Đánh giá tác động kháng Candida albicans của bài thuốc Dị hoàng thang gia giảm vị hoàng bá trên in vitro

Qua khảo sát sơ bộ, Hoàng bá là thành phần chính trong bài thuốc có khả năng kháng C. albicans tốt nhất. Bài viết nghiên cứu tác dụng kháng C. albicans in vitro của bài thuốc Dị hoàng thang khi gia giảm vị Hoàng bá nhằm đưa ra khuyến cáo về liều lượng Hoàng bá sử dụng trong bài thuốc khi muốn điều trị bệnh nhiễm nấm do C. albicans.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG KHÁNG CANDIDA ALBICANS CỦA BÀI THUỐC DỊ HOÀNG THANG GIA GIẢM VỊ HOÀNG BÁ TRÊN IN VITRO Phan Thị Mỹ Linh*, Lê Thị Lan Phương* TĨM TẮT Tình hình chung mục tiêu nghiên cứu: Cao chiết thuốc Dị hồng thang nghiên cứu cho thấy có tác dụng kháng Candida albicans (C albicans) nồng độ 1000 mg/mL 2000 mg/mL, giá trị MIC 1000 mg/mL Qua khảo sát sơ bộ, Hoàng bá thành phần thuốc có khả kháng C albicans tốt Ở đề tài này, tiếp tục tiến hành nghiên cứu tác dụng kháng C albicans in vitro thuốc Dị hoàng thang gia giảm vị Hoàng bá nhằm đưa khuyến cáo liều lượng Hoàng bá sử dụng thuốc muốn điều trị bệnh nhiễm nấm C albicans Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Bài thuốc Dị hoàng thang với lượng vị Hoàng bá khác nhau: g, g, 10 g, 12 g (ký hiệu DHT (6), DHT (8), DHT (10) DHT (12)) sắc với nước theo tỷ lệ dược liệu: nước 1:10 Khảo sát số tiêu chuẩn cao chiết: Độ ẩm, độ tro theo Dược điển Việt Nam IV Khảo sát tác dụng kháng nấm C albicans theo phương pháp khoanh giấy khuếch tán tìm MIC theo phương pháp pha loãng đĩa thạch Kết quả: DHT (6) DHT (8) tạo vòng kháng nấm nồng độ khảo sát 500 mg/mL, 1000 mg/mL 2000 mg/mL, MIC DHT (6) >2000 mg/mL DHT (8) 1000 mg/mL DHT (10) DHT (12) tạo vòng kháng nấm tất nồng độ khảo sát (125 mg/mL, 250 mg/mL, 500 mg/mL, 1000 mg/mL 2000 mg/mL), MIC 250 mg/mL 125 mg/mL Như vậy, tác động kháng nấm C albicans in vitro cao chiết nước thuốc Dị hoàng thang tỷ lệ thuận với lượng Hoàng bá gia giảm thuốc Kết luận: Cao chiết nước thuốc Dị hoàng thang thể tác động kháng C albicans hiệu lượng vị Hoàng bá tăng lên 10 g, 12 g so với thuốc gốc g Từ khố: Kháng nấm, Candida albicans, Dị hồng thang ABSTRACT EVALUATING THE ANTIFUNGAL EFFECT OF “DI HOANG THANG” EXTRACT AGAINST CANDIDA ALBICANS IN VITRO WHEN INCREASE OR DECREASE OF PHELLODENDRON AMURENSE Phan Thi My Linh, Le Thi Lan Phuong * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 22 - No 5- 2018: 65 - 69 Background and Aims: The previous results of our study showed that the extract from Di hoang thang had the potential to be effective of anti – C albicans at 1000 mg/mL, 2000 mg/mL, and the MIC value is 1000 mg/mL Our previous study also showed that Phellodendron amurense is a major component of Di hoang thang which had the best activity against C albicans Therefore, we conducted this study to evaluate the anti – C albicans efficiency when increase or decrease Phellodendron amurense in order to make a recommendation about Phellodendron amurense dose in Di hoang thang for the treatment of C