Tác dụng kháng candida albicans in vitro và ex vivo của 2-methoxy-1,4-naphthoquinon

Mục tiêu của nghiên cứu nhằm khảo sát tác động kháng Candida spp. in vitro và ex vivo của 2-methoxy-1,4 naphthoquinon so sánh với một số chất đối chiếu như cao BMT, ketoconazol, nystatin và terbinafin. Mời các bạn cùng tham khảo đề tài qua bài viết này.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 TÁC DỤNG KHÁNG CANDIDA ALBICANS IN VITRO VÀ EX VIVO CỦA 2-METHOXY-1,4-NAPHTHOQUINON Nguyễn Đinh Nga*, Mai Phước Tân*, Quách Lâm Tư Ái** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Để sử dụng 2-methoxy-1,4 naphthoquinon nguồn nguyên liệu cho tác động kháng nấm cần chứng minh tác động kháng Candida albicans in vitro, in vivo hợp chất Mục tiêu nghiên cứu: khảo sát tác động kháng Candida spp in vitro ex vivo 2-methoxy-1,4 naphthoquinon so sánh với số chất đối chiếu cao BMT, ketoconazol, nystatin terbinafin Vật liệu phương pháp: sử dụng phương pháp pha loãng theo NCCLS-M27-A2; khảo sát tác động chất kháng nấm dạng biofilm C albicans theo hướng dẫn Gordon Ramage cs.; xác định MIC ex vivo mơ hình móng nhiễm C albicans, biến đổi mơ hình gây nhiễm nấm móng thực nghiệm với T rubrum T mentagrophytes Kết quả: Kết nghiên cứu cho thấy 2-methoxy-1,4 naphthoquinon cho tác động kháng C albicans in vitro ex vivo tương đương cao BMT Kết luận: Có thể sử dụng kết từ khảo sát tác động kháng C albicans dạng biofilm ex vivo mơ móng để ước lượng liểu thử nghiệm in vivo hợp chất Từ khóa: Cao Bơng móng tay (BMT); 2-methoxy-1,4 naphthoquinon; Candida spp.; nồng độ tối thiểu ức chế in vitro (MIC in vitro); MIC ex vivo ABSTRACT THE ANTIFUNGAL ACTIVITY AGAINST CANDIDA ALBICANS IN VITRO AND EX VIVO OF 2-METHOXY-1,4-NAPHTHOQUINONE Nguyen Dinh Nga, Mai Phuoc Tan, Quach Lam Tu Ai * Y Hoc TP Ho Chi Minh* Vol 15 - Supplement of No - 2011: 324 - 328 Background: To use a new substance (2-methoxy-1,4-naphtoquinone) as an antifungal agent, this substance has been determined the antifungal activity in vitro and in vivo Objective: To determine the antifungal activity in vitro and ex vivo of 2-methoxy-1,4 naphthoquinone, a principle compound of balsam extract, extracted from Impatiens balsamina L Balsaminaceae which was synthesized against Candida spp compare with balsam extract and some other antifungal agents Material and methods: The antifungal activity against Candida spp in vitro of these compounds were determined by the dilution method according to the guidline of NCCLS M27-A2 The MICs of these compounds against Candida albicans biofilms were carried out as the detail techniques of Gordon Ramage and cs and MICs ex vivo were determined by modified model using the experimental tinea unguium to evaluate the antifungal activity against Trichophyton rubrum and T mentagrophytes Outcome: Data received from these experiments show the antifungal activities of 2-methoxy-1,4 naphthoquinone against Candida spp were equivalent to balsam extract Conclusion: 2-methoxy-1,4 naphthoquinone could be studied further more in vivo to use as an antifungal agent *Khoa Dược-Đại