Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa ex vivo của cao trà xanh giàu epigallocatechin-3-gallate (EGCG)

Các sản phẩm chứa polyphenol chiết xuất từ trà, đặc biệt là epigallocatechin-3-gallate (EGCG) - thành phần có hoạt tính sinh học hữu hiệu nhất trong nhóm hợp chất catechin của trà xanh, rất có giá trị về mặt khoa học và thương mại. Việc nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của cao trà xanh giàu EGCG rất cần thiết để góp phần khẳng định vai trò của trà xanh trong việc phòng và chữa trị nhiều loại bệnh khác nhau. Vì vậy nghiên cứu với mục tiêu thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa của cao trà xanh giàu EGCG trên chuột nhắt.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA EX VIVO CỦA CAO TRÀ XANH GIÀU EPIGALLOCATECHIN-3-GALLATE (EGCG) Trần Lê Tuyết Châu*, Nguyễn Thị Thu Vân*, Trần Thị Vân Anh*, Dương Phước An*, Trần Phi Hồng Yến* TĨMTẮT Đặt vấn đề: Các sản phẩm chứa polyphenol chiết xuất từ trà, đặc biệt epigallocatechin-3-gallate (EGCG) – thành phần có hoạt tính sinh học hữu hiệu nhóm hợp chất catechin trà xanh, có giá trị mặt khoa học thương mại Việc nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa cao trà xanh giàu EGCG cần thiết để góp phần khẳng định vai trò trà xanh việc phòng chữa trị nhiều loại bệnh khác Mục tiêu: Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa cao trà xanh giàu EGCG chuột nhắt Phương pháp: Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa thơng qua hai số Malonyldialdehyd (MDA) protein carbonyl Kết quả: Với liều 60 mg EGCG/ kg thể trọng chuột, thử nghiệm 14 ngày thể hoạt tính chống oxy hóa rõ rệt thử nghiệm ngày thơng qua giảm hàm lượng MDA protein carbonyl nhóm thử thuốc so với nhóm tiêm CCl4 (p < 0,01) mơ hình gây viêm gan cấp tính CCl4 (0,4 mL/ kg) Kết luận: Liều 60 mg EGCG/ kg thể trọng chuột thể rõ hoạt tính chống oxy hóa cao trà xanh Từ khóa: Camellia sinensis, trà xanh, chống oxy hóa, MDA, protein carbonyl ABSTRACT ANTIOXIDATIVE ACTIVITY EX VIVO OF GREEN TEA EXTRACTS ENRICHED EPIGALLOCATECHIN-3-GALLATE (EGCG) Tran Le Tuyet Chau, Nguyen Thi Thu Van, Tran Thi Van Anh, Duong Phuoc An, Tran Phi Hoang Yen * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 130 - 134 Background: The product contains polyphenols, especially epigallocatechin-3-gallate (EGCG) - the most abundant catechin in green tea, are very valuable in scientific and trade Researching the antioxidant effect of green tea is needed to confirm the role of green tea in preventing and treating many different diseases Objective: The purpose of our work is to study the antioxidant effect of EGCG on mice Methods: The antioxidative activity of mice liver were evaluated by determining malonyldialdehyd and protein carbonyl Results: The antioxidant effect of EGCG after administering it perorally to mice at dose 60 mg/ kg mice body weight for 14 days is better than days by decreasing malonyldialdehyd and protein carbonyl on the model of acute hepatitis caused by CCl4 (0.4 mL/ kg) Conclusion: Dose 60 mg EGCG/ kg mice body weight was showed the antioxidant effect Key words: Camellia sinensis, green tea extract, antioxidant, MDA, protein carbonyl * Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS Trần Lê Tuyết Châu ĐT: 0903645131 130 Email: tuyetchau@gmail.com Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 ĐẶTVẤN ĐỀ Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) thành phần có hoạt tính sinh học mạnh nhóm hợp chất catechin trà xanh, có giá trị mặt khoa học thương mại – sản xuất với quy mô công nghiệp nước có vùng trồng trà tập trung