỹ 15 giây, sau ủ nhiệt độ phòng thí nghiệm phút Ly tâm nhẹ, chuyển tất dung dịch vào MinElute Column (QIAgen), ly tâm 8.000 rpm phút Chuyển qua tube thứ 2, cho thêm vào 500 l AW1, ly tâm 8.000 rpm phút Chuyển qua tube thứ 3, cho thêm vào 500 l AW2, ly tâm Sử dụng cặp mồi EV-F EV-R phản ứng RT-PCR thuốc thử OneStep RT-PCT (Qiagen, USA) Phương pháp khuếch đại định tính EV thực tube PCR 0.2ml với thể tích dung dịch 25µl chứa 5µl MgCl2, 1µl EV-R, 1µl EV-F, 1µl enzymes, 5µl RNA ly trích Phản ứng RT-PCR thực máy luân nhiệt Genius (Techne, England) với trình tự bước sau 50oC/30 giây chu kỳ, 95oC/5 phút chu kỳ; 40 chu kỳ với 96 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng - Năm 2011 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 94oC/30 giây, 58oC/30 giây, 72oC/01 phút; cuối 72oC/10 phút chu kỳ Sản phẩm khuếch đại PCR quan sát ánh sáng UV sau điện di thạch 1,5% chuẩn bị với dung dịch đệm 0.5X TBE Các mẫu dương tính thực tiếp phản ứng RT-PCR với cặp mồi F-primer 1705 Rprimer 2036 máy luân nhiệt Genius (Techne, England) với trình tự bước sau 50oC/30 giây chu kỳ, 95oC/5phút chu kỳ; 40 chu kỳ với 94oC/30 giây, 50oC/30 giây, 72oC/01 phút; cuối 72oC/10 phút chu kỳ Tương tự trên, sản phẩm khuếch đại PCR quan sát ánh sáng UV sau điện di thạch 1,5% chuẩn bị với dung dịch đệm 0.5X TBE Mỗi lần thực phản ứng RT-PCR chạy kèm theo chứng dương hai chứng âm (một chứng âm ly trích chứng âm phản ứng PCR) Định lượng EV71-RNA kỹ thuật REAL-TIME PCR với đoạn dò TAQMAN Thử nghiệm Realtime-PCR phân tích máy LightCyler (Roche Diagnostics) Bộ thuốc thử LightCycler RNA Amplification Kit Hybprobe (Roche Diagnostics) sử dụng phản ứng Đây thuốc thử cho phép sử dụng bước Realtime-PCR ống mao quản 10µl có chứa 0.4µl MgCl2, 0.5µl EV-F, 0.5µl EV-R, 0.1µl TaqMan Hybprobe, 0.2 µl enzymes, µl RNA ly trích Phản ứng RealtimePCR thực với bước sau: 55oC/20 phút chu kỳ, 95oC/30 giây chu kỳ; 45 chu kỳ với 95oC/5 giây, 57oC/15 giây, 72oC/6 giây; cuối 40oC/30 giây chu kỳ Để tiêu chuẩn hóa phản ứng, lần thực Realtime-PCR EV71 kèm theo bốn nồng độ chuẩn có nồng độ từ 102 đến 105 chứng âm TE1X Phân tích liệu nhờ vào phần mềm hệ thống máy LightCycler 1.5 (Roche Diagnostics) Dữ liệu thu nhận giai đoạn bắt cặp Nghiên cứu Y học kéo dài (57oC) chu kỳ; chu kỳ ngưỡng (threshold cycle) mẫu thử xác định điểm mà ánh sáng huỳnh quang phát vượt giới hạn Đường cong chuẩn vẽ tự động dựa vào giá trị Ct nồng độ chuẩn biết Hệ số tương quan lần chạy Realtime-PCR phải đạt 0.98 hiệu suất PCR từ 90 đến 100% Số copies RNA mẫu thử tính dựa vào phép nội suy từ đường cong chuẩn KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Chuẩn hóa qui trình xét nghiệm Realtime RT-PCR Qui trình chẩn đốn EV71 ba bước gồm phản ứng RT-PCR kết hợp với phản ứng Realtime PCR nghiên cứu chứng minh độ nhạy cảm độ đặc hiệu Chúng tơi áp dụng qui trình chuyển giao từ NHRI nên không cần thiết lập lại bước xác định độ nhạy cảm độ đặc hiệu phản ứng, mà thực chuẩn hóa xét nghiệm điều kiện cụ thể phòng xét nghiệm BVNĐ1 thông qua việc xác định độ lập lại kết xét nghiệm mức độ biến thiên Với hệ thống mẫu chuẩn thiết kế dựa chuẩn gốc, thực phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes với hệ thống mẫu chuẩn pha lỗng có nồng độ EV-RNA từ 102 copies 105 copies/phản ứng Hình 1: Chu kỳ ngưỡng hệ thống mẫu chuẩn pha loãng có nồng độ từ 102 copies 105 copies/phản Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng - Năm 2011 97 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 ứng phản ứng Realtime-PCR với Taqman probes định lượng EV-RNA xét nghiệm gam chuẩn có nồng độ vi rút thay đổi từ 102 đến 105 copies/ml Độ lập lại phản ứng khả lập lại kết xét nghiệm mẫu thử, phản ứng thực nhiều lần khác Bảng 3: Sự biến thiên lần phản ứng phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes phát định lượng EV71 Mẫu số Hình 2: Đường cong chuẩn Real-Time PCR với Taqman Probes định lượng EV-RNA Từ kết phản ứng Real-time PCR dựa chuẩn gốc, thiết lập đường cong chuẩn cho phản ứng