Bài viết này nghiên cứu với mục đích nhằm xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng phyllanthin trong dược liệu Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) sử dụng detector huỳnh quang.
TẠP CHÍ Y DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018 ĐỊNH LƢỢNG PHYLLANTHIN TRONG DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (Phyllanthus amarus L.) BẰNG SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNG SỬ DỤNG DETECTOR HUỲNH QUANG Trần Thu Huyền*; Chử Đức Thành*; Vũ Tuấn Anh* Bùi Thị Bích Vân*; Chử Văn Mến* TĨM TẮT Mục tiêu: xây dựng thẩm định phương pháp định lượng phyllanthin dược liệu Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) sắc ký lỏng siêu hiệu (UPLC) sử dụng detector huỳnh quang Phương pháp: định lượng phyllanthin UPLC kết hợp detector huỳnh quang sử dụng cột sắc ký pha đảo C18, thẩm định phương pháp theo hướng dẫn ICH Kết quả: điều kiện sắc ký gồm: cột C18 (1,6 µm, 2,1 x 50 mm), hệ dung mơi acetonitril:nước với tỷ lệ 55:45 (v/v), tốc độ dòng 0,3 ml/phút; thể tích tiêm mẫu µl; bước sóng kích thích phát xạ huỳnh quang 230 340 nm; phương pháp thẩm định với tiêu chí: tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ xác Các tiêu chí đáp ứng yêu cầu phương pháp định lượng theo quy định Áp dụng phương pháp phân tích mẫu dược liệu Diệp hạ châu đắng xác định hàm lượng phyllanthin đạt 0,63% Kết luận: xây dựng thẩm định phương pháp định lượng phyllanthin Diệp hạ châu đắng UPLC kết hợp detector huỳnh quang * Từ khóa: Diệp hạ châu đắng; Phyllanthin; Sắc ký lỏng siêu hiệu năng; Huỳnh quang Quantitative Analysis of Phyllanthin in Phyllanthus Amarus L using Ultra-performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detector Summary Objectives: To develop and validate a method for quantitative analysis of phyllanthin in Phyllanthus amarus using ultra-performance liquid chromatography (UPLC) with fluorescence detector (UPLC-FD) Methods: Quantitative analysis of phyllanthin using UPLC-FD with reversed phase C18 column; the validation of method was in accordance with ICH guideline Results: The chromatographic condition was developed including C18 column (1.6µm, 2.1 x 50 mm), solvent system including acetonitrile:water with ratio of 55:45 (v/v), flow rate of 0.3 mL/min, injection volume of µL; the excitation and emission wavelengths are 230 and 340 nm , respectively; the method was validated with system suitability, specificity, linear range, precision and accuracy All the parameters were met ICH guideline for method validation The validated method was then applied for quantitation of phyllanthin in Phyllanthus amarus samples , the mean content of phyllanthin was 0.63% on dry basis Conclusion: The quantitative analysis method of phyllanthin in Phyllanthus amarus using UPLC-FD has been developed and validated * Keywords: Phyllanthus amarus; Phyllanthin; Ultra-performance liquid chromatography; Fluorescence detection * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Chử Văn Mến (chuvanmen@gmail.com) Ngày nhận bài: 27/12/2017; Ngày phản biện đánh giá báo: 31/01/2018 Ngày báo đăng: 05/03/2018 26 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018 ĐẶT VẤN ĐỀ Diệp hạ châu đắng, gọi Chó đẻ cưa, Chó đẻ thân xanh, dược liệu trồng, mọc hoang sử dụng phổ biến Việt Nam với công dụng như: thông tiểu, chữa viêm họng, bệnh gan virut B [1, 2] Thành