lớn Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ… Tiềm sản phẩm chứa polyphenol chiết xuất từ trà để ngăn ngừa cải thiện bệnh mãn tính đối tượng nghiên cứu khoa học(3) Một số chế đề xuất để giải thích tác dụng có lợi trà, ví dụ: ức chế gốc tự chống oxy hóa(2) Các chứng in vitro cho thấy polyphenol trà có tác dụng chống oxy hóa trực tiếp gián tiếp nhiều hạn chế Vì việc nghiên cứu động vật thí nghiệm để đánh giá tính chất chống oxy hóa polyphenol dùng đường uống cần thiết VẬTLIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Cao trà xanh Cao chiết ethanol từ búp trà xanh (hàm lượng EGCG ≥ 60%) tiêu chuẩn hóa Động vật thử nghiệm Chuột nhắt trắng, đực, giống Swiss albino, trọng lượng 20±2 g (khoảng – tuần tuổi) Viện Vaccin Sinh phẩm Y tế Nha Trang cung cấp Nguyên liệu, hóa chất khảo sát Chất chuẩn 1,1’,3,3’-tetramethoxypropan, chất chuẩn Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) 98% mua từ công ty Sigma-Aldrich (Singapore), Acid trichloracetic, Ethyl acetate, Methanol mua từ công ty Merck (Đức) Xác định Malonyl dialdehyd (MDA)(4) Malonyl dialdehyd (MDA) sản phẩm cuối q trình peroxy hố lipid màng tế bào gây gốc tự MDA phản ứng với acid thiobarbituric tạo phức màu hồng Chuyên Đề Dược Khoa Nghiên cứu Y học có hấp thu cực đại bước sóng 532–535 nm Đo độ hấp thu phức suy lượng MDA mẫu Hoạt tính chống oxy hoá đánh giá tỉ lệ phần trăm lượng MDA giảm mẫu thử so với mẫu gây viêm gan cấp Phương pháp xác định protein carbonyl(1) Protein carbonyl sản phẩm sinh q trình oxy hóa protein, phản ứng với 2,4-dinitrophenylhydrazin (DNPH) tạo sản phẩm có màu vàng, đo quang bước sóng 370 nm Bảng Hỗn hợp phản ứng định lượng protein carbonyl Thành phần 100 mM PBS (pH 7,2) Ống chứng Ống thử 320 μl 320 μl 80 mM FeSO4.7H2O 20 μl 20 μl mM FeCl3.6H2O 20 μl 20 μl 20 μl M KCl 20 μl 0,4 M MgCl2.2H2O 20 μl 20 μl Dịch ly tâm 200 μl 200 μl Nước cất 120 μl 120 μl Tổng cộng 720 μl 720 μl Bố trí thí nghiệm Nhóm I (nhóm sinh lý) Được ni điều kiện bình thường cho chuột cách ly với thức ăn 16 trước tiến hành thí nghiệm Nhóm II (nhóm chứng) Tiêm phúc mơ liều dung mơi pha CCl4 điều kiện cho chuột cách ly với thức ăn 16 trước tiến hành thí nghiệm Nhóm III (tiêm CCl4) 24 trước kết thúc thí nghiệm, tiêm phúc mơ liều CCl4 (0,4 mL CCl4/ kg thể trọng chuột) cho chuột cách ly với thức ăn 16 trước tiến hành thí nghiệm Nhóm IV (thử thuốc) Cho chuột uống cao trà xanh với liều 60 mg EGCG/ kg ngày 14 ngày, tiêm phúc mô liều CCl4 (0,4 mL/ kg) vào 131 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học ngày cuối cho chuột cách ly với thức 0,9 0,8 0,7 ăn 16 trước tiến hành thí nghiệm tính chống oxy hóa (lấy mẫu, cân, nghiền mẫu ) tiến hành – 4oC Xử lý phân tích số liệu Đ ộ hấp thu Lưu ý: giai đoạn thử nghiệm hoạt Số liệu thực nghiệm biểu diễn y = 0,0258x + 0,0215 R = 0,9994 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 dạng Mean ± SEM Sử dụng phương pháp phân tích ANOVA yếu tố với Fisher’s PLTS Test Ý nghĩa thống kê xác định p < 0,01 10 15 20 25 30 Hàm lượng MDA (nmol/ ml) KẾTQUẢ Hình Đường chuẩn định lượng MDA Phương trình đường chuẩn MDA Kết định lượng MDA protein carbonyl Bảng Kết xây dựng đường chuẩn định lượng MDA STT Hàm lượng MDA chuẩn (nmol/ mL) 1,25 2,50 5,00 10,00 15,00 20,00 30,00 Độ hấp thu (A) Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) mẫu thử nghiệm tính theo tỉ lệ phần 0,0514 0,0787 0,1519 0,2808 0,4211 0,5351 0,7883 trăm lượng MDA protein carbonyl giảm mẫu thử so với mẫu tiêm CCl4 để gây viêm gan cấp Mô hình ngày Bảng Hàm lượng MDA protein carbonyl mơ hình ngày Nhóm n Hàm lượng MDA (nmol/ mL) I 8,817 ± 2,127 7,408 ± 1,024 II 9,470 ± 0,795 7,886 ± 1,199 