Kết (hình 2) cho thấy đường cong chuẩn phản ứng có tương quan tuyến tính nồng độ EV-RNA mẫu chuẩn nằm giới hạn từ 102 đến 105 copies/ml Bảng 1: Độ lập lại Ct ứng với nồng độ chuẩn lần chạy liên tiếp phản ứng RealtimePCR Taqman Probes phát định lượng EV71 Nồng độ 10 10 10 10 Lần 26,24 30,02 33,39 37,73 Lần 26,50 30,26 33,66 37,97 Lần 26,79 30,16 33,76 37,16 TB 26,5 30,15 33,60 37,62 SD 0,22 0,10 0,16 0,39 CV (%) 0,5 0,47 1,04 Để đánh giá mức độ tin cậy phản ứng Real-time PCR thực phòng thí nghiệm BVNĐ1, chúng tơi nghiên cứu độ lập lại kết phản ứng cho mẫu chuẩn thực phản ứng nhiều ống nghiệm khác lần chạy phản ứng, lần thực phản ứng khác Bảng trình bày độ lập lại kết 98 Mean SD CV (%) 2,42 x 10 0,11 4,5 8,77 x 10 0,22 2,5 7,77 x 10 0,41 5,2 Bảng 4: Sự biến thiên lần khác phản ứng Real-Time PCR Taqman phát định lượng EV71 Mẫu số EV71-RNA (copies/ml)/ngày N1: 2,42 x 10 Bảng 2: Dữ liệu đường cong chuẩn với FAM490 (Ct) Nồng độ 10 10 10 10 EV71-RNA (Copies/ml) Lần 1: 2,4 x 10 Lần 2: 2,4 x 10 Lần 3: 2,6 x 10 Lần 4: 2,3 x 10 Lân1: 8,9 x 10 Lần 2: 8,9 x 10 Lần 3: 8,9 x 10 Lần 4: 8,4 x 10 Lần 1: 7,4 x 10 Lần 2: 7,9 x 10 Lần 3: 7,4 x 10 Lần 4: 8,4 x 10 N3: 2,8 x 10 CV (%) 6,1 2,64 x 10 0,16 8,39 x 10 0,28 3,34 7,79 x 10 0,25 N2: 8,3 x 10 N3: 8, x 10 N1: 7,77 x 10 SD N2: 2,7 x 10 N1: 8,77 x 10 Mean N2: 8,1 x 10 N3: 7,5 x 10 3,1 Để khảo sát độ lập lại mẫu thử lâm sàng, sử dụng mẫu ly trích có phản ứng RT-PCR dương tính với EV71 xét nghiệm PCR định tính, mẫu lập lại lần lần chạy phản ứng real-time PCR, chạy lần khác Kết bảng cho giá trị nồng Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng - Năm 2011 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 độ mẫu lần lập lại lần phản ứng lần chạy phản ứng khác Nghiên cứu Y học mẫu âm tính Kết phản ứng RealtimePCR Taqman Probes định lượng EV71 phù hợp với phản ứng RT-PCR Các mẫu dương lặp lại có chu kỳ ngưỡng gần giống với hệ số biến thiên < 5% mẫu âm đường biểu diễn nằm ngưỡng phát Kết mẫu lâm sàng có tương quan tuyến tính với hệ số góc tương tự với mẫu chuẩn (hai đường cong chuẩn trùng khớp nhau) (hình 5) Hình 3: Độ lập lại lần chạy mẫu plate Hình 5: Đường cong chuẩn Realtime-PCR Taqman Probe định lượng EV71-RNA Hình 4:Hình ảnh khuếch đại EV71-RNA mẫu thử thực Realtime-PCR Taqman Probes Phản ứng Real-time RT-PCR xem xác có tương đồng với kết phản ứng RT-PCR định tính EV71 Phản ứng Real-time RT-PCR sử dụng đoạn mồi EV có độ xác tốt bắt buộc phải dương tính phản ứng RT-PCR mẫu thử trước dương tính với EV71 ngược lại Để nghiên cứu độ xác phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes phát EV71, thực phản ứng định lượng 100 mẫu bệnh phẩm phết họng gồm 90 mẫu dương tính 10 mẫu âm tính với EV/EV71 phương pháp RT-PCR Có 10 mẫu lập lại với mẫu dương Kỹ thuật định lượng EV71 phương pháp Realtime-PCR Taqman Probes với ưu điểm sử dụng mồi đặc hiệu đoạn dò đặc hiệu giúp tạo sản phẩm đặc hiệu làm tăng tính đặc hiệu phản ứng Chu kỳ ngưỡng ghi nhận mà tín hiệu huỳnh quang mẫu phát cao tín hiệu Dựa chu kỳ ngưỡng chất chuẩn số chuẩn biết mà từ người ta định lượng số RNA có mẫu bệnh phẩm(6,8,12) Hệ thống mẫu chuẩn sử dụng dựa chuẩn gốc NHRI cung cấp, từ chúng tơi có gam chuẩn với nồng độ từ 102 copies 107 copies/phản ứng Khi thực Realtime-PCR Taqman Probes, chúng tơi có kết phản ứng với hệ số tương quan 1, độ cong -3,478, hiệu suất PCR 93,9 phương trình Y= -3,478X + 44,151 Các giá trị chu kỳ nguỡng Ct chuẩn ổn định lần chạy định lượng khác (CV< 10%) (bảng Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng - Năm 2011 99 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 1), cho thấy mức độ ổn định định lượng EV71 Taqman Probes Ngoài với nồng độ cách 10 độ pha lỗng chu kỳ ngưỡng chúng từ chuẩn có nồng độ cao nồng độ cách 3, 3,7 Điều nói lên tính chất tuyến tính phản ứng Về độ lập lại phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes, kết số liệu bảng cho thấy giá trị số lượng mẫu lần lặp lại lần phản ứng lần chạy phản ứng khác có hệ số biến thiên CV