Mục tiêu của nghiên cứu nhằm khảo sát điều kiện thích hợp để candida albicans phát triên dưới dạng biofilm và gây nhiễm móng thực nghiệm. Áp dụng các mô hình thực nghiệm này để khảo sát tác động của các chất kháng nấm.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 ỨNG DỤNG MỘT SỐ MƠ HÌNH KHẢO SÁT TÁC DỤNG CỦA CHẤT KHÁNG NẤM EX VIVO TRÊN CANDIDA ALBICANS Nguyễn Vũ Giang Bắc*, Nguyễn Đinh Nga* TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: khảo sát điều kiện thích hợp để Candida albicans phát triên dạng biofilm gây nhiễm móng thực nghiệm Áp dụng mơ hình thực nghiệm để khảo sát tác động chất kháng nấm Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát điều kiện mơi trường, lượng nấm, thời gian ủ thích hợp để C albicans phát triển dạng biofilm bảng nhựa 96 giếng nhiễm móng lập Sử dụng mơ hình để khảo sát tác động chất kháng nấm có nguồn thực vật, so sánh với ketoconazol, nystatin, terbinafin Qua xác định cách đọc điểm dừng đọc kết Kết quả: Đã đề nghị điều kiện để C albicans phát triển dạng biofilm bảng nhựa 96 giếng nhiễm móng lập Xác định cách đọc điểm dừng đọc kết thích hợp Nồng độ tối thiểu ức chế C albicans dạng biofilm chất thử thường cao nồng độ ức chế dạng men Nồng độ diệt C albicans móng nhiễm chất thử thấp ketoconazole terbinafin phù hợp với liều chất thuốc dùng ngồi Kết luận: Có thể sử dụng mơ hình thử nghiệm hoạt tính kháng C.albicans ex vivo để đoán liều thử nghiệm in vivo số chất kháng nấm Từ khóa: Candida albicans, ex vivo, biofilm, móng nhiễm ABSTRACT EX VIVO MODELS FOR TESTING ANTIFUNGAL ACTIVITY AGAINST CANDIDA ALBICANS Nguyen Vu Giang Bac, Nguyen Dinh Nga * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No - 2012: 86 - 89 Objective: study experimental condition for biofilm’s formulation and nail infection of Candida albicans Using these model to test antifungal activity of several compounds Method: survey medium, volume of colonies, incubation time for formulating biofilm on 96-well plate and infecting nail of Candida albicans Applied these model for antifungal agents from medical plants, compared with ketoconazole, terbinafine and nystatine Whereby, determine method and breakpoint to observe results Result: we determined conditions for Candida albicans to form biofilm on 96-well plate and infect nail, method to obtain results and breakpoints The MICs of these compounds against Candida albicans biofilm were higher than MICs against yeast cells The MFCs on nail infected were lower than ketoconazole and terbinafine, it is suitable to dermal dosage of these compounds Conclusion: We could use these ex vivo models to guess in vivo dosage of new antifungal agents, therefore, it could decrease time and expenditure for research Keyword: Candida albicans, ex vivo, biofilm, nail infected Khoa Dược, Đại học Y Dược TPHCM Tác giả liên lạc: DS Nguyễn Vũ Giang Bắc ĐT: 093 404 1225 86 Email:giangbacnguyenvu@gmail.com Chuyên Đề Ký Sinh Trùng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 ĐẶT VẤN ĐỀ Candida albicans vi nấm gây bệnh hội người, nay, vi nấm quan tâm lĩnh vực y học lâm sàng mà nghiên cứu sinh học Trong điều kiện bình thường, Candida albicans thành phần thuộc hệ vi sinh vật cộng sinh niêm mạc dày ruột niêm mạc âm đạo Ở người khỏe mạnh, Candida albicans gây số bệnh lý nhiễm trùng da Tuy nhiên, bệnh nhân suy giảm miễn dịch phát triển dạng Candida lan tỏa Có hai yếu tố định độc lực bệnh candidiasis hình thành biofilm xuyên qua màng tế bào Biofilm định nghĩa cấu trúc vi sinh bám lên bề mặt bao lấy khối vật liệu polymer1 Biofilm phát triển bề mặt khoang miệng, thực quản, van tim Ngồi ra, biofilm phát triển