III 29,651 ± 1,138 19,839 ± 0,398 IV 15,885 ± 2,136 46,43 (∗∗p < 0,01) 14,923 ± 1,106 24,78 (∗∗p < 0,01) 132 HTCO (%) Hàm lượng protein carbonyl (nmol/ mL) HTCO (%) Chuyên Đề Dược Khoa 35 Hàm lượng protein carbonyl (nmol/ Protein carbonyl concentration (nmol/ ml) mL) Hàm lượng MDA (nmol/ mL) Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 MDA concentration (nmol/ ml) 35 * 30 25 20 ** 15 10 I II IV III Nghiên cứu Y học 25 * 20 ** 15 10 I II IV III Group Nhóm Group Nhóm Hình Hàm lượng MDA protein carbonyl mơ hình ngày Nhận xét Hàm lượng MDA nhóm uống cao trà xanh (60 mg EGCG/ kg thể trọng chuột) giảm có ý nghĩa thống kê so với nhóm tiêm CCl4 (p < 0,01), HTCO đạt 46,43% Hàm lượng protein carbonyl nhóm uống cao trà xanh (60 mg EGCG/ kg thể trọng chuột) giảm có ý nghĩa thống kê so với nhóm tiêm CCl4 (p < 0,01), HTCO đạt 24,78% Bảng Hàm lượng MDA protein carbonyl mơ hình 14 ngày n I II III 6 6 MDA concentration (nmol/ ml) Hàm lượng MDA (nmol/ mL) IV Hàm lượng MDA (nmol/ mL) 8,928 ± 0,486 9,697 ± 0,907 29,699 ± 0,861 ∗∗ 50,19 ( p < 0,01) 14,792 ± 1,379 35 * 30 25 20 ** 15 10 I II Hàm lượng protein carbonyl (nmol/ mL) 7,196 ± 0,546 7,492 ± 1,618 20,392 ± 0,979 HTCO (%) III Nhóm Group IV Protein carbonyl concentration Hàm lượng protein carbonyl(nmol/ (nmol/ml) mL) Nhóm HTCO (%) ∗∗ 33,02 ( p < 0,01) 13,658 ± 1,513 30 25 * 20 ** 15 10 I II III IV Group Nhóm Hình Hàm lượng MDA protein carbonyl mơ hình 14 ngày HTCO đạt 50,19%, thể rõ khả chống Nhận xét oxy EGCG Hàm lượng MDA nhóm uống cao trà Hàm lượng protein carbonyl nhóm uống xanh (60 mg EGCG/ kg thể trọng chuột) giảm cao trà xanh (60 mg EGCG/ kg thể trọng chuột) có ý nghĩa thống kê so với nhóm tiêm CCl4, Chuyên Đề Dược Khoa 133 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 giảm có ý nghĩa thống kê so với nhóm tiêm CCl4, HTCO đạt 33,02% BÀN LUẬN Việc khảo sát hoạt tính chống oxy hóa cao trà xanh giàu EGCG thông qua hai số MDA protein carbonyl cho thấy với liều 60 mg EGCG/ kg thể trọng chuột thể HTCO rõ rệt (p < 0,01) Số liệu thực nghiệm cho thấy chuột uống cao trà xanh dự phòng hai mơ hình ngày 14 ngày thể hoạt tính chống oxy hóa KẾTLUẬN Cao trà xanh (liều 60 mg EGCG/ kg thể trọng chuột) thể hoạt tính chống oxy hóa rõ rệt 134 giảm hàm lượng MDA protein carbonyl nhóm thử thuốc so với nhóm tiêm CCl4 để gây viêm gan cấp (p < 0,01) Cảm ơn: Đề tài tài trợ kinh phí từ quỹ nghiên cứu khoa học Chương trình Vườn ươm sáng tạo KHCN trẻ - Thành đoàn Tp.HCM TÀI LIỆU THAM KHẢO Chevion M, Berenshtein E, Stadtman ER (2000), “Human studies related to protein oxidation: protein carbonyl content as a marker of damage”, Free Radic Res 33 Suppl:S99-108 Higdon JV, Frei B (2003), “Tea catechins and polyphenols: health effects, metabolism, and antioxidant functions”, Crit Rev Food Sci Nutr 43:89-143 McKay DL, Blumberg JB (2002), “The role of tea in human health: an update”, J Am Coll Nutr 21:1-13 Vladimirov XG, 1987, Khimiko farmaxevticheckii Zuranal, Vol 3, pg 236 – 249 Chuyên Đề Dược Khoa ... thấy chuột uống cao trà xanh dự phòng hai mơ hình ngày 14 ngày thể hoạt tính chống oxy hóa KẾTLUẬN Cao trà xanh (liều 60 mg EGCG/ kg thể trọng chuột) thể hoạt tính chống oxy hóa rõ rệt 134 giảm... giá tính chất chống oxy hóa polyphenol dùng đường uống cần thiết VẬTLIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Cao trà xanh Cao chiết ethanol từ búp trà xanh (hàm lượng EGCG ≥ 60%) tiêu chuẩn hóa Động vật thử. .. khảo sát hoạt tính chống oxy hóa cao trà xanh giàu EGCG thơng qua hai số MDA protein carbonyl cho thấy với liều 60 mg EGCG/ kg thể trọng chuột thể HTCO rõ rệt (p < 0,01) Số liệu thực nghiệm cho