Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xác định các điều kiện của kỹ thuật seminested PCR phát hiện nấm Candida albicans và thử nghiệm áp dụng kỹ thuật seminested PCR đ xác định một s ch ng nấm Candida albicans phân lập Việt Nam.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP KỸ THUẬT SEMINESTED PCR PHÁT HIỆN NẤM CANDIDA ALBICANS Đỗ Ngọc Ánh*; Hoàng Cao Sạ** Đoàn Ngọc Giang Lâm***; Phạm Văn Minh* TÓM TẮT Mục tiêu: xác định điều kiện thử nghiệm áp dụng kỹ thuật seminested PCR phát nấm Candida albicans Phương pháp: thiết lập kỹ thuật seminested PCR sở gen đích mã hóa ® rARN chủng nấm Candida albicans ATCC 90028 đánh giá thử 27 chủng nấm Candida albicans phân lập Việt Nam Kết quả: xác định đƣợc điều kiện phản ứng PCR1, PCR2 2+ nhƣ ngƣỡng phát hiện, tính đặc hiệu kỹ thuật PCR 1: nồng độ Mg 1,5 mM, dNTPs 150 µM, o 2+ nồng độ mồi 0,2 - 0,3 pmol/µl nhiệt độ gắn mồi 55 C PCR2: nồng độ Mg 2,0 mM, dNTPs o 200 µM, nồng độ mồi 0,2 pmol/µl nhiệt độ gắn mồi 55,2 C Kỹ thuật seminested PCR có khả phát xác nấm C abicans ngƣỡng ≥ 10 pg/µl Sau đƣợc thiết lập, đánh giá kỹ thuật ADN 27 chủng C albicans phân lập Việt Nam, kết cho thấy, 27 chủng cho band đặc hiệu có kích thƣớc 410 bp nhƣ mong đợi Kết luận: kỹ thuật seminested PCR thu đƣợc cho phép xác định xác nấm Candida albicans * Từ khóa: Candida albicans; Seminested PCR Development of Seminested PCR for Detection of Candida Albicans Summary Aims: To establish and evaluate a system of seminested polymerase chain reaction (PCR) ® assays to identify Candida albicans Methods: DNA of Candida albicans ATCC 90028 and 27 samples from Vietnam was extracted and used as a template in PCR assays targeting the ribosomal DNA of Candida albicans Results: PCR1 and PCR2 assays were optimized to 2+ detect exactly rRNA gene of Candida albicans PCR1 with 1.5 mM Mg , 150 µM of each o deoxyribonucleotide, 0.2 - 0.3 pmol/µl of each primer and annealing temperature 55 C PCR2 2+ with 1.5 mM Mg , 200 µM of each deoxyribonucleotide, 0.2 pmol/µl of each primer and annealing o temperature 55.2 C The limited concentration for detection of C albicans was not less than 10 pg per µl DNA of C albicans in total volume of PCR1 assay We obtained positive reactions for all 27/27 samples from patients who had been previously diagnosed with Candidiasis of C albicans by conventional techniques Conclusions: The seminested PCR assays described here can support the diagnosis of Candida albicans * Key words: Candida albicans; Seminested PCR * Học viện Quân y ** Bệnh viện Đa khoa Nam Định *** Bệnh viện TWQĐ 108 Người phản hồi (Corresponding): Đỗ Ngọc Ánh (dranhk61@gmail.com) Ngày nhận bài: 30/05/2015; Ngày phản biện đánh giá báo: 09/07/2015 Ngày báo đăng: 20/07/2015 27 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 ĐẶT VẤN ĐỀ Candida sp nấm men sống hội sinh đƣờng tiêu hóa đƣờng sinh dục, có 70% dân số khoảng 75% phụ nữ bị nhiễm nấm lần đời [5, 6] Tuy nhiên, thể có nhiều yếu tố thuận lợi, nấm chuyển từ hội sinh sang gây bệnh Bệnh nấm Candida sp đƣợc phân thành hai nhóm: nhóm gây tổn thƣơng da, niêm mạc nhóm gây bệnh nội tạng Bệnh nấm Candida sp nội tạng trầm trọng, chúng đe dọa mạng sống tû lệ tử vong lên lên