albicans infections Materials and Methods: The Di hoang thang with different Phellodendron amurense doses: 6g, 8g, 10g, 12g (denote by DHT (6), DHT (8), DHT (10) DHT (12) respectively) were extract with water (1:10 w/v) Survey moisture content test, total ash according Vietnamese Pharmacopoeia IV Anti – C albicans activity was  Khoa Y học cổ truyền – Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS Phan Thị Mỹ Linh ĐT: 0931101250 Email: phanlinh173@ump.edu.vn 65 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 invvestigated by the disk diffusion method and MIC value by the agar dilution method Results: DHT (6) and DHT (8) only showed inhibitory zone at 500 mg/mL, 1000 mg/mL 2000 mg/mL, and MIC value of DHT (6) is >2000 mg/mL, MIC value of DHT (8) is 1000 mg/mL DHT (10) and DHT (12) showed inhibitory zone at tested concentrations (125 mg/mL, 250 mg/mL, 500 mg/mL, 1000 mg/mL 2000 mg/mL), and MIC value are 250 mg/mL and 125 mg/mL, respectivevly The results obtained from this study indicated that the anti – C albicans effect of Di hoang thang extract in propotional to Hoang ba dose Conclusions: The water extracts of Di hoang thang was more effective in control of C albicans when Phellodendron amurense is increased up to 10 g and 12g Keywords: Antifungal activity, Candida albicans, Di hoang thang bá lượng 6g, 10g 12g in vitro nhằm ĐẶT VẤN ĐỀ đưa khuyến cáo liều lượng vị Hồng bá sử Có đến 75% phụ nữ bị nấm âm đạo dụng thuốc muốn làm tăng tác lần đời ba tác nhân dụng điều trị bệnh nhiễm nấm C albicans gây viêm nhiễm âm đạo C albicans)(1) PHƯƠNGTIỆN-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Trong y học cổ truyền, khơng có khái niệm tương đồng bệnh viêm âm đạo nhiễm nấm Phương tiện nghiên cứu Candida mà có chứng Đới hạ Tùy vào thể Các dược liệu Hoài sơn, Khiếm thực, Hoàng bệnh lâm sàng mà có thuốc điều trị bá, Xa tiền tử, Bạch đươc mua nhà thuốc thích hợp(7) Trong đó, Dị hồng thang Viện Y Dược học Dân tộc TP Hồ Chí Minh thuốc cổ phương, theo y học cổ truyền thuốc Tất dược liệu lưu mẫu Phòng thí lâm sàng chữa chỗ hư yếu nhâm nghiệm Y Dược Cổ Truyền – Khoa Y Học Cổ mạch, trừ thấp, thận hỏa sử dụng để Truyền – Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh chữa chứng thuộc Đới hạ(7) Ở nghiên cứu Chủng vi sinh vật thử nghiệm: Candida trước, tiến hành đề tài “Đánh giá tác động kháng Candida albicans cao chiết Dị albicans ATCC 90028TM hãng Microbiologics Hoàng thang in vitro” kết cho thấy – Mỹ Môi trường thạch Sabouraud nuôi cấy cao chiết nước thuốc Dị Hoàng thang nồng nấm (BD, USA) thạch Mueller-Hinton (MHA) độ 2000 mg/mL 1000 mg/mL cho vòng kháng thử hoạt tính kháng nấm (BD, USA) Thuốc đối nấm 12,67 mm 8,83 mm Nồng độ chứng Fluconazole 150mg (Stada, Việt Nam) 1000 mg cao chiết nước/mL ức chế tối thiểu Phương pháp nghiên cứu phát triển C albicans sau 24 - 48 nuôi Thiết kế thực nghiệm, đo lường độc lập cấy(6) Bên cạnh đó, vị thuốc Dị Chiết xuất cao hoàng thang: Hoài sơn, Khiếm thực, Hoàng bá, Xa tiền tử, Bạch nồng độ khảo