LUẬN VĂN THẠC SỸ GHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN SỰ TẠO THÀNH LIGNAN TRONG CÂY DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (Phyllanthus amarus Schum. & Thonn.) NUÔI CẤY IN VITRO

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO LUẬN VĂN THẠC SỸ Phạm Minh Duy NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN SỰ TẠO THÀNH LIGNAN TRONG CÂY DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (Phyllanthus amarus Schum & Thonn.) NUÔI CẤY IN VITRO Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm – Hướng Hóa sinh NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS Nguyễn Thị Quỳnh ĐẶT VẤN ĐỀ Cây DHCĐ (Phyllanthus amarus (Schum & Thonn.)) có chứa lignan với nhiều dược tính quý giá Nhu cầu sản xuất tăng cao Sản xuất đồng ruộng gặp nhiều trở ngại thời tiết, sâu bệnh, v.v Một số dược tính khảo sát mức độ cao chiết thô Sản xuất lignan từ DHCĐ nuôi cấy mô quang tự dưỡng Khảo sát dược tính mức độ hợp chất cụ thể Nghiên cứu yếu tố vật lý/hóa học in vitro giúp gia tăng lignan Nâng cao giá trị sử dụng DHCĐ y học GiỚI THIỆU VỀ CÂY DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG Phân loại Bộ Malpighiales Họ Phyllanthaceae Chi Phyllanthus Loài Phyllanthus amarus (Schum & Thonn.) Hình Cây Diệp hạ châu đắng Tên quốc tế: Chance Piedra Tên Việt Nam: Diệp hạ châu đắng, Chó đẻ thân xanh, v.v Tình hình nghiên cứu  Ngồi nước - Phát chứng minh nhiều dược tính, đặc biệt khả ức chế virus HBV - Ly trích nhiều nhóm hợp chất thứ cấp từ DHCĐ, lignan có nhiều dược tính quan trọng Phyllanthin Hypophyllanthin Niranthin Hình Các hợp chất lignan Diệp hạ châu đắng - Nghiên cứu đột biến chuyển gene - Nghiên cứu vi nhân giống Tình hình nghiên cứu  Trong nước - Chủ yếu nghiên cứu dược tính thành phần alkaloid - Vũ Văn Vụ cs (1999) Nguyễn Thị Quỳnh cs (2010) nghiên cứu nuôi cấy mơ DHCĐ  Chưa có nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố mơi trường lên tích lũy lignan DHCĐ in vitro Giới thiệu lignan • Là dimer từ đơn vị phenylpropanoid nối với liên kết carbon 8-8’ • Có quan hệ mật thiết với lignin • Có nhiều dược tính quan trọng: chống ung thư, kháng viêm, giảm đau, giảm huyết áp, kháng oxy hóa, v.v Hình Khung cấu trúc lignan Biến dưỡng sơ cấp Quang hợp Hình Con đường sinh tổng hợp lignan Carbohydrate Tổng hợp protein Phenylalanine Phenylalanine ammonia lyase Coniferyl alcohol Tyrosine Tyrosine ammonia lyase Con đường phenylpropanoid p-coumaryl alcohol Sinapyl alcohol DIR Lignan Biến dưỡng thứ cấp Lignin Biến dưỡng sơ cấp Quang hợp Hình Con đường sinh tổng hợp lignan Carbohydrate Tổng hợp protein Phenylalanine Phenylalanine ammonia lyase Coniferyl alcohol Tyrosine Tyrosine ammonia lyase Con đường phenylpropanoid p-coumaryl alcohol Sinapyl alcohol DIR Lignan Biến dưỡng thứ cấp Lignin Ánh sáng Tia UV Nhiệt độ Phenylalanine ammonia lyase Ethylene Axít abscisic Lignan Phenylalanine VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nội dung Nghiên cứu tích lũy hợp chất lignan DHCĐ nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng ảnh hưởng số yếu tố vật lý môi trường – Nồng độ CO2 – Nhiệt độ – Cường độ ánh sáng thời gian chiếu sáng 10 Nhiệt độ Cường độ ánh sáng & thời gian chiếu sáng Phenylalanine Lignan Cây đồng ruộng 37 Nhiệt độ Lignan 38 Nhiệt độ Phyllanthin Hypophyllanthin Niranthin  Sử dụng điều kiện thích hợp để tập trung gia tăng loại 39 lignan mong muốn Nội dung Khảo sát đặc tính kháng khuẩn kháng oxy hóa hợp chất lignan Diệp hạ châu đắng Hình 13 Cao methanol DHCĐ phyllanthin, 40 hypophyllanthin