Mục tiêu của nghiên cứu nhằm khảo sát điều kiện thích hợp để candida albicans phát triên dưới dạng biofilm và gây nhiễm móng thực nghiệm. Áp dụng các mô hình thực nghiệm này để khảo sát tác động của các chất kháng nấm.
Trang 1Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012
ỨNG DỤNG MỘT SỐ MÔ HÌNH KHẢO SÁT TÁC DỤNG
CỦA CHẤT KHÁNG NẤM EX VIVO TRÊN CANDIDA ALBICANS
Nguyễn Vũ Giang Bắc*, Nguyễn Đinh Nga*
TÓM TẮT
Mục tiêu nghiên cứu: khảo sát điều kiện thích hợp để Candida albicans phát triên dưới dạng biofilm và gây
nhiễm móng thực nghiệm Áp dụng các mô hình thực nghiệm này để khảo sát tác động của các chất kháng nấm
Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát các điều kiện môi trường, lượng nấm, thời gian ủ thích hợp để C
albicans phát triển ở dạng biofilm trên bảng nhựa 96 giếng và nhiễm móng cô lập Sử dụng mô hình để khảo sát tác động của một chất kháng nấm có nguồn thực vật, so sánh với ketoconazol, nystatin, terbinafin Qua đó xác định cách đọc và điểm dừng đọc kết quả
Kết quả: Đã đề nghị được các điều kiện để C albicans phát triển ở dạng biofilm trên bảng nhựa 96 giếng và
nhiễm móng cô lập Xác định được cách đọc và điểm dừng đọc kết quả thích hợp Nồng độ tối thiểu ức chế C albicans dạng biofilm của các chất thử thường cao hơn nồng độ ức chế dạng men Nồng độ diệt C albicans trên móng nhiễm của các chất thử thấp hơn ketoconazole và terbinafin và phù hợp với liều của các chất này ở các thuốc dùng ngoài
Kết luận: Có thể sử dụng các mô hình thử nghiệm hoạt tính kháng C.albicans ex vivo để phỏng đoán liều
thử nghiệm in vivo của một số chất kháng nấm mới
Từ khóa: Candida albicans, ex vivo, biofilm, móng nhiễm
ABSTRACT
EX VIVO MODELS FOR TESTING ANTIFUNGAL ACTIVITY AGAINST CANDIDA ALBICANS
Nguyen Vu Giang Bac, Nguyen Dinh Nga
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No 1 - 2012: 86 - 89
Objective: study experimental condition for biofilm’s formulation and nail infection of Candida albicans
Using these model to test antifungal activity of several compounds
Method: survey medium, volume of colonies, incubation time for formulating biofilm on 96-well plate and
infecting nail of Candida albicans Applied these model for antifungal agents from medical plants, compared with ketoconazole, terbinafine and nystatine Whereby, determine method and breakpoint to observe results
Result: we determined conditions for Candida albicans to form biofilm on 96-well plate and infect nail,
method to obtain results and breakpoints The MICs of these compounds against Candida albicans biofilm were higher than MICs against yeast cells The MFCs on nail infected were lower than ketoconazole and terbinafine, it
is suitable to dermal dosage of these compounds
Conclusion: We could use these ex vivo models to guess in vivo dosage of new antifungal agents, therefore,
it could decrease time and expenditure for research.
Keyword: Candida albicans, ex vivo, biofilm, nail infected
Khoa Dược, Đại học Y Dược TPHCM
Tác giả liên lạc: DS Nguyễn Vũ Giang Bắc ĐT: 093 404 1225 Email:giangbacnguyenvu@gmail.com
Trang 2Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học ĐẶT VẤN ĐỀ
Candida albicans là một vi nấm gây bệnh cơ
hội ở người, hiện nay, vi nấm này đang được
quan tâm không những ở lĩnh vực y học lâm
sàng mà còn trong các nghiên cứu sinh học cơ
bản Trong điều kiện bình thường, Candida
albicans là thành phần thuộc hệ vi sinh vật cộng
sinh ở niêm mạc dạ dày ruột và niêm mạc âm
đạo Ở người khỏe mạnh, Candida albicans có thể
gây ra một số bệnh lý nhiễm trùng ngoài da
Tuy nhiên, ở những bệnh nhân suy giảm miễn
dịch thì sẽ phát triển dạng Candida lan tỏa Có
hai yếu tố quyết định độc lực của bệnh
candidiasis là hình thành biofilm hoặc xuyên
qua màng tế bào Biofilm được định nghĩa là cấu