Các thuốc Dị hồng thang gia giảm vị sát Hồng bá cho tác dụng kháng C albicans Hoàng bá sắc riêng với nước theo tốt Trong sách y học, liều dùng tỷ lệ dược liệu: nước 1:10 (kl/tt), dịch chiết Hoàng bá lâm sàng dạng thuốc sắc cô đặc, sấy để thu cao khơ với hàm hồn tán dao động từ - 12g/ngày(2,4,8) lượng nước lại cao khơng q 5%(2,4) Hồng bá thuốc Dị hoàng thang Khảo sát số tiêu chuẩn cao chiết sử dụng nghiên cứu trước 8g (Hồi sơn Hình thức cảm quan: Màu sắc, mùi vị, thể chất 40g, Khiếm thực 40g, Hoàng bá 8g, Xa tiền tử 4g, độ đồng Bạch 10 quả)(7) Ở đề tài này, tiếp tục đánh giá hiệu kháng nấm C albicans Xác định độ ẩm, độ tro toàn phần cao chiết: thuốc Dị hoàng thang gia giảm vị Hoàng Theo Dược Điển Việt Nam IV (DĐVN IV)(2) 66 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Đánh giá tác dụng kháng C albicans(3) Tác dụng kháng C albicans cao chiết thuốc Dị hoàng thang tiến hành phương pháp khoanh giấy khuếch tán theo hướng dẫn CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) Vi nấm thử nghiệm có mật độ 106 CFU/ml trải đĩa thạch MHA que bơng vơ trùng Đặt khoanh giấy có đường kính mm thấm dịch cao chiết nồng độ khảo sát (125 mg/mL, 250 mg/mL, 500 mg/mL, 1000 mg/mL 2000 mg/mL) lên đĩa thạch láng C albicans trước Ủ 24 35oC (± 2oC), khuếch tán cao chiết môi trường thạch ức chế tăng trưởng C albicans tạo thành vòng kháng nấm xung quanh khoanh giấy Xác định đường kính vòng kháng nấm (mm) Xác định nồng độ ức chế tối thiểu phát triển C albicans (MIC)(3) Bằng phương pháp pha lỗng mơi trường thạch MHA Cao chiết thuốc Dị hoàng thang phân tán nước thành nồng độ khảo sát pha lỗng tỷ lệ 1:10 (tt/tt) với mơi trường thạch MHA Chấm 1µL huyền dịch C albicans khoảng 104 CFU lên mặt đĩa thạch Ủ 24 48 35oC (± 2oC), quan sát đếm lượng khúm nấm men mọc đĩa thạch Nồng độ ức chế tối thiểu C albicans (MIC) xác định đĩa thạch có nồng độ cao chiết thấp mà C albicans bị ức chế phát triển, có – khúm nấm mọc Nghiên cứu Y học gia giảm chất rắn, khơ rời nhau, màu vàng cánh gián, mùi thơm nhẹ, vị đắng Độ ẩm trung bình từ 4,09 – 4,32% < 5%, cao chiết đạt tiêu chuẩn độ ẩm cao khô theo qui định DĐVN IV(2) Độ tro tồn phần trung bình từ 5,16 – 5,92% (bảng 2) Bảng Hiệu suất chiết thuốc Dị hoàng thang gia giảm Tổng dược liệu ban đầu Cao Khối chiết lượng Độ ẩm (%) (g) DHT (6) 103,6 4,91±0,32 DHT (8) 105,7 4,82±0,31 DHT (10) 107,8 4,96±0,34 DHT (12) 109,7 5,06±0,22 Cao chiết thu (g) Khối lượng Độ ẩm (%) (g) 12,45 4,09±0,12 12,39 4,18±0,20 13,30 4,10±0,16 13,65 4,32±0,15 Hiệu suất chiết (%) 12,12 11,79 12,45 12,54 Bảng Độ ẩm trung bình độ tro tồn phần trung bình thuốc Dị hoàng thang gia giảm Cao chiết Độ ẩm trung bình (%) DHT (6) DHT (8) DHT (10) DHT (12) 4,09±0,12 4,18±0,20 4,10±0,16 4,32±0,15 Độ tro tồn phần trung bình (%) 5,45±0,73 5,92±0,63 5,55±0,51 5,16±0,70 Đánh giá tác dụng kháng C albicans Phương pháp xử lý liệu Hình Hoạt tính kháng C albicans vị thuốc thuốc Dị hồng thang Kết tính Microsoft Excel 2013 biểu diễn dạng trung bình ± sai số chuẩn (Mean ± SD) Bảng Đường