Thiết lập chất chuẩn berberin chloride

Berberin clorid là alkaloid quan trọng có trong nhiều loài dược liệu khác nhau. Đề tài này nhằm thiết lập chất chuẩn berberin chloride đạt tiêu chuẩn chất chuẩn gốc (primary reference standard) theo hướng dẫn trong các ISO Guide.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN BERBERIN CHLORIDE Huỳnh Thị Ngọc Ngân*, Trương Vũ Hồi Thu*, Nguyễn Minh Đức** TĨM TẮT Mục tiêu: Berberin clorid alkaloid quan trọng có nhiều loài dược liệu khác Đề tài nhằm thiết lập chất chuẩn berberin chloride đạt tiêu chuẩn chất chuẩn gốc (primary reference standard) theo hướng dẫn ISO Guide Phương pháp: Chất điều chế định tính TLC, IR, HR-MS định lượng HPLC Sau đóng gói đánh giá đồng lơ, đánh giá liên phòng thí nghiệm Xử lý kết theo Anova ISO Guides Kết quả: chất chuẩn berberin chlorid thiết lập có hàm lượng 93,73%, theo nguyên trạng Kết luận: Đã thiết lập chất chuẩn berberin cloride theo ISO Guides Chất chuẩn dùng nghiên cứu hay kiểm nghiệm dược liệu chứa berberin chlorid Từ khóa: berberin chlorid, ISO Guide 35, ISO 13528, đồng lô, đánh giá liên phòng thí nghiệm, giá trị ấn định, z-core ABSTRACT PREPARE BERBERIN CHLORIDE AS REFERENCE STANDARD Huynh Thi Ngoc Ngan, Truong Vu Hoai Thu, Nguyen Minh Duc * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 3- 2019: 361-365 Objective: Berberin chloride is a major alkaloid in plants In this paper we report the establishment of berberin chloride as reference standards following validation requirements of ISO Guides Method: The substance was identified by TLC, IR, HR-MS and assayed by HPLC The interlaboratory validation was performed after the substance was packaged to 10 mg/vial and tested for batch homogeneity The results was evaluated by Anova and ISO Guides Results: Berberin chloride was prepared as a reference standard with 93.73% purity as basis Conclusion: Berberin cloride reference standard was well prepared according to ISO Guides This reference standard can be used for reseach purpose or to control the quality of medical plant that contain berberin chlorid Keywords: berberin chlorid, ISO Guide 35, ISO 13528, batch homogeneity, interlaboratory validation, assigned value, z-core đạt tiêu chuẩn chất chuẩn gốc (primary reference ĐẶT VẤN ĐỀ standard) theo hướng dẫn ISO Guide Berberin clorid alkaloid quan trọng có nhiều lồi dược liệu khác vàng đắng, hoàng liên, hoàng bá…và chế phẩm Berberal, Strep-Berin Vì vậy, hợp chất sử dụng chất chuẩn để kiểm định dược liệu thành phẩm thị trường Đề tài nhằm thiết lập chất chuẩn berberin chloride ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Berberin clorid (10,93 g) Ban nghiên cứu Khoa học – Thư viện, Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp Chất chuẩn đối chiếu: Chuẩn Viện *Trường Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch, Thành phố Hồ Chí Minh **Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS.DS Huỳnh Thị Ngọc Ngân ĐT: 0988 334 618 Email: nganhtn@pnt.edu.vn Tác giả liên liên lạc: BS CK2 Nguyễn Phú Hữu ĐT: 