học Y Dược TP HCM *Đại học Mở TP.HCM Tác giả liên lạc: PGS TS Nguyễn Đinh Nga ĐT: 0908 83 69 69 Email: nganguyendinh@yahoo.com 324 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học Keywords: balsam extract; 2-methoxy-1,4 naphthoquinon; Candida spp.; MIC in vitro; MIC ex vivo Balsaminaceae) có độ ẩm < 10% (xác định ĐẶT VẤN ĐỀ máy đo độ ẩm - Moisture Analyzer offers Khi khảo sát chất kháng nấm để halogen heating Bộ môn Dược Liệu – Khoa đưa vào sử dụng, vấn đề khó khăn mà Dược – Đại Học Y Dược TP HCM) Chứa nhà nghiên cứu thường gặp khơng tìm thấy khoảng 70% 2-methoxy-1,4-naphthoquinon, tương đồng tác động in vitro hiệu định lượng phương pháp đo quang điều trị lâm sàng, khó khăn Ketoconazole chất chuẩn đối chiếu, lơ việc tiên lượng nồng độ thử nghiệm in vivo từ 50030107, hàm lượng 99,63% kết in vitro Terbinafin HCl (SHRUTI BULK Drug Cao Bơng móng tay (cao BMT) chiết xuất từ PVT LTD) Bơng móng tay (Impatiens balsamina L Nystatin, lô 4011316, công ty cổ phần Balsaminaceae) với thành phần cho tác dược phẩm 3/2 cung cấp động kháng nấm 2-methoxy-1,4 naphthoquinon, chứng minh tác động Phương pháp nghiên cứu (5) kháng Candida albicans in vitro tốt Tuy Tác động kháng Candida albicans Candida nhiên để sử dụng cao BMT làm thuốc non albicans dạng nấm men (MIC in vitro) kháng nấm, hai vấn đề quan trọng cần phải giải chất kháng nấm thực phương nguồn nguyên liệu ổn định hiệu pháp pha loãng, theo hướng dẫn NCCLS kháng nấm in vivo Trong phạm vi đề tài, chúng M27-A2, sử dụng môi trường canh thang khảo sát tác động kháng Candida albicans in Mueller Hinton bổ sung glucose xanh vitro; C albicans dạng biofilm MIC ex vivo methylen mơ hình gây nhiễm bệnh Candida mơ móng Tác động kháng Candida albicans ex vivo tay người khỏe mạnh cắt rời 2-methoxyđược thực dạng biofilm Candida 1,4 naphthoquinon (hoạt chất cho tác albicans Candida albicans nhiễm nấm động kháng nấm Bơng móng tay) nguồn móng thực nghiệm tổng hợp, nhằm xác định hướng sử dụng 2Phương pháp xác định tác động kháng methoxy-1,4 naphthoquinon nguồn nguyên Candida albicans dạng biofilm bảng nhựa liệu kháng nấm polystyren: Một đặc điểm liên quan ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU đến độc tính khả kháng thuốc C albicans tạo màng sinh học (biofilm) Đối tượng nghiên cứu vật liệu trơ Sự tạo thành biofilm C Vi nấm albicans bảng nhựa polystyren tương tự 22 chủng Candida albicans 12 chủng biofilm vi nấm tạo thành dụng cụ y Candida non albicans phân lập từ bệnh nhân khoa ống thông, giả,… chất cho nhiễm bệnh Candida niêm mạc hiệu kháng dạng biofilm Candida có Candida albicans ATCC 10231 tiềm cho hiệu in vivo(1,3) Chất kháng nấm Tác động kháng C albicans dạng biofilm 2-methoxy-1,4-naphthoquinon Bộ mơn Hóa Dược, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP HCM tổng hợp cung cấp Chất đối chiếu Cao Bơng móng tay (BMT) chiết từ vỏ bơng móng tay (Impatiens balsamina L Chun Đề Dược Khoa thực qua giai đoạn sau: Sự tạo biofilms C albicans bảng nhựa polystyren, sử dụng môi trường glycin-glucose(2) Sau Candida albicans tạo biofilm gắn dính vào bảng nhựa, rửa giếng