vật liệu cấy ghép máy điều hòa nhịp tim, stent, ống thông đường tiểu Biofilm nguyên nhân gây tái nhiễm tăng khả đề kháng Candida albicans với thuốc kháng nấm Ngoài nghiên cứu tác động chất kháng nấm thường gặp vấn đề không tương đồng tác động kháng nấm in vitro in vivo Do đó, việc sử dụng mơ hình thử nghiệm ex vivo nghiên cứu Candida albicans quan tâm Trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tơi dò tìm điều kiện để C albicans tạo biofilm nhựa polystyrene nhiễm bệnh mô móng tay người khỏe mạnh cắt rời, áp dung mơ hình để khảo sát hoạt tính số chất kháng nấm ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Candida albicans ATCC 10231 Chất kháng nấm: Dầu Riềng (DR) chiết từ thân rễ Riềng nếp Alpinia galangal Zingiberaceae, chứa 45% acetoxychavicol aceate, định lượng GC-MS Nghiên cứu Y học Bơng móng tay Impatiens balsamina L Balsaminaceae, chứa khoảng 70% 2-methoxy1,4-naphthoquinon định lượng phương pháp đo quang UV-Vis2 Tinh dầu Hương nhu trắng (HNT) chiết từ Hương nhu trắng Ocimum gratissimum Lamiaceae chứa khoảng 60% eugenol, định lượng GC-MS Chất đối chiếu: ketoconazol, terbinafin HCl, nystatin Phương pháp nghiên cứu:1, Điều kiện để C albicans phát triển dạng biofilm bảng nhựa 96 giếng: C albicans hoạt hóa mơi trường YPG lỏng nhiệt độ 37oC 48 Ly tâm loại bỏ phần môi trường, cắn rửa lần với dung dịch PBS Hòa tan phần cắn mơi trường Glucose-Glycin cho số tế bào nấm men 106 CFU/ml (xác định mật độ quang học OD=0,1) Dùng pipette nhiều kênh cho dịch nấm vào bảng nhựa 96 giếng Đậy nắp ủ nhiệt độ 37oC Sau thời gian 48 giờ, hút bỏ phần môi trường, rửa giếng lần với dung dịch PBS Chú ý rửa nhẹ nhàng để tránh làm ảnh hưởng đến biofilm hình thành đáy giếng Thử hoạt tính chất kháng nấm dạng biofilm: Chất kháng nấm hòa tan DMSO, sau pha lỗng mơi trường YPG để có dãy nồng độ mong muốn trước cho vào bảng nhựa Cao bơng móng tay: µg/ml - 0,125 µg/ml 256 Tinh dầu hương nhu: 0,00047 µg/ml µl/ml - Nystatin: 32 µg/ml – 0,015 µg/ml Ketoconazol: 10 µg/ml – 0,00094 µg/ml Quan sát phát triển trở lại vi nấm từ dạng biofilm mắt thường để xác định nồng độ chất kháng nấm có khả ức chế dạng biofilm Cao Bơng móng tay (BMT) chiết từ vỏ qua Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 87 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Gây nhiễm C.albicans móng tay người khỏe mạnh:4 Móng tay người tình nguyện, khỏa mạnh, khơng có bệnh móng khơng sơn móng tay vòng tháng cắt thành mảnh 3x3 mm, rửa lần với EtOH 70% nước muối sinh lý Móng làm khơ nhiệt độ phòng trước gây nhiễm C albicans hoạt hóa mơi trường YPG lỏng nhiệt độ 37oC 48 Sau ly tâm, bỏ phần môi trường, phân tán phần cắn nước muối sinh lý để đạt số lượng vi nấm 107 CFU/ml (xác định buồng đếm hồng cầu Neubauer) Pha dịch treo vi nấm môi trường thạch nước cho nồng độ đạt 106 CFU/ml hộp petri vơ trùng Đặt móng tay xử lý vào mơi trường cho móng tiếp xúc với thạch chứa nấm, nấm sử dụng móng nguồn dinh dưỡng Sau ngày 37oC quan sát phát triển vi nấm móng kính hiển vi Thử hoạt tính chất kháng nấm: Chất kháng nấm hòa tan dung dung dịch PEG:cồn tuyệt đối (75:25), pha lỗng mơi trường thạch YPG để đạt dãy nồng độ thử nghiệm Terbinafin từ – 0,06 % Ketoconazole: – 0,06 % Cao bơng móng tay: 0,5 – 0,015 % Dầu Riềng 0,03 - 0,5% Tinh dầu Hương nhu trắng 0,3-2,5% Móng sau gây nhiễm chuyển sang mơi trường có chứa chất thử cho lưng móng tiếp xúc với mơi trường, móng hướng lên Sau 2-3 ngày quan sát phát triển trở lại vi nấm mắt thường kính hiển vi quang học để xác định khả kháng nấm chất thử Sau đó, chuyển móng sang mơi trường thạch YPG cho móng tiếp xúc với môi định nồng độ tối thiểu diệt nấm mơ móng KẾT