tới 30% [9] Đối với nhiễm Candida sp máu, tỷ lệ tử vong lên tới 50% [7, 8], đặc biệt trẻ sơ sinh [10] Vì lý trên, Candida sp trở thành tác nhân gây bệnh nguy hiểm ngƣời Việc xác định xác ngun gây bệnh đóng vai trò quan trọng lựa chọn phƣơng pháp điều trị Do đó, ngƣời nghi nhiễm Candida sp., nấm loài nấm gây bệnh cần đƣợc phát hiện, xác định sớm để có biện pháp điều trị kịp thời Trong số Candida sp., Candida albicans loài nấm phổ biến Một số nấm khác gặp nhƣng Candida glabrata, Candida krusei, Candida dubliniensis, Candida parapsilosis Candida tropicalis [4] Các phƣơng pháp xét nghiệm chẩn đoán nấm đƣợc sử dụng chủ yếu là: phƣơng pháp xét nghiệm trực tiếp, phƣơng pháp nuôi cấy, phƣơng pháp huyết Ƣu điểm phƣơng pháp xét nghiệm trực tiếp soi tƣơi nhanh, đơn giản, dễ thực hiện, độ đặc hiệu cao nhƣng độ nhạy thấp Ni cấy có độ xác cao 28 soi tƣơi nhƣng phải sau - ngày có kết [3] Phát kháng nguyên vỏ độ nhạy cao nhƣng độ đặc hiệu thấp, tỷ lệ dƣơng tính giả âm tính giả cao Mặt khác, trƣờng hợp nấm gây bệnh máu, mô chẩn đốn phƣơng pháp gặp nhiều khó khăn Hơn nữa, phân lập đƣợc nấm, việc xác định lồi nấm lồi phƣơng pháp truyền thống gặp nhiều khó khăn, cần nhiều thời gian [3] Hiện nay, công nghệ sinh học phân tử phát triển giúp xác định nhanh loài vi sinh vật với độ nhạy độ đặc hiệu cao Tuy nhiên, vấn đề ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán nấm Việt Nam mẻ Nhằm góp phần phát triển kỹ thuật sinh học phân tử vào chẩn đoán nấm Việt Nam, tiến hành nghiên cứu nhằm: - Xác định u kiện c a k thuật seminested PCR phát nấm Candida albicans - Th nghiệm áp dụng k thuật seminested PCR đ xác định s ch ng nấm Candida albicans phân lập Việt Nam ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu - 01 chủng nấm chuẩn Candida albicans ATCC®90028 - 27 chủng nấm Candida albicans phân lập từ máu, dịch âm đạo Việt Nam Vật liệu nghiên cứu - Dụng cụ: máy PCR (Eppendorf, Đức), máy ly tâm lạnh Mikro 22R (Hettech, Đức), TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 máy soi chụp gel Dolphin Doc (Wealtec, Mỹ), điện di - Sinh phẩm hóa chất: mơi trƣờng Sabouraud, dung dịch NaCl 0,9%, dung dịch mực tàu, kít tách ADN tổng số (QIAGEN, Mỹ), gel agarose, dung dịch TBE 0,5%, dung dịch enzym giới hạn MspI (Fermentas), hóa chất cần thiết khác - Cặp mồi cho phản ứng PCR: cặp mồi ITS1 (forward, 5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’) ITS4 (reverse, 5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’) đƣợc chọn (SH Mirhendi CS, 2001) đƣợc sử dụng cho vòng 1, kích thƣớc đoạn gen thu đƣợc 535bp Đoạn gen chứa phần đoạn 18S, phần đoạn 28S, toàn đoạn giao gen ITS1, 5.8S ITS2 Cặp mồi CalF (5’-TCAACTTGTCACACCAGATTATT-3’) ITS4 đƣợc sử dụng cho vòng 2, kích thƣớc đoạn gen thu đƣợc 410 bp Phƣơng pháp nghiên cứu * Phân lập mẫu nấm s nghiên cứu: dụng mix, ADN tổng số, mồi nƣớc cất khử ion vừa đủ 25 μl Thời gian chạy phản ứng PCR1 nhƣ sau: chu kỳ 95oC phút; 25 chu kỳ chu kỳ gồm 95oC/45 giây, 55oC/45 giây, 72oC/1 phút; chu kỳ 72oC/10 phút Sản phẩm phản ứng PCR1 đƣợc bảo quản 4oC thực phản ứng PCR2 Phản ứng PCR2 có điều kiện tƣơng tự nhƣ phản ứng PCR1, nhƣng nhiệt độ gắn mồi 55,2oC số chu kỳ 30 lần * Ki m tra sản phẩm PCR: Điện di sản phảm