lần dung dịch sinh lý-đệm phosphat vô trùng, thấm khô để 325 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 loại bỏ tế bào nấm men lơ lửng mơi trường Dùng kính hiển vi nghịch đảo để khảo sát tạo thành biofilm C albicans bảng nhựa (vi nấm dạng sợi bám dính vào đáy bảng nhựa, khơng bị giai đoạn rửa) Khảo sát hoạt tính chất kháng nấm lên dạng biofilm C albicans Tác nhân kháng nấm pha lỗng với mơi trường YPG (yeast extract g, pepton 10 g, glucose 20 g; nước cất 1000 ml) thành dãy nồng độ từ cao đến thấp vào giếng có biofilm, cụ thể: 2-methoxy-1,4-naphthoquinon từ 256 µg/ml đến 0,125 µg/ml; cao BMT: 256 µg/ml - 0,125 µg/ml; nystatin: 32 µg/ml – 0,015 µg/ml; ketoconazol: 10 µg/ml – 0,00094 µg/ml Ủ 37 oC, sau 24-48 h đọc kết cách quan sát phát triển trở lại vi nấm gây đục môi trường Mơ hình gây nhiễm Candida albicans lên mơ móng tay lập(4,6) Móng tay cắt từ người tình nguyện khơng sử dụng sơn móng tay hay chất đánh bóng khác, khơng bị bệnh móng Móng tay trữ lọ bijou ml, dán nhãn để tủ lạnh đến sử dụng Cắt móng tay thành mảnh x mm Khi sử dụng, rửa ethanol 70 %, lắc rung lần, lần phút dịch sinh lý vô trùng, lắc rung lần, lần phút Sau rửa sạch, móng để khơ tự nhiên laminar nhiệt độ phòng Gây nhiễm móng Nấm men C albicans hoạt hóa thạch YPG, ủ 37 oC Sau 48 h lấy vòng cấy nấm phân tán nước muối sinh lý có bổ sung 0,05 % Tween 80 để đạt 107 CFU/ ml Số lượng tế bào nấm men xác định buồng đếm Neubauer Pha lỗng dịch treo nấm mơi trường thạch nước (thành phần môi trường thạch nước gồm K2HPO4 0,2%; MgSO4 0,005%; CaCl2 0,005%; agar 1,5%, nước cất lit) cho mật độ nấm men 106 CFU/ ml cho thạch nước chứa 326 nấm vào đĩa petri vơ trùng Đặt phần móng xử lý vào đĩa Petri cho phần móng tiếp xúc với mặt thạch chứa nấm Như vậy, Candida albicans sử dụng móng nguồn dinh dưỡng ủ đĩa Petri 37 oC / ngày Kiểm tra phát triển Candida albicans móng kính hiển vi quang học, vật kính x10 x40 Chuẩn bị chất kháng nấm Các chất kháng nấm hòa tan dung dịch Polyethylen glycol – cồn ethyl (75:25) với nồng độ gấp 10 lần nồng độ thử nghiệm, pha loãng 10 lần mơi trường thạch YPG có bổ sung 0,05 % Tween 80 thành dãy nồng độ thử nghiệm: Terbinafin từ – 0,06 %; Ketoconazole: – 0,06 %; Cao bơng móng tay: 0,5 – 0,015 %; 2-methoxy-1,4naphthoquinon: 0,5 – 0,015 % Móng sau gây nhiễm nấm chuyển sang đĩa petri môi trường chứa chất kháng nấm, đặt lưng móng tiếp xúc với mơi trường, móng hướng lên trên, ủ 37 oC Sau từ – ngày quan sát phát triển Candida albicans quanh móng mắt thường để xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi nấm Sau đọc kết quả, móng khơng thấy có vi nấm phát triển quanh móng chuyển đĩa petri có chứa mơi trường thạch Sabouraud mới, ủ 37 oC ngày để xác định nồng độ tối thiểu diệt nấm (MFC) mơ móng KẾT QUẢ Nồng độ tối thiểu ức chế phát triển Candida albicans Candida non albicans in vitro 2-methoxy-1,4-naphthoquinon so với cao BMT ketoconazol Kết bảng cho thấy 2-methoxy-1,4naphthoquinon cho tác động kháng Candida spp in vitro tương đương cao BMT, tác động chủng C albicans nhạy trung gian với ketoconazol Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Chất