0918650345 Email: bsphuhuu2012@gmail.com Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 361 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh, số lơ QT122 030910, hàm lượng 90,62% tính theo ngun trạng Phương pháp nghiên cứu Định tính, xác định cấu trúc định lượng Định tính Berberin clorid định tính phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) với hệ dung môi khác nhau, sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), hồng ngoại (IR) so với chất chuẩn Xác định cấu trúc Phổ hồng ngoại đo máy Shimadzu FTIR-8201PC, phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) thực máy Bruker 500 MHz NMR, phổ khối có độ phân giải cao (HR-MS) đo máy Bruker µQ-TOF MS Định lượng HPLC Tiến hành theo Dược điển Việt Nam (DĐVN) IV, chuyên luận “Berberin clorid” Định lượng HPLC thực máy Shimadzu LC-20A (Nhật) Agilent (Anh) với detector dãy diod quang (PDA) sử dụng chất chuẩn đối chiếu Điều kiện sắc ký Cột: C18, 250 x 4,6 mm, 5m Pha động: Hoà tan 3,4 g kali dihydro phosphat 1,7 g natri lauryl sulfat hỗn hợp nước - acetonitril (1:1) vừa đủ 1000 ml Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút Thể tích tiêm: 10 l Bước sóng phát hiện: 345 nm Nồng độ dung dịch chuẩn thử: 100 ppm Lựa chọn cột: Hoà tan mg berberin clorid mg palmatin clorid 10 ml pha động Tiến hành sắc ký chọn cột sắc ký cho độ phân giải palmatin berberin không nhỏ 1,5 Kiểm tra khả thích hợp hệ thống sắc ký: Tiêm riêng biệt lần dung dịch chuẩn, độ 362 lệch chuẩn tương đối diện tích pic berberin khơng lớn 1,5% Đóng gói đánh giá đồng lơ q trình đóng gói Berberiin clorid sau định tính, định lượng đóng lọ điều kiện tiêu chuẩn Glove-Box (chứa 99,9% nitơ, độ ẩm 10%) vào lọ thủy tinh màu nâu đóng kín, có lớp đệm teflon, lọ 20 mg, đóng 100 lọ Lấy 11 lọ ( N + 1) để đánh giá đồng lơ q trình đóng gói, lọ kiểm tra lần Đánh giá kết theo ISO Guides(1,2) Đánh giá chất chuẩn liên phòng thí nghiệm Thành phẩm sau đóng gói đánh giá đồng lô đạt yêu cầu lấy mẫu ngẫu nhiên tiến hành định lượng ba phòng thí nghiệm (PTN) độc lập đạt GLP ISO 17025, có phòng thí nghiệm có đủ thẩm quyền có ý nghĩa pháp lý Việt Nam Mỗi PTN định lượng lọ Tính thống kê kết từ phòng thí nghiệm theo Anova (n=18) Nếu Ftn ≤ Ftc, kết trung bình PTN khác khơng có nghĩa, phương pháp phân tích có độ lặp lại cao, hàm lượng chất chuẩn đánh giá không phụ thuộc vào PTN tham gia đánh giá Xác định giá ấn định, độ không đảm bảo đo giá trị công bố phiếu kiểm nghiệm(3) Tiến hành xác định giá trị công bố phiếu kiểm nghiệm kết đánh giá liên phòng thí nghiệm đạt yêu cầu (Ftn ≤ Ftc) Giá trị ấn định x*(n) chọn giá trị s* không thay đổi sau n lần tính (lấy số lẻ phía sau dấu phẩy); sử dụng giá trị ấn định x*(n) để đánh giá kết phân tích theo test-z, loại bỏ kết phân tích có z > 2,0; chọn giá trị z ≤ 2,0, tính giá trị trung bình KẾT QUẢ Định tính xác định cấu trúc SKLM: Trên ba hệ dung môi sắc ký khác nhau, berberin clorid cho vết có màu sắc Rf trùng với berberin clorid chuẩn Khi Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 thêm palmatin vào