PCR sản phẩm cắt giới hạn thạch agarose 1,2% 2% môi trƣờng đệm TBE với thời gian 45 phút điện 100V * Ki m tra ngưỡng phát hiện: Pha ADN nấm thành dung dịch treo có nồng độ từ 10 -7 - 10-1 ng/µl Lấy µl dung dịch ADN chạy PCR điều kiện nhƣ Ngƣỡng phát giới hạn thấp mà kết PCR2 nhìn rõ mắt thƣờng điện di * Ki m tra tính đặc hiệu: Nấm C albicans chuẩn đƣợc phân lập từ ống chứa theo hƣớng dẫn nhà sản xuất (ATCC, Mỹ) Các chủng nấm C albicans Việt Nam đƣợc phân lập từ máu dịch âm đạo cña bệnh nhân nhiễm nấm cách cấy môi trƣờng thạch sabouraud có kháng sinh Thực phản ứng PCR1 với cặp mồi ITS1 ITS4 ADN vi nấm men Candida non-albicans vi khuẩn S aureus, A baumannii, K pneumoniae, E coli, P aeruginosa, M tuberculosis, ADN virut viêm gan B ngƣời… để kiểm tra tính đặc hiệu * Tách ADN nhân đoạn gen đặc hiệu: Địa điểm thời gian nghiên cứu Tách chiết ADN nấm C albicans theo quy trình Hãng QUIAGEN (Mỹ) Sau đó, dùng ADN làm khu«n cho phản ứng PCR Thành phần phản ứng PCR gồm: master - Địa điểm nghiên cứu: labo Trung tâm Nghiên cứu Y Dƣợc học Quân labo nấm Bộ môn Ký sinh trùng, Học viện Quân y 29 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 - Thời gian nghiên cứu: từ - 2013 đến - 2015 Phân tích xử lý số liệu - Kết đo nồng độ ADN máy NanoDrop 1000 Các kết đƣợc ghi chép, lƣu trữ quy đổi theo đơn vị khác - Điện di phân tích kết phản ứng PCR với thang ADN chuẩn (100 bp) - So sánh phân tích kết giải trình tự Ngân hàng Gen http://blast ncbi.nlm.nih.gov - Xây dựng phả hệ phần mềm PHYLIP KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết xác định điều kiện cho phản ứng PCR * Kết xác định u kiện cho phản ứng PCR vòng ngồi (PCR1): Đ i với phản ứng PCR1, nghiên cứu xác định u kiện cho phản ứng thực t t, ổn định nồng độ Mg2+ 1,5 mM, dNTPs 150 µM, mồi 0,2 - 0, pmol/µl nhiệt độ gắn mồi 55oC… [1] * Kết xác định u kiện cho phản ứng PCR vòng (PCR2): Sau xác định đƣợc điều kiện cho phản ứng PCR1 nhƣ trên, thực phản ứng PCR1 nhƣng với 25 chu kỳ lấy sản phẩm thực phản ứng PCR2 để xác định điều kiện - Kết xác định nhiệt độ gắn mồi nồng độ Mg2+: Để tối ƣu nhiệt độ gắn mồi Ta, dựa theo lý thuyết Ta = Tm ± 5°C [2] Với cặp mồi CalF ITS4, ta có Tm = 56 58°C Ta = 51 - 63°C Thực tế, chọn nhiệt độ gắn mồi Ta = 52 - 58°C Để xác định nhiệt độ gắn mồi, chuẩn bị 11 phản ứng seminested PCR giống thành phần (trong [Mg2+ = 2.0 mM]) nhƣng chạy PCR theo gradient nhiệt độ gắn mồi mặc định cài đặt máy PCR Hình 1: Kết PCR với nhiệt độ gắn mồi 52 - 58°C nồng độ Mg2+= 2,0 mM 30 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 Ở dải nhiệt độ 52 - 58°C, tất giếng lên band đặc hiệu có kích thƣớc 410 bp Quan sát kỹ thấy, giếng tƣơng ứng với nhiệt độ gắn mồi 55,2°C cho band đặc hiệu sáng rõ nét Hình 3: Kết PCR2 với nhiệt độ gắn mồi nồng độ Mg2+ khác Hình 2: Kết PCR với nhiệt độ gắn mồi 55,2°C với nồng độ Mg2+ = 2,0 mM Dựa kết thu đƣợc, sử dụng nhiệt độ gắn mồi 55,2°C để đánh giá lại ổn định phản ứng PCR2 Để thực điều này, chuẩn bị phản ứng seminested PCR giống chạy PCR1 PCR2 điều kiện nhƣ với nhiệt độ gắn mồi PCR2 55,2°C Kết cho thấy giếng lên band đặc hiệu Vì vậy, 55,2°C đƣợc chọn làm nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng PCR2 Trong điều kiện nhiệt