QUẢ Tác động chất kháng nấm dạng biofilm Sau 48 giờ, quan sát kính hiển vi soi ngược thấy biofilm hình thành đáy tất giếng dạng sợi nấm bám dính vào bảng nhựa Bảng 1: Nồng độ tối thiểu ức chế C albicans dạng biofilm chất kháng nấm Chất kháng nấm Cao BMT Tinh dầu HNT Dầu Riềng Nystatin Ketoconazol MIC biofilm (µg/ml) 32 2,5 1,25 MIC in vitro (µg/ml) 16 0,6 0,03 Ghi chú: Số liệu nhận trung bình lần lập lại thử nghiệm Nồng độ tối thiểu ức chế C albicans dạng biofilm ketoconazol 1,25 µg/ ml, cao nồng độ MIC in vitro khoảng 40 lần Trong đó, với chất kháng nấm có nguồn gốc từ thực vật, nồng độ ức chế dạng biofilm cao MIC in vitro từ 2-8 lần (cao BMT lần, tinh dầu HNT lần DR lần) Tác động kháng nấm mơ hình móng nhiễm Bảng 2: Tác động kháng C.albicans mơ hình móng chất kháng nấm Chất kháng nấm Cao BMT Tinh dầu HNT Dầu Riềng Terbibafin Ketoconazol Nồng độ chất thử (mg/ml) MIC MIC MFC in vitro ex vivo ex vivo 0,016 1,25 2,5 0,6 1,25 1,25 0,001 0,5 0,5 20 -3 0,03x10 10 20 Ghi chú: (-): không thử trường, ủ 37 oC 48 giờ, quan sát phát Các nồng độ thử nghiệm đạt sau lần triển trở lại vi nấm Giai đoạn giúp xác thử với chứng dương lơ móng tay khơng 88 Chuyên Đề Ký Sinh Trùng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 tiếp xúc với chất thử BÀN LUẬN Tác động kháng C.albicans mơ hình tạo biofilm nhựa polystyrene Nystatin chất diệt nấm nên MIC biofilm gần MIC in vitro Các chất lại có nồng độ tối thiểu ức chế dạng biofilm cao nồng độ ức chế dạng men Ketoconazole chất kìm nấm thuộc nhóm 5imidazol, cho MIC biofilm gấp 40 lần nồng độ ức chế dạng men Trong đó, chất chiết xuất từ dược liệu cao BMT, dầu Riềng tinh dầu Hương nhu trắng lại có MIC biofilm gấp 2-8 lần MIC in vitro Đây tiền đề cho nghiên cứu sâu chất Tác động kháng C albicans mơ móng tay lập So sánh tác động kháng C.albicans ketoconazol mô hình móng nhiễm thấy tương đồng giữ nồng độ diệt nấm (MFC) nồng độ chế phẩm sử dụng thị trường 2% Điều cho thấy mơ hình móng nhiễm lập minh chứng Chuyên Đề Ký Sinh Trùng Nghiên cứu Y học khoa học cho việc dự đoán liều sử dụng in vivo cho chất kháng nấm Đối với chiết xuất từ dược liệu, dầu Riềng có MIC in vitro thấp MIC ex vivo cao gấp 500 lần Cao BMT cho tác động kháng C.albicans móng nhiễm nồng độ 0,25%, gấp 156 lần MIC in vitro Tinh dầu HNT cho tác động kháng C.albicans móng nhiễm gấp 40 lần MIC in vitro Kết cho thấy khả thấm vào móng tốt chiết xuất từ dược liệu chất hóa học Tài liệu tham khảo Erst JE and Roger PD (2007) Antifungal agent-methods and protocols In: Erst J.E Method in Molecular medicine,Vol.188, pp 71-75 Humana Press Inc, Totowa, NJ Trần Thành Đạo, Nguyễn Đinh Nga (2009) Tổng hợp tác dụng kháng nấm methyl lawson, thành phần Bơng móng tay Tạp chí Dược học, 49(395): 29-32 Vardecer-Unlu Gulhan (1998) A comparison of germ tube production by Candida albicans in three media Tr.J of Biology, 22: 2005-2010 Yazdanparast SA and Richard CB(2006) Arthroconidia production in Trichophyton rubrum and a new ex vivo model of onychomycosis Journal of Medical Microbiology, 55: 15771581 89 ... khả đề kháng Candida albicans với thuốc kháng nấm Ngoài nghiên cứu tác động chất kháng nấm thường gặp vấn đề không tương đồng tác động kháng nấm in vitro in vivo Do đó, việc sử dụng mơ hình thử... DR lần) Tác động kháng nấm mơ hình móng nhiễm Bảng 2: Tác động kháng C .albicans mơ hình móng chất kháng nấm Chất kháng nấm Cao BMT Tinh dầu HNT Dầu Riềng Terbibafin Ketoconazol Nồng độ chất thử... mạnh cắt rời, áp dung mơ hình để khảo sát hoạt tính số chất kháng nấm ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Candida albicans ATCC 10231 Chất kháng nấm: Dầu Riềng (DR) chiết