mẫu thử thấy có vết palmatin tách rõ, chứng tỏ hệ dung môi khai triển đặc hiệu berberin clorid mẫu thử không lẫn palmatin, có với lượng khơng đáng kể Phổ IR mẫu berberin clorid điều chế phù hợp với phổ mẫu chuẩn (Hình 1) HPLC: Thời gian lưu mẫu điều chế mẫu chuẩn trùng tiêm triển khai HPLC điều kiện sắc ký Phổ HR-MS mẫu điều chế cho mảnh có số khối 336,1257 m/z, 337,1282 m/z, (M+) = 336,36 tương ứng với công thức C20H18NO4 berberin clorid Nghiên cứu Y học Bảng So sánh liệu phổ 13C-NMR berberin clorid điều chế (125 MHz, m = ppm) CD3OD) với chất chuẩn(4) Aglycon Đường Berberin Berberin Berberin Berberin Vị trí Vị trí (4) (4) điều chế điều chế 105,43 106,57 10 150,36 152,26 147,63 150,00 11 126,67 128,35 149,76 152,06 12 123,53 124,49 108,43 109,40 12a 132,94 135,33 4a 130,64 131,92 13 120,18 121,54 26,35 28,25 13a 137,41 139,80 55,19 57,26 13b 120,42 121,89 145,42 146,35 OCH2O 102,07 103,63 8a 121,37 123,40 9-OMe 61,95 62,58 143,61 145,93 10-OMe 57,06 57,78 Phổ NMR: Phổ 1H-NMR 13C-NMR berberin clorid điều chế phù hợp với berberin clorid theo tài liệu cơng bố(4) (Bảng 1, Hình 2) Hình Phổ IR berberin clorid điều chế (a) chuẩn (b) Hình Phổ 1H-NMR (a) phổ 13C-NMR berberin clorid điều chế Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 363 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Định lượng berberin clorid phương pháp HPLC Bảng Kết kiểm tra tính tương thích hệ thống berberin clorid (n=6) Thời gian Diện tích Hệ số kéo Số đĩa lý lưu đỉnh T thuyết Trung bình 9,744 2153136 1,5 32403 RSD% 97 0,40 0,70 1, Định lượng: Kết định lượng cho thấy hàm lượng trung bình berberin clorid xác định 92,99% (n = 6), tính theo trạng Suy hàm lượng berberin clorid tính theo chế phẩm khan 101,08%> 95,00% Vậy, berberin clorid điều chế đủ điều kiện để thiết lập chất chuẩn theo DĐVN IV Hình Sắc ký đồ định lượng berberin clorid (a): dung dịch phân giải chứa berberin clorid palmatin; (b): mẫu thử: (c): mẫu chuẩn Đóng gói đánh giá đồng lơ q trình đóng gói Bảng Kết định lượng đánh giá đồng lô STT 10 11 Lọ số 21 29 32 66 67 77 83 87 92 95 Lần (%) 93,97 94,03 93,54 93,93 94,00 93,55 94,66 94,23 93,22 93,95 94,16 Lần (%) 93,84 94,36 94,38 94,02 94,29 92,87 93,72 93,25 93,42 94,22 92,94 Loại giá trị bất thường trắc nghiệm Dixon: Xếp kết theo thứ tự tăng dần, xét hai kết nhỏ lớn so với chuỗi liệu: Xmin = 92,87%  G = 0,235 < G0,05 = 0,468, Xmax = 94,66%  G = 0,208 < G0,05 = 0,468 364 Vậy, kết 92,87% 94,66% không bất thường, nghĩa chuỗi liệu khơng có giá trị bất thường Đánh giá đồng lọ theo ISO GUIDE 35, ta có: Do áp dụng cơng thức chuyển đổi để tínhubb Kết thu sau: 0,010 < u bb = 0,047 < 0,120, kết luận lọ berberin clorid điều chế đóng gói đồng Hội Nghị Khoa Học Cơng Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Đánh giá liên phòng thí nghiệm Bảng Kết định lượng berberin clorid điều chế (%) ba phòng thí nghiệm Mẫu TB PTN1 93,84 94,36 94,38 94,02 94,29 92,87 93,96 PTN2 92,89 94,18 93,44 93,81 93,31 94,01 93,61 PTN3 93,31 93,9 93,48 93,26 93,96 93,55 93,58 PTN1: Phòng kiểm tra chất