độ gắn mồi nồng độ Mg2+ khác, phản ứng PCR2 không ổn định có band phụ - Kết xác định u kiện nồng độ mồi, dNTPs, Taq DNA polymerase: Các u kiện khác đ phản ứng PCR2 thực t t là: nồng độ mồi hỗn dịch đem thực phản ứng 0,2 pmol/µl, nồng độ Taq ADN polymerase 0,025 UI/µl dNTPs 200 µM * Kết xác định ngưỡng phát tính đặc hiệu: Để kiểm tra ngƣỡng phát kỹ thuật seminested PCR, tiến hành pha loãng để tạo panel nồng độ ADN nấm Candida albicans giảm dần theo lũy thừa 10 từ - 10-5ng/µl đƣa vào thực phản ứng PCR1, PCR2 với điều kiện tối ƣu nhƣ 31 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 aureus, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis, ADN ngƣời ADN virut viêm gan B Hình 4: Kết phản ứng PCR với nồng độ ADN khác ((-): chứng âm, (+): chứng dương với nồng độ ADN ban đầu 5.12 ng/μl, 1: nồng độ ADN ng/μl, 2: nồng độ ADN 10-1 ng/μl, 3: nồng độ DNA 10 -2 ng/μl, 4: nồng độ ADN 10-3 ng/μl, 5: nồng độ ADN 10-4 ng/μl, 6: nồng độ ADN 10-5 ng/μl) Dựa vào kết quả, thấy giếng (+), 1, 2, tƣơng ứng với đồng độ ADN đƣa vào ng/µl, 10 -1 ng/µl 10 -2 ng/µl xuất band kích thƣớc 410 bp, giếng lại không xuất Nhƣ vậy, ngƣỡng phát kỹ thuật seminested PCR nồng độ ADN đƣa vào phản ứng PCR1 ≥ 10 -2 ng/μl (tƣơng đƣơng với 10 pg/µl) Một mặt, để kiểm chứng tính đặc hiệu kỹ thuật, tiến hành phản ứng PCR với ADN đích nấm Cryptococcus neoformans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Aspergillus fumigatus, Candida glabrata, Penicillium marneffei; ADN vi khuẩn Escherichia coli, Acinetobacter baumannii, Staphylococcus 32 Hình 5: Kết xác định tính đặc hiệu kỹ thuật seminested PCR ((-): Đ i chứng âm, (+): Candida albicans, 1: Cryptococcus neoformans, 2: Candida tropicalis, 3: Candida parapsilosis, 4: Aspergillus fumigatus, 5: Candida glabrata, 6: Penicillium marneffei, 7: Escherichia coli, 8: Acinetobacter baumannii, 9: Staphylococcus aureus, 10: Klebsiella pneumonia, 11: Pseudomonas aeruginosa, 12: Mycobacterium tuberculosis, 13: Hepatitis B virus, 14: Người) Chỉ có giếng chuẩn dƣơng xuất band có kích thƣớc 410 bp nấm Candida albicans Giếng chứng âm giếng loài nấm Candida sp., vi khuẩn, virut khác khơng lên band Nhƣ vậy, phản ứng TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 seminested PCR với cặp mồi ITS1ITS4 CalF-ITS4 nhân gen đích nấm Candida albicans Tuy nhiên, để kết xác cần thực thêm ADN đích loài vi nấm vi khuẩn gây bệnh khác Kết thử nghiệm áp dụng kỹ thuật seminested PCR xây dựng để xác định số chủng Candida albicans phân lập Việt Nam * Kết ki m tra trình tự đoạn gen 410 bp c a nấm Candida albicans: Để khẳng định thêm tính xác kỹ thuật, tiến hành giải trình tự đoạn gen thu đƣợc từ phản ứng PCR2 so sánh với Ngân hàng Gen Trình tự đƣợc xác định mối quan hệ phả hệ với nấm Candida albicans số loại nấm khác Ngân hàng Gen Kết cho thấy, đoạn gen thu đƣợc có trình tự tƣơng đồng 99% với Ngân hàng Gen có phả hệ thuộc nhóm lồi nấm Candida albicans (hình 6) Nhƣ vậy, kỹ thuật seminested PCR nhân đƣợc xác gen đích nấm C albicans Hình 7: Kết thử nghiệm kỹ thuật seminested PCR ADN số chủng Candida albicans phân lập Việt Nam Thử nghiệm kỹ thuật xây dựng 27 chủng Candida albicans phân lập Việt Nam cho band đặc hiệu có kích thƣớc 410 bp