kính vòng kháng C albicans vị thuốc thuốc Dị hoàng thang KẾTQUẢ Chiết xuất cao Hiệu suất chiết cao thuốc Dị hoàng thang gia giảm thấp, không khác biệt đáng kể dao động từ 11,79 – 12,54% (bảng 1) Khảo sát số tiêu chuẩn cao chiết Cao chiết nước thuốc Dị hoàng thang Tác nhân kháng C albicans Nước cất Fluconazol Hoàng bá Hoài sơn Khiếm thực Xa tiền tử Bạch Nồng độ Đường kính vòng (20 µL/khoanh kháng (mm) giấy) Khơng tạo vòng kháng 25 µg/khoanh 29,33±1,53 giấy 15,33±1,15 Dịch chiết nước tỷ lệ 2:1 (w/v) Khơng xác định vòng kháng 67 Nghiên cứu Y học Kết hình bảng cho thấy, vị thuốc Dị hoàng thang: Tại nồng độ khảo sát ngoại trừ Hồng bá tạo vòng kháng nấm 15,33±1,15 mm, vị lại Hồi sơn, Khiếm thực, Xa tiền tử, Bạch khơng xác định vòng kháng nấm Tác động kháng nấm C albicans cao chiết thuốc Dị hoàng thang gia giảm xác định dựa khả ức chế Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 phát triển C albicans thể qua đường kính vòng kháng nấm hình Kết bảng biểu đồ cho thấy đường kính vòng kháng C albicans cao chiết DHT (6), DHT (8), DHT (10) DHT (12) tỷ lệ thuận với nồng độ cao chiết khảo sát nồng độ cao chiết đường kính vòng kháng tăng tỷ lệ thuận với lượng Hoàng bá sử dụng thuốc Hình Hoạt tính kháng C albicans cao chiết thuốc Dị hoàng thang gia giảm Bảng Đường kính vòng kháng C albicans cao chiết thuốc Dị hoàng thang gia giảm Nồng độ Tác nhân kháng Đường kính vòng kháng (mm) C albicans (mg/mL) Fluconazol 25 µg/ khoanh giấy 29,83±2,14 Nước cất 2000 9,67±0,82 1000 8,50±1,05 Cao chiết DHT 500 7,17±0,75 (6) 250 125 2000 12,83±0,98 1000 10,17±0,75 Cao chiết DHT 500 8,50±1,05 (8) 250 125 2000 18,50±1,05 1000 16,00±1,26 Cao chiết DHT 500 13,83±0,98 (10) 250 11,00±1,41 125 8,67±1,03 2000 22,83±1,47 1000 19,50±1,05 Cao chiết DHT 500 17,17±1,47 (12) 250 13,83±1,17 125 11,67±1,03 “-”: Khơng xác định vòng kháng nấm 68 Biểu đồ Hoạt tính kháng C albicans cao chiết thuốc Dị hoàng thang gia giảm Xác định nồng độ ức chế tối thiểu phát triển C albicans Thông qua kết khảo sát bảng nhận thấy MIC C albicans DHT (6) cao > 2000 mg/mL, DHT (8) 1000 mg/mL, riêng DHT (10) DHT (12) cần nồng độ thấp 250 mg/mL 125 mg/mL ức chế phát triển C albicans Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Bảng Mật độ khúm nấm C albicans xuất đĩa thạch Nồng Số lượng khúm nấm C abicans đĩa thạch sau 24h 48h thử nghiệm độ DHT (8) DHT (10) DHT (12) (mg/ DHT (6) mL) 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 2000 >3 >3 0 0 0 1000 >18 >23 30 >14 >16 0 0 250 >31 >37 >25 >27 125 >48 >51 >36 >42 3 1 BÀN LUẬN Hồng bá có chứa 1,6% berberin palmatin(2), berberin palmatin xem chất có khả kháng nhiều vi khuẩn, vi nấm(9) Một nghiên cứu nhóm nhà nghiên cứu Hàn Quốc Hoàng bá nồng độ 400 µg/khoanh giấy ức chế đáng kể chủng nấm Candida C albicans, C glabrata, C krusei, C parapsilosis, nghiên cứu cho thấy thành phần hoạt động kháng nấm chủ yếu berberin palmatin, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) berberin C albicans 125-250 mg/L, C krusei mg/L, C parapsilosis >500 