phần hóa học Diệp hạ châu đắng gồm có lignan (phyllanthin, hypophyllanthin) [3] flavonoid Phyllanthin thành phần Diệp hạ châu đắng có nhiều tác dụng như: bảo vệ tế bào gan ức chế virut viêm gan B [4], chống oxy hóa, làm giảm lượng axít uric chứng tăng uric máu, chống viêm [7] Lữ Thị Kim Chi Nguyễn Ngọc Vinh phân lập sử dụng phyllanthin làm chất chuẩn đánh dấu cho dược liệu [4] Có nhiều nghiên cứu định lượng phyllanthin Diệp hạ châu đắng sắc ký lỏng hiệu cao kết hợp detector UV PDA [3, 6, 7, 8] Tuy nhiên, phương pháp cho giới hạn phát cao thời gian phân tích mẫu kéo dài Trong nghiên cứu này, tiến hành xây dựng phương pháp định lượng phyllanthin Diệp hạ châu đắng sử dụng UPLC với detector huỳnh quang giúp rút ngắn thời gian tăng độ nhạy phân tích VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hóa chất thiết bị * Hóa chất nguyên liệu: - Chất chuẩn phyllanthin (độ tinh khiết ≥ 95%) đạt tiêu chuẩn USP (Hãng Sigma Aldrich, Mỹ) Acetonitril, methanol (Hãng Merck, Đức) Nước cất đạt tiêu chuẩn phân tích HPLC Các hóa chất, dung mơi khác đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích - Diệp hạ châu đắng thu hái khu vực Ba Vì (Hà Nội) vào tháng - 2017 Mẫu lưu trữ, xử lý bảo quản Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y * Thiết bị: - Hệ thống máy UPLC UPLC ACQUITY H-Class (Hãng Waters, Mỹ) kết hợp detector huỳnh quang FLR ACQUITY (Hãng Waters, Mỹ) Cột sắc ký CORTECS UPLC® BEH C18 (1,6 µm, 2,1 x 50 mm) (Hãng Waters, Mỹ) - Cân phân tích MS 205 DU (Hãng Mettler Toledo, Thụy Sỹ) Tủ sấy UN110 (Hãng Memmert, Đức) Bể siêu âm S-450H (Hãng Elma, Đức) Các dụng cụ phân tích khác đạt tiêu chuẩn phòng thí nghiệm Phƣơng pháp nghiên cứu * Điều kiện sắc ký: Hệ thống phân tích UPLC cao ACQUITY UPLC H-Class với buồng tiêm mẫu tự động, có kênh dung mơi, detector huỳnh quang Thực phân tích cột CORTECS UPLC® BEH C18 (1,6 µm, 2,1 x 50 mm), nhiệt độ kiểm sốt 300C Pha động bao gồm dung mơi A (nước) dung môi B (acetonitrile) sử dụng theo chương trình rửa giải đẳng dòng, tốc độ rửa giải 0,3 ml/phút Theo dõi sắc đồ bước sóng 230 340 nm tồn thí nghiệm, xử lý phần mềm Empower 3.0 * Chuẩn bị dung dịch chuẩn thử: Chuẩn bị dung dịch chuẩn: hòa tan phyllanthin chuẩn methanol dung dịch chuẩn gốc 1,0 mg/ml Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc cách pha lỗng dung dịch chuẩn gốc tới nồng độ thích hợp chất chuẩn methanol Chuẩn bị mẫu thử [8]: cân xác 200 mg dược liệu, tiến hành chiết siêu âm với x 15 ml methanol 30 phút 27 TẠP CHÍ Y DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018 nhiệt độ 450C, gộp dịch chiết Mẫu dịch chiết pha loãng 20 lần, lọc qua màng 0,45 µm, phân tích sắc ký nhiễu thấp thể qua sắc ký đồ mẫu chuẩn phyllanthin mẫu thử Diệp hạ châu đắng Thẩm định phương pháp phân tích: theo hướng dẫn ICH với tiêu chí tính tương thích, tính tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, giới hạn phát [5] Bảng 1: Kết khảo sát hệ pha động rửa giải phyllanthin KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Độ phân giải (Rs) Hệ số bất đối (T) CAN:nước 45:55 1,81 ± 0,16 1,25 ± 0,02 Kết khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký CAN:nước 55:45 2,23 ± 0,11 1,04 ± 0,01 CAN:nước 65:35 1,92 ± 0,09 1,16 ± 0,03 Tiến hành xử lý mẫu khảo sát điều kiện sắc ký theo phương pháp nghiên cứu, thu thập sắc đồ phân tích kết CAN:nước 75:25 1,78 ± 0,12 1,11 ± 0,02 80.00 Phyllanthin a 70.00 3.152 60.00 50.00 EU 40.00 30.00 Hệ pha động Thành phần rửa giải pha động khảo sát cho thấy với hệ dung môi ACN nước (tỷ lệ 55:45) cho hệ số rửa giải cao hệ số bất đối thấp píc phyllanthin sắc đồ Kết thẩm định phƣơng pháp * Tính thích hợp hệ thống sắc ký: 20.00 10.00 0.