thử Bảng Tác động kháng Candida spp 2methoxy-1,4-naphthoquinon in vitro Chủng nấm Candida albicans (n=21) Candida non albicans (n=12) Phân bố chủng theo khoảng MIC Chất kháng nấm (μg/ml) 16 Ketoconazole 16 Cao BMT 20 2-methoxy-1,4naphthoquinon 20 Ketoconazole Cao BMT 12 0 12 0 2-methoxy-1,4naphthoquinon 11 Tác động kháng Candida albicans dạng biofilm 2-methoxy-1,4-naphthoquinon so với cao BMT ketoconazol Bảng So sánh MIC chất kháng nấm dạng biofilm dạng nấm men C albicans MIC biofilm MIC in vitro (µg/ml) (µg/ml) 2-methoxy-1,4-naphthoquinon 32 Cao BMT 32 16 Nystatin Ketoconazol 0,9 0,06 - 0,125 Chất kháng nấm Ghi chú: Số liệu nhận trung bình lần lập lại thử nghiệm Kết bảng cho thấy, nồng độ tối thiểu ức chế C albicans dạng biofilm ketoconazol 0,9 µg/ ml, cao nồng độ MIC in vitro khoảng 10 lần 2-methoxy-1,4-naphthoquinon cao Bơng móng tay có nồng độ ức chế tối thiểu C albicans dạng biofilm 32 x 10-3 mg/ml, gấp 24 lần MIC in vitro Riêng Nystatin chất cho tác dụng diệt nấm Candida albicans nên cho MIC biofilm tương đương MIC in vitro Tác động kháng Candida albicans mô móng 2-methoxy-1,4-naphthoquinon so với cao BMT, ketoconazol terbinafin Bảng Tác động kháng C albicans mơ hình móng chất kháng nấm Chất thử Terbinafin Ketoconazol Cao Bơng móng tay Nồng độ chất thử (mg/ml) MIC MIC MFC (in vitro) (ex vivo) (ex vivo) 20 0,03 x 10-3 10 20 0,016 1,25 2,5 Chuyên Đề Dược Khoa 2-methoxy-1,4naphtoquinon Nghiên cứu Y học Nồng độ chất thử (mg/ml) MIC MIC MFC (in vitro) (ex vivo) (ex vivo) 0,008 1,25 Ghi chú: (-) không thử Các nồng độ MIC MFC ex vivo thực với mẫu móng tay khác cho chất kháng nấm Thí nghiệm thực song song với lơ chứng gồm mẫu móng tay gây nhiễm không tiếp xúc với chất kháng nấm BÀN LUẬN Tác động kháng Candida spp 2methoxy-1,4-naphthoquinon, cao BMT ketoconazol in vitro: Kết bảng cho thấy: Tỉ lệ chủng Candida phân lập từ bệnh nhân nhiễm Candida niêm mạc nhạy với ketoconazol, với khoảng MIC < μg/ml 16/21, chiếm 76,19%; 5/21 chủng có độ nhạy trung gian với MIC từ 8-16 μg/ml chiếm 23,81%; khơng có chủng kháng ketoconazol 2-methoxy-1,4-naphthoquinon cho tác động kháng Candida spp in vitro tương đương cao BMT tác động chủng C albicans nhạy trung gian với ketoconazol Tác động kháng Candida albicans dạng biofilm 2-methoxy-1,4-naphthoquinon so với cao BMT ketoconazol Kết khảo sát tác động chất kháng nấm C albicans dạng biofilm tạo bảng nhựa polystyren cho thấy: Nystatin chất cho tác dụng diệt nấm Candida albicans nên cho MIC biofilm tương đương MIC in vitro Các chất thử nghiệm lại có nồng độ tối thiểu tác động C albicans dạng biofilm cao MIC in vitro Ketoconazol chất kìm nấm cho nồng độ tối thiểu ức chế C albicans dạng biofilm cao nồng độ MIC in vitro khoảng 10 lần 2-methoxy-1,4-naphthoquinon cao Bơng móng tay ức chế dạng biofilm C albicans với nồng độ ức chế tối thiểu cao 327 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 gấp 2-4 lần MIC in vitro, nên ứng viên nghiên cứu để sử dụng nguồn nguyên liệu làm thuốc kháng nấm Khảo sát tác động kháng C albicans mơ móng tay chất kháng nấm So sánh