Kết phù hợp với kết xác định dựa đặc điểm hình thái, thử nghiệm huyết tất chủng phân lập đƣợc Điều cho thấy áp dụng kỹ thuật xây dựng bệnh phẩm lâm sàng nghi nhiễm Candida Hình 6: Quan hệ phả hệ chủng Candida albicans nghiên cứu với số Candida spp công bố Ngân hàng Gen albicans Tuy nhiên, để áp dụng kỹ thuật này, cần nghiên cứu kỹ vấn đề nhƣ: phƣơng pháp tách chiết ADN 33 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 nấm Candida albicans từ bệnh phẩm khác nhau, nghiên cứu thiết kế nội Trần Xuân Mai Vi nấm y học Trƣờng Đại học Y dƣợc TP HCM 2004 chứng… KẾT LUẬN Đã thiết lập xác định đƣợc điều kiện cho kỹ thuật seminested PCR phát nấm Candida albicans - Đã xây dựng đƣợc chu trình nhiệt cho hai vòng phản ứng kỹ thuật PCR1: chu kỳ 95oC/5 phút; 25 chu kỳ, chu kỳ gồm 95oC/45 giây, 55oC/45 giây, 72oC/1 phút; chu kỳ 72oC/10 phút Phản ứng PCR2 tƣơng tự nhƣ phản ứng PCR1 nhƣng nhiệt độ gắn mồi 55,2oC số chu kỳ 30 lần - Đã tối ƣu đƣợc thành phần hỗn hợp phản ứng kỹ thuật PCR1: nồng độ Mg2+1,5 mM, dNTPs 150 µM, nồng độ mồi 0,2 - 0,3 pmol/µl nhiệt độ gắn mồi 55oC PCR2: nồng độ Mg2+ 2,0 mM, dNTPs 200 µM, nồng độ mồi 0,2 pmol/µl nhiệt độ gắn mồi 55,2oC Thử nghiệm áp dụng kỹ thuật seminested PCR xây dựng 27 chủng nấm Candida albicans phân lập Việt Nam cho kết phù hợp TÀI LIỆU THAM KHẢO Đỗ Ngọc Ánh Ứng dụng kỹ thuật RFLPPCR phát nấm Cryptococcus neoformans gây bệnh ngƣời Tạp chí Y học Việt Nam 2013, số 34 Hồ Huỳnh Thùy Dương Sinh học phân tử NXB Giáo dục 2004 D Gozalbo, P Roig, E Villamón, and M L Gil Candida and candidiasis: the cell wall as a potential molecular target for antifungal therapy Current Drug Targets 2004, Vol (2), pp.117-135 JD Sobel Vaginitis New England Journal of Medicine 1997, Vol 337 (26), pp.1896-1903 M Ruhnke, G Maschmeyer Management of mycoses in patients with hematologic disease and cancer-review of the literature European Journal of Medical Research 2002, Vol (5), pp.227-223 O Gudlaugsson, S Gillespie, K Lee et al Attributable mortality of nosocomial candidemia, revisited Clinical Infectious Diseases 2003, Vol 37 (9), pp.1172-1177 P Eggimann, J Garbino, and D Pittet Epidemiology of Candida species infections in critically ill non-immunosuppressed patients Lancet Infectious Diseases 2003, Vol (11), pp.685-702 RA Calderone Candida and Candidiasis American Society for Microbiology Press, Washington, DC USA 2002 10 SJ Patel and L Saiman Antibiotic resistance in neonatal intensive care unit pathogens: mechanisms, clinical impact and prevention including antibiotic stewardship Clinics in Perinatology 2010, Vol 37 (3), pp.547-563 ... đốn nấm Việt Nam, chúng tơi tiến hành nghiên cứu nhằm: - Xác định u kiện c a k thuật seminested PCR phát nấm Candida albicans - Th nghiệm áp dụng k thuật seminested PCR đ xác định s ch ng nấm Candida. .. 6) Nhƣ vậy, kỹ thuật seminested PCR nhân đƣợc xác gen đích nấm C albicans Hình 7: Kết thử nghiệm kỹ thuật seminested PCR ADN số chủng Candida albicans phân lập Việt Nam Thử nghiệm kỹ thuật xây... nấm Candida albicans phân lập Việt Nam ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu - 01 chủng nấm chuẩn Candida albicans ATCC®90028 - 27 chủng nấm Candida albicans phân lập từ máu,