trúc vi sinh bám lên bề mặt hoặc bao lấy khối
vật liệu polymer1 Biofilm phát triển trên bề mặt
của khoang miệng, thực quản, van tim Ngoài
ra, biofilm còn phát triển ở các vật liệu cấy ghép
như máy điều hòa nhịp tim, stent, ống thông
đường tiểu Biofilm là nguyên nhân gây ra tái
nhiễm và tăng khả năng đề kháng của Candida
albicans với các thuốc kháng nấm
Ngoài ra khi nghiên cứu tác động của chất
kháng nấm mới thường gặp vấn đề không
tương đồng giữa tác động kháng nấm in vitro và
in vivo Do đó, việc sử dụng các mô hình thử
nghiệm ex vivo trong nghiên cứu Candida albicans
đang được quan tâm Trong phạm vi nghiên
cứu này, chúng tôi dò tìm điều kiện để C
albicans tạo biofilm trong bản nhựa polystyrene
và nhiễm bệnh mô móng tay của người khỏe
mạnh cắt rời, áp dung mô hình để khảo sát hoạt
tính của một số chất kháng nấm
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Candida albicans ATCC 10231
Chất kháng nấm:
Dầu Riềng (DR) chiết từ thân rễ Riềng nếp
Alpinia galangal Zingiberaceae, chứa ít nhất
45% acetoxychavicol aceate, định lượng bằng
GC-MS
Cao Bông móng tay (BMT) chiết từ vỏ qua
cây Bông móng tay Impatiens balsamina L Balsaminaceae, chứa khoảng 70% 2-methoxy-1,4-naphthoquinon định lượng bằng phương pháp đo quang UV-Vis2
Tinh dầu Hương nhu trắng (HNT) chiết từ cây Hương nhu trắng Ocimum gratissimum Lamiaceae chứa khoảng 60% eugenol, định lượng bằng GC-MS
Chất đối chiếu: ketoconazol, terbinafin HCl, nystatin
Phương pháp nghiên cứu:1, 3
Điều kiện để C albicans phát triển ở dạng biofilm trên bảng nhựa 96 giếng: C albicans
được hoạt hóa trong môi trường YPG lỏng ở nhiệt độ 37oC trong 48 giờ Ly tâm và loại bỏ phần môi trường, cắn được rửa 2 lần với dung dịch PBS Hòa tan phần cắn trong môi trường Glucose-Glycin sao cho số tế bào nấm men là 106 CFU/ml (xác định bằng mật độ quang học OD=0,1) Dùng pipette nhiều kênh cho dịch nấm vào bảng nhựa 96 giếng Đậy nắp và ủ ở nhiệt
độ 37oC Sau thời gian 48 giờ, hút bỏ phần môi trường, rửa giếng 2 lần với dung dịch PBS Chú
ý rửa nhẹ nhàng để tránh làm ảnh hưởng đến biofilm hình thành ở đáy giếng
Thử hoạt tính của chất kháng nấm trên dạng biofilm:
Chất kháng nấm được hòa tan trong DMSO, sau đó được pha loãng trong môi trường YPG
để có dãy nồng độ mong muốn trước khi cho vào bảng nhựa
Cao bông móng tay: 256 µg/ml - 0,125 µg/ml
Tinh dầu hương nhu: 5 µl/ml -0,00047 µg/ml
Nystatin: 32 µg/ml – 0,015 µg/ml Ketoconazol: 10 µg/ml – 0,00094 µg/ml Quan sát sự phát triển trở lại của vi nấm từ dạng biofilm bằng mắt thường để xác định nồng
độ chất kháng nấm có khả năng ức chế dạng biofilm
Trang 3Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012
Gây nhiễm C.albicans trên móng tay người
khỏe mạnh: 4
Móng tay người tình nguyện, khỏa mạnh,
không có bệnh gì về móng và không được sơn
móng tay trong vòng 6 tháng được cắt thành
mảnh 3x3 mm, rửa sạch 3 lần với EtOH 70% và
nước muối sinh lý Móng được làm khô ở nhiệt
độ phòng trước khi gây nhiễm
C albicans được hoạt hóa trong môi trường
YPG lỏng ở nhiệt độ 37oC trong 48 giờ Sau khi
ly tâm, bỏ phần môi trường, phân tán đều phần
cắn trong nước muối sinh lý để đạt số lượng vi
nấm là 107 CFU/ml (xác định bằng buồng đếm
hồng cầu Neubauer) Pha dịch treo vi nấm trong
môi trường thạch nước sao cho nồng độ đạt 106
CFU/ml trong hộp petri vô trùng Đặt móng tay
đã xử lý vào môi trường sao cho nền móng tiếp
xúc với thạch chứa nấm, như vậy nấm chỉ sử
dụng móng là nguồn dinh dưỡng duy nhất Sau
7 ngày ử ở 37oC thì quan sát sự phát triển của vi
nấm trên móng dưới kính hiển vi
Thử hoạt tính của chất kháng nấm:
Chất kháng nấm được hòa tan trong dung
dung dịch PEG:cồn tuyệt đối (75:25), rồi pha
loãng trong môi trường thạch YPG để đạt dãy
nồng độ thử nghiệm
Terbinafin từ 2 – 0,06 %