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 Minutes 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 50.00 45.00 b Phyllanthin 40.00 35.00 30.00 Bảng 2: Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống 3.153 EU 25.00 20.00 15.00 10.00 Thời Mẫu Diệp hạ Diện tích gian lƣu châu đắng píc (µV.s) (phút) 5.00 0.00 -5.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 Minutes 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 Số đĩa lý Hệ số thuyết bất đối (n) (T) 6.00 Hình 1: Sắc ký đồ chuẩn phyllanthin 1.000 ng/ml (a) mẫu Diệp hạ châu đắng (b) Lựa chọn điều kiện sắc ký UPLC-FLD để định lượng phyllanthin bao gồm: cột sắc ký CORTECS UPLCđ BEH C18 (1,6 àm, 2,1 x 50 mm), h dung mơi rửa giải acetonitrile:nước 55:45 (v/v), tốc độ dòng 0,3 ml/phút; thể tích tiêm mẫu µl; bước sóng kích thích phát xạ huỳnh quang 230 nm 340 nm Với phương pháp xử lý mẫu điều kiện sắc ký lựa chọn, sắc ký đồ thu cho píc tách rõ ràng, 28 Để đánh giá tính thích hợp hệ thống sắc ký, pha mẫu chuẩn theo dẫn, tiêm lần mẫu chuẩn vào hệ thống UPLC, tiến hành sắc ký với điều kiện chọn 3,152 282.034 3.757 1,10 3,154 283.654 3.760 1,06 3,156 282.069 3.752 1,04 3,154 281.696 3.745 1,09 3,151 282.145 3.761 1,12 3,154 281.369 3.749 1,11 Trung bình 3,153 282.161 3.754 1,09 SD 0,00 787 0,03 RSD (%) 0,06 0,28 0,17 2,83 Các điều kiện sắc ký lựa chọn hệ thống UPLC sử dụng phù hợp đảm bảo tính ổn định phép phân tích định lượng phyllanthin TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018 * Khoảng tuyến tính, giới hạn phát giới hạn định lượng: Một dãy gồm dung dịch mẫu chuẩn có nồng độ khác nhau, thay đổi từ 10 - 1.000 ng/ml phyllanthin, tiến hành sắc ký điều kiện mô tả y = 2669X + 9886 R2 = 0.9991 Hình 2: Đường chuẩn phyllanthin Để xác định giới hạn phát hiện, tiến hành pha loãng mẫu chuẩn liên tục Giá trị giới hạn phát xác định nồng độ có tỷ lệ giá trị tín hiệu/nhiễu 3/1 giới hạn định lượng xác định nồng độ có tỷ lệ tín hiệu/nhiễu 10/1 Bảng 3: Kết khảo sát khoảng tuyến tính, giới phát hiện, giới hạn định lượng Thơng số Phyllanthin Khoảng tuyến tính (ng/ml) Phƣơng trình tuyến tính 10 - 1.000 Y = 2.669X + 9.886 Giới hạn Giới hạn định Hệ số phát LOD lƣợng LOQ tƣơng quan (R ) (ng/ml) (ng/ml) 0,9991 2,1 7,0 Kết khảo sát cho thấy, với khoảng nồng độ phyllanthin từ 10 - 1.000 ng/ml, có tương quan tuyến tính nồng độ diện tích píc chuẩn tương ứng Từ phương trình tuyến tính phyllanthin cho phép xác định giới hạn phát giới hạn định lượng hoạt chất 2,1 7,0 ng/ml * Độ độ lặp lại: Độ đúng: tiến hành phân tích mẫu thử độc lập với chất chuẩn thêm vào tương ứng với nồng độ 700 ng/ml Tính lượng thu hồi theo công thức: tỷ lệ thu hồi (%) = (lượng chất phân tích tìm lại x 100)/lượng chất chuẩn thêm vào Độ lặp lại: định lượng mẫu thử độc lập lặp lại ngày Xác định giá trị độ lệch chuẩn tương đối (RSD) 29 TẠP CHÍ Y DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018 Bảng 4: Kết xác định độ STT Chuẩn thêm vào (ng/ml) Chuẩn tìm lại (ng/ml) Tỷ lệ chuẩn tìm lại (%) 700,0 720,3 102,9 700,0 691,6 98,8 700,0 693,0 99,0 700,0 693,7 99,1 700,0 714,7 102,1 700,0 690,9 98,7 