mg/L, palmatin C parapsilosis 15,6 mg/L(5) Bên cạnh đó, vị thuốc Dị hoàng thang: Hoài sơn, Khiếm thực, Hoàng bá, Xa tiền tử, Bạch nồng độ khảo sát Hồng bá cho tác dụng kháng C albicans tốt (hình 1, bảng 3) Với kết thử nghiệm nói thuốc Dị hồng thang, Hồng bá xem thành phần có tác dụng kháng nấm C albicans Hoàng bá gia thêm lên 10 g, 12 g (liều lượng phù hợp với khuyến cáo liều lượng sử dụng Hoàng bá sách y học(2,4,8)) làm tăng hiệu kháng C albicans thuốc Nghiên cứu Y học KẾT LUẬN Đánh giá so sánh tác động kháng C albicans thuốc Dị hoàng thang gia giảm vị Hoàng bá DHT (6), DHT (8), DHT (10) DHT (12) Tác động kháng nấm C albicans in vitro cao chiết nước thuốc Dị hoàng thang tỷ lệ thuận với lượng Hoàng bá gia giảm Như vậy, tăng thêm lượng Hoàng bá sử dụng thuốc Dị hoàng thang lên 10 g, 12 g để đạt hiệu tốt muốn điều trị bệnh nhiễm nấm C albicans TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ môn phụ sản – Trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh (2011) Viêm âm đạo Sản phụ khoa – Tập II NXB Y học, TP Hồ Chí Minh, tr 753-754 Bộ Y Tế (2009) Cao thuốc, Độ ẩm, Độ tro toàn phần, Hoàng bá Dược điển Việt Nam IV NXB Y Học, Hà Nội, tr PL9, PL182, PL183, 778-779 Clinical and Laboratory Standards Institute (2009) Method for Antifungal Disk diffusion susceptibility Testing of Yeasts, Approved Guideline - Second edition CLSI document M44-A2 Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA Nguyễn Phương Dung (2016) Hoàng bá Dược học cổ truyền NXB Đại học Sư Phạm TP Hồ Chí Minh, TP Hồ Chí Minh, tr 79-80 Park K et al (1999) “Differential inhibitory effects of protoberberines on sterol and chitin biosyntheses in Candida albicans” Journal Antimicrobial Chemotherapy; 43(5): 667-674 Phan Thị Mỹ Linh, Võ Thanh Phong, Lê Thị Lan Phương (2017) “Đánh giá tác dụng kháng Candida albicans cao chiết Dị hoàng thang in vitro” Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh; 21(6): 181-184 Phó Thanh Chủ (2007) Bệnh Đới hạ Dịch giả Lương Y Nguyễn Văn Nghĩa Nữ khoa nhi khoa NXB Phương Đông, Cà Mau, tr 18-32 Trần Quốc Bảo, Trần Quốc Bình (2011) Hồng bá Thuốc y học cổ truyền ứng dụng lâm sàng NXB Y học, Hà Nội, tr 49-50 Williamson E, Driver S, Baxter K (2009) Berberin Stockley’s Herbal Medicines Interactions Pharmaceutical Press, London, pp 58-60 Ngày nhận báo: 25/04/2017 Ngày phản biện nhận xét báo: 20/06/2018 Ngày báo đăng: 20/09/2018 69 ... tăng hiệu kháng C albicans thuốc Nghiên cứu Y học KẾT LUẬN Đánh giá so sánh tác động kháng C albicans thuốc Dị hoàng thang gia giảm vị Hoàng bá DHT (6), DHT (8), DHT (10) DHT (12) Tác động kháng. .. vòng kháng tăng tỷ lệ thuận với lượng Hoàng bá sử dụng thuốc Hình Hoạt tính kháng C albicans cao chiết thuốc Dị hoàng thang gia giảm Bảng Đường kính vòng kháng C albicans cao chiết thuốc Dị hoàng. .. chiết: thuốc Dị hoàng thang gia giảm vị Hoàng Theo Dược Điển Việt Nam IV (DĐVN IV)(2) 66 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Đánh giá tác dụng kháng C albicans( 3) Tác dụng kháng C albicans