lượng Cơng ty Cổ phần Hóa Dược phẩm Mekophar PTN2: Khoa Thiết lập chất chuẩn – chất đối chiếu, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh PTN3: Khoa Vật lý đo lường, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh Phân tích phương sai yếu tố theo Anova cho thấy Ftn = 1,259 < Ftc = 3,682, kết luận kết trung bình ba phòng thí nghiệm khác khơng có nghĩa, phương pháp phân tích có độ lặp lại cao, hàm lượng berberin clorid điều chế khơng phụ thuộc vào phòng thí nghiệm tham gia đánh giá Xác định giá trị ấn định, độ không đảm bảo đo giá trị công bố phiếu kiểm nghiệm berberin clorid Bảng Kết tính giá trị ấn định hàm lượng berberin clorid điều chế (n = 18) Số lần thay đổi δ = 1,5 x s* s* - δ s* + δ TB Độ lệch s x* s* x*(0) 93,71 0,47 93,83 0,550 x*(1) 0,90 93,00 94,65 93,73 0,45 93,73 0,508 x*(2) 0,80 92,93 94,54 93,73 0,45 93,73 0,508 x*(3) 0,80 92,93 94,54 93,73 0,45 93,73 0,508 Nghiên cứu Y học Từ kết trên, tính z-core Kết tất 18 giá trị có |z| ≤ 2,0 Do đó, hàm lượng trung bình berberin clorid tính sau: Hàm lượng trung bình: X = 93,73% (n = 18) Độ lệch s: 0,45 Độ không đảm bảo đo µ: 0,150 Như vậy, chất điều chế berberin điều chế đạt tiêu chí chuẩn gốc với hàm lượng xác định 93,73% tính theo nguyên trạng KẾT LUẬN Qua nghiên cứu này, thiết lập chất chuẩn berberin clorid từ dược liệu có hàm lượng cao (93,73%) tính theo nguyên trạng Trong quy trình thiết lập, chất chuẩn định tính, xác định cấu trúc, định lượng dựa vào quy trình HPLC thẩm định chất chuẩn gốc, đánh giá tính đồng lơ đóng gói Các chất chuẩn thẩm định ba phòng thí nghiệm độc lập đạt tiêu chuẩn ISO/GLP Kết đánh giá thẩm định cho thấy chất chuẩn berberin clorid thiết lập có chất lượng cao, đáng tin cậy, đạt tiêu chí chuẩn gốc để đưa vào phục vụ yêu cầu nghiên cứu, kiểm nghiệm dược liệu chứa berberin clorid TÀI LIỆU THAM KHẢO ISO Guide 34 (2009) General requirements for the competence of reference material producers ISO Guide 35 (2006) Reference materials — General and statistical principles for certification ISO 13528 (2005) Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons Grycová L, Dotál J, Marek R (2007) Quaternary protoberberine alkaloids Phytochemistry, 68:pp.150-175 Ngày nhận báo: 31/01/2019 Ngày phản biện nhận xét báo: 12/02/2019 Ngày báo đăng: 20/04/2019 Sau ba lần thay đổi, giá trị s* không thay đổi (= 0,508), giá trị x* chọn 93,73% Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 365 ... định chất chuẩn gốc, đánh giá tính đồng lơ đóng gói Các chất chuẩn thẩm định ba phòng thí nghiệm độc lập đạt tiêu chuẩn ISO/GLP Kết đánh giá thẩm định cho thấy chất chuẩn berberin clorid thiết lập. .. trạng KẾT LUẬN Qua nghiên cứu này, thiết lập chất chuẩn berberin clorid từ dược liệu có hàm lượng cao (93,73%) tính theo ngun trạng Trong quy trình thiết lập, chất chuẩn định tính, xác định cấu trúc,... C20H18NO4 berberin clorid Nghiên cứu Y học Bảng So sánh liệu phổ 13C-NMR berberin clorid điều chế (125 MHz, m = ppm) CD3OD) với chất chuẩn( 4) Aglycon Đường Berberin Berberin Berberin Berberin