Trung bình 100,1 RSD (%) 1,88 Bảng 5: Kết xác định độ lặp lại Khối lƣợng cân (g) Diện tích píc (µV.s) Hàm lƣợng (%) 1,0025 1.813.565 0,67 1,0102 1.702.565 0,63 1,0062 1.697.543 0,63 1,0029 1.805.463 0,67 1,0095 1.703.254 0,63 1,0074 1.693.551 0,63 Lần Trung bình 0,64 RSD (%) 3,60 Kết xác định độ độ lặp lại cho thấy phương pháp có độ độ lặp lại tốt với giá trị RSD tương ứng 1,88% 3,60% * Áp dụng định lượng phyllanthin mẫu dược liệu Diệp hạ châu đắng: Dược liệu Diệp hạ châu đắng định lượng phyllanthin theo quy trình xây dựng thẩm định Tiến hành phân tích mẫu lặp lại 10 lần Kết cho thấy, hàm lượng trung bình phyllanthin 0,63% dược liệu khơ Hàm lượng hoạt chất mẫu Diệp hạ châu đắng không biến động nhiều mẫu Bảng 6: Kết phân tích hàm lượng hoạt chất mẫu Diệp hạ châu đắng Khối lƣợng cân (g) Hàm lƣợng phyllanthin mẫu Diệp hạ châu đắng (%) 1,0021 0,69 1,0054 0,65 0,9652 0,65 1,0123 0,68 1,0356 0,60 Mẫu 30 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018 0,9451 0,63 0,9862 0,59 1,0829 0,60 1,0685 0,59 10 0,9865 0,65 Trung bình 0,63 SD 0,04 RSD (%) 5,97 KẾT LUẬN Phương pháp UPLC đơn giản, hiệu xây dựng thẩm định để định lượng phyllanthin Diệp hạ châu đắng Kết định lượng mẫu Diệp hạ châu đắng cho thấy: hàm lượng phyllanthin đạt 0,63% khơng có biến động nhiều mẫu (RSD < 7%); thời gian rửa giải phyllanthin 3,15 phút; giới hạn định lượng 7,0 ng/ml; phương pháp rút ngắn thời gian phân tích cải thiện giới hạn phát Đây sở để áp dụng phương pháp nghiên cứu dược động học phyllanthin động vật TÀI LIỆU THAM KHẢO Đỗ Tất Lợi Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB Khoa học Kỹ thuật 1995, tr.133 Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam NXB Khoa học Kỹ thuật 2004, tập I, tr.675 Nguyễn Thị Thu Hà Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng phyllanthin Diệp hạ châu sản phẩm có chứa Diệp hạ châu Tạp chí Dược liệu 2011, tr.39-43 Lữ Thị Kim Chi, Nguyễn Ngọc Vinh Phân lập thiết lập chất chuẩn phyllanthin từ Diệp hạ châu đắng Phyllanthus amarus Schum et Thonn Tạp chí Dược học 2012, tr.163-166 ICH guidelines Validation of analytical procedures: Text and Methodology Q2R1 2005 Anupam Sharma, Ravneet T Singh, Sukhdev S Handa Estimation of phyllanthin and hypophyllanthin by high performance liquid chromatography in Phyllanthus amarus Phytochemical Analysis 1993, pp.226-229 Van Tang Nguyen, Jennette A Sakoff, Christopher J Scarlett Physicochemical properties, antioxidant and cytotoxic activities of crude extracts and fractions from Phyllanthus amarus Medicines 2017, pp.1-15 Vikneswaran Murugaiyah, Kit-Lam Chan Determination of four lignans in Phyllanthus niruri L by a simple high-performance liquid chromatography method with fluorescence detection Journal of Chromatography 2007, 1154, pp.198-204 31 ... KẾT LUẬN Phương pháp UPLC đơn giản, hiệu xây dựng thẩm định để định lượng phyllanthin Diệp hạ châu đắng Kết định lượng mẫu Diệp hạ châu đắng cho thấy: hàm lượng phyllanthin đạt 0,63% khơng có biến... (n) (T) 6.00 Hình 1: Sắc ký đồ chuẩn phyllanthin 1.000 ng/ml (a) mẫu Diệp hạ châu đắng (b) Lựa chọn điều kiện sắc ký UPLC-FLD để định lượng phyllanthin bao gồm: cột sắc ký CORTECS UPLCđ BEH C18... xác định độ độ lặp lại cho thấy phương pháp có độ độ lặp lại tốt với giá trị RSD tương ứng 1,88% 3,60% * Áp dụng định lượng phyllanthin mẫu dược liệu Diệp hạ châu đắng: Dược liệu Diệp hạ châu đắng