niranthin sau tách chiết tinh khiết Thí nghiệm Khảo sát khả kháng khuẩn hợp chất lignan Diệp hạ châu đắng in vitro số loại vi khuẩn Hình 14 Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết thô 41 lignan Diệp hạ châu đắng E coli EPEC Hình 15 Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết thơ lignan Diệp hạ châu đắng Salmonella 42 spp Hình 13 Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết thơ lignan Diệp hạ châu đắng S aureus 43 Bảng 11 Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) hình thành nghiệm thức Loài vi khuẩn Chất khảo sát Cao chiết thô E Coli EPEC Salmonella spp S aureus ± 0,1 ND ND Phyllanthin ND ND ND Hypophyllanthin ND ND ND Niranthin ND ND ND Penicillin (+) 12 ± 1,2 19 ± 0,7 28 ± 1,7 Ceftriaxone (+) ± 0,5 26 ± 0,8 36 ± 0,8 44 Thí nghiệm Khảo sát khả kháng oxy hóa hợp chất lignan Diệp hạ châu đắng in vitro Trolox Cao thơ Hình 14 Kết đo Δ OD630 nm theo nồng độ chất khảo sát theo phương pháp lực khử sắt (FRAP) Phyllanthin Hypophyllanthin Niranthin 45 Trolox Phyllanthin Cao thơ Hypophyllanthin Niranthin Hình 15 Kết đo Δ OD490 nm theo nồng độ chất khảo sát 46 theo phương pháp loại điện tử DPPH Bảng 12 Đương lượng Trolox cao chiết thô Diệp hạ châu đắng hợp chất lignan đo theo hai phương pháp Chất khảo sát Đương lượng Trolox (µmol/mg chất khảo sát) Lực khử sắt (FRAP) Loại điện tử DPPH Cao chiết thô DHCĐ 2,89 2,55 Phyllanthin ND ND Hypophyllanthin ND ND Niranthin ND ND 47 KẾT LUẬN • Hàm lượng ba loại hợp chất lignan (phyllanthin, hypophyllanthin niranthin) DHCĐ gia tăng nuôi cấy nồng độ CO2 cao (1200 µmol mol-1) so với ni cấy nồng độ CO2 bình thường (400 µmol mol-1) • Chế độ nhiệt độ giai đoạn sáng tối 33/23 oC giúp cho DHCĐ tổng hợp nhiều niranthin nhất, chế độ nhiệt độ thay đổi từ 23/23 oC lên 33/23 oC vào ngày nuôi cấy thứ 25 giúp tích lũy nhiều phyllanthin hypophyllanthin nht Cng ỏnh sỏng 80 àmol m-2 s-1 kết hợp với thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày thích hợp cho tích lũy lignan cõy DHC B sung phenylalanine 13 àmol/ml vo ngy ni cấy thứ 25 giúp tích lũy nhiều phyllanthin nhất, bổ sung phenylalanine 26 µmol/l vào ngày giúp tích lũy nhiều 48 hypophyllanthin niranthin DHCĐ KẾT LUẬN • Cao chiết methanol thơ DHCĐ nồng độ 10 mg/ml có khả ức chế vi khuẩn E coli EPEC không kháng Salmonella spp S aureus Cả ba loại lignan phyllanthin, hypophyllanthin niranthin nồng độ 10 mg/ml khơng có tác dụng ức chế ba loại vi khuẩn khảo sát • Cao chiết methanol thơ DHCĐ có khả kháng oxy hóa in vitro tốt Cả ba loại lignan phyllanthin, hypophyllanthin niranthin khơng có hoạt tính kháng oxy hóa sử dụng riêng lẻ 49 ĐỀ NGHỊ • Nghiên cứu áp dụng việc nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng Diệp hạ châu đắng, yếu tố vật lý (ánh sáng, nhiệt độ) điều chỉnh cho phù hợp nhu cầu sản xuất hợp chất lignan cần thiết 50 XIN CẢM ƠN QUÝ THẦY CÔ ĐÃ THEO DÕI 51 ... với nhiều dược tính q giá Nhu cầu sản xuất tăng cao Sản xuất đồng ruộng gặp nhiều trở ngại thời tiết, sâu bệnh, v.v Một số dược tính khảo sát mức độ cao chiết thô Sản xuất lignan từ DHCĐ nuôi cấy... chất lignan Diệp hạ châu đắng in vitro • Vật liệu – Cao chiết thô methanol DHCĐ – Phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin phân tách sắc ký cột từ cao • Phương pháp – Kháng khuẩn: phương pháp khuếch... tính mức độ hợp chất cụ thể Nghiên cứu yếu tố vật lý/hóa học in vitro giúp gia tăng lignan Nâng cao giá trị sử dụng DHCĐ y học GiỚI THIỆU VỀ CÂY DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG Phân loại Bộ Malpighiales Họ