tác động kháng C albicans in vitro tác động kháng Candida albicans mơ móng tay (ex vivo) ketoconazol, thấy khác biệt nồng độ ức chế nấm hai phương pháp thử lớn, MIC ex vivo ketoconazol cao MIC in vitro khoảng 33 ngàn lần Nồng độ MIC MFC ex vivo ketoconazol phù hợp với nồng độ chế phẩm dung lưu hành thị trường (kem Nizoral* chứa hoạt chất ketoconazol %) Nồng độ MIC MFC ex vivo terbinafin nằm khoảng nồng độ chế phẩm Lamisil* lưu hành thị trường (kem lamisil* chứa hoạt chất Terbinafin %) Nồng độ MIC MFC ex vivo cao Bơng móng tay 2-methoxy-1,4-naphthoquinon cao MIC in vitro từ 156 – 625 lần 2-methoxy-1,4naphthoquinon có MIC in vitro ex vivo thấp cao Bông móng tay, MFC ex vivo lại cao gấp đơi, điều khả thấm vào móng cao Bơng móng tay tốt 2-methoxy-1,4-naphthoquinon, hoạt chất riêng rẽ Do có khác biệt lớn nồng độ tác động kháng C albicans chất thử in vitro 328 ex vivo, đồng thời có phù hợp nồng độ tác động kháng C albicans móng nồng độ chất thử chế phẩm lưu hành thị trường nên áp dụng mơ hình để đốn liều thử nghiệm in vivo số chất kháng nấm nhằm giảm thời gian dò liều, giảm số thú thử nghiệm giảm chi phí Cảm ơn: Nhóm nghiên cứu chân thành cảm ơn Khoa Dược, Đại học Y Dược TP HCM cung cấp kinh phí tạo điều kiện nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Ernst J.E Rogers P.D (2007), Methods in Molecular medicine, Antifungal agent - methods and protocols, Vol.188, Humana Press Inc, Totowa, NJ, 71-75 Gülhan Vardcer-Ünlü, (1998) A comparison of germ tube production by Candida albicans in three media, Tr J of Biology, 22, 2005-2010 Jain N., Kohli R., Cook E., Gialanella P., Chang T., and Fries B.C (2007), Biofilm formation by and antifungal susceptibility of Candida isolate from urine, Applied and enviromental microbiology, ASM 1697-1703 Nguyen Đinh Nga, Nguyen Vu Giang Bac, Nguyen Thu Guong (2009) Using the experimental tinea unguium model to evaluate the antifungal activity against Trichophyton of some plant extracts Pharma Indochina VI-(The development of Indochina Pharmacy in context of Global economic Recession) Proceeding of the sixth Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences 771-775 Trần Thành Đạo, Nguyễn Đinh Nga (2009) Tổng hợp tác dụng kháng nấm methyl lawson, thành phần bơng móng tay Tạp chí dược học, 49(395), 29-32 Yazdanparast S.A and Bartin C.R (2006), Athroconidia production in Trichophyton rubrum and new ex vivo model of onychomycosis, Journal of Medical Microbiology, 55, 15771581 Chuyên Đề Dược Khoa ... lần MIC in vitro Riêng Nystatin chất cho tác dụng diệt nấm Candida albicans nên cho MIC biofilm tương đương MIC in vitro Tác động kháng Candida albicans mơ móng 2-methoxy-1,4-naphthoquinon so... triển Candida albicans Candida non albicans in vitro 2-methoxy-1,4-naphthoquinon so với cao BMT ketoconazol Kết bảng cho thấy 2-methoxy-1,4naphthoquinon cho tác động kháng Candida spp in vitro. .. cho tác dược phẩm 3/2 cung cấp động kháng nấm 2-methoxy-1,4 naphthoquinon, chứng minh tác động Phương pháp nghiên cứu (5) kháng Candida albicans in vitro tốt Tuy Tác động kháng Candida albicans