Ketoconazole: 2 – 0,06 %
Cao bông móng tay: 0,5 – 0,015 %
Dầu Riềng 0,03 - 0,5%
Tinh dầu Hương nhu trắng 0,3-2,5%
Móng sau khi gây nhiễm được chuyển sang
môi trường có chứa chất thử sao cho lưng móng
tiếp xúc với môi trường, nền móng hướng lên
trên Sau 2-3 ngày thì quan sát sự phát triển trở
lại của vi nấm bằng mắt thường và kính hiển vi
quang học để xác định khả năng kháng nấm của
chất thử
Sau đó, chuyển móng sang môi trường
thạch YPG sao cho nền móng tiếp xúc với môi
trường, ủ ở 37 oC trong 48 giờ, quan sát sự phát
triển trở lại của vi nấm Giai đoạn này giúp xác
định nồng độ tối thiểu diệt nấm trên mô móng
KẾT QUẢ Tác động của chất kháng nấm trên dạng biofilm
Sau 48 giờ, quan sát dưới kính hiển vi soi ngược đã thấy biofilm hình thành ở đáy tất cả các giếng dưới dạng sợi nấm bám dính vào bảng nhựa
Bảng 1: Nồng độ tối thiểu ức chế C albicans dạng
biofilm của các chất kháng nấm
Chất kháng nấm MIC biofilm
(µg/ml)
MIC in vitro (µg/ml)
Ghi chú: Số liệu nhận được là trung bình của
9 lần lập lại thử nghiệm
Nồng độ tối thiểu ức chế C albicans dạng
biofilm của ketoconazol là 1,25 µg/ ml, cao
hơn nồng độ MIC in vitro khoảng 40 lần
Trong khi đó, với các chất kháng nấm có nguồn gốc từ thực vật, nồng độ ức chế dạng
biofilm chỉ cao hơn MIC in vitro từ 2-8 lần (cao
BMT là 2 lần, tinh dầu HNT là 4 lần và DR là 8 lần)
Tác động kháng nấm trên mô hình móng nhiễm
Bảng 2: Tác động kháng C.albicans ở mô hình móng
của các chất kháng nấm
Chất kháng nấm Nồng độ chất thử (mg/ml)
MIC
in vitro
MIC
ex vivo
MFC
ex vivo
Ghi chú: (-): không thử
Các nồng độ thử nghiệm đạt được sau 6 lần thử với chứng dương là lô móng tay không
Trang 4Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 1 * 2012 Nghiên cứu Y học
được tiếp xúc với chất thử
BÀN LUẬN
Tác động kháng C.albicans ở mô hình tạo
biofilm trên bản nhựa polystyrene
Nystatin là chất diệt nấm nên MIC trên
biofilm gần bằng MIC in vitro Các chất còn lại
đều có nồng độ tối thiểu ức chế dạng biofilm
cao hơn nồng độ ức chế dạng men
Ketoconazole là chất kìm nấm thuộc nhóm
5-imidazol, cho MIC trên biofilm gấp 40 lần nồng
độ ức chế dạng men Trong khi đó, các chất
được chiết xuất từ dược liệu như cao BMT, dầu
Riềng và tinh dầu Hương nhu trắng lại có MIC
biofilm chỉ gấp 2-8 lần MIC in vitro Đây có thể
là những tiền đề cho nghiên cứu sâu hơn về các
chất này
Tác động kháng C albicans trên mô móng
tay cô lập
So sánh tác động kháng C.albicans của
ketoconazol trên mô hình móng nhiễm có thể
thấy sự tương đồng giữ nồng độ diệt nấm
(MFC) và nồng độ của chế phẩm đang sử dụng
trên thị trường là 2% Điều này cho thấy mô
hình móng nhiễm cô lập có thể là minh chứng
khoa học cho việc dự đoán liều sử dụng in vivo
cho các chất kháng nấm mới
Đối với các chiết xuất từ dược liệu, dầu
Riềng có MIC in vitro thấp nhất nhưng MIC ex
vivo cao gấp 500 lần Cao BMT cho tác động
kháng C.albicans trên móng nhiễm ở nồng độ 0,25%, chỉ gấp 156 lần MIC in vitro Tinh dầu HNT cho tác động kháng C.albicans trên móng nhiễm chỉ gấp 40 lần MIC in vitro Kết quả này
cho thấy khả năng thấm vào móng tốt của các chiết xuất từ dược liệu hơn các chất hóa học
Tài liệu tham khảo
1 Erst JE and Roger PD (2007) Antifungal agent-methods and protocols In: Erst J.E Method in Molecular medicine,Vol.188,
pp 71-75 Humana Press Inc, Totowa, NJ
2 Trần Thành Đạo, Nguyễn Đinh Nga (2009) Tổng hợp và tác dụng kháng nấm của methyl lawson, thành phần chính của cây Bông móng tay Tạp chí Dược học, 49(395): 29-32
3 Vardecer-Unlu Gulhan (1998) A comparison of germ tube
production by Candida albicans in three media Tr.J of Biology,
22: 2005-2010
4 Yazdanparast SA and Richard CB(2006) Arthroconidia
production in Trichophyton rubrum and a new ex vivo model of
onychomycosis Journal of Medical Microbiology, 55:
1577-1581