Bài viết nghiên cứu đa dạng di truyền đoạn siêu biến 1 và đoạn siêu biến 2 trên DNA ty thể của dân tộc Mường ở Việt Nam thông qua khuếch đại vùng gen HVS-I và HVS-II; phân tích trình tự vùng gen HVS-I và HVS-II. Mời các bạn cùng tham khảo.
TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 ĐA DẠNG DI TRUYỀN ĐOẠN SIÊU BIẾN VÀ ĐOẠN SIÊU BIẾN TRÊN DNA TY THỂ CỦA DÂN TỘC MƯỜNG Ở VIỆT NAM Nguyễn Thu Thúy, Trần Thúy Hằng, Tạ Thành Văn, Nguyễn Đức Hinh, Trần Vân Khánh Trư ng h YH N ng nt - H tr n n n (H r r g nt - H - ) n n (H r r g- ) g n t th t tr ng ngh n ng ụng tr ng nh g ng tr n t n h n th ngư h n n nh t th g nh g n nh h t th ng Tr ng ngh n n h ng t nh t nh h nh ng g n H H - tr n 100 ngư nt ng ng hương h g tr nh t g n t ngh n t th 22 h gr h gr t nh t h gr 10 4 4 10 N9 H gr t th nh t h T NP 100 15 n C 92 09 n C 59 09 n CC 12 T1 9C t n nh g ng tr n ng g nH H - tr n 100 ngư nt ng t n h n h nh ng tr nh t ng g n H H nt ng ng n Từ khóa: DNA ty thể, vùng gen HVS - I, vùng gen HVS - II, dân tộc Mường I ĐẶT VẤN ĐỀ Bộ gen ty thể người nghiên cứu từ cách 30 năm công bố lần vào năm 1981 [1], sau chỉnh sửa lại vào năm 1999 [2] Đây gen ty thể đại diện người da trắng coi trình tự chuẩn đối chứng Cho đến có hàng trăm cơng trình nghiên cứu gen ty thể người thuộc chủng tộc khác công bố Bộ gen ty thể người phân tử DNA có cấu trúc dạng mạch vòng, bao gồm 37 gen với 16 569 bp mã hóa cho 13 polypeptide tham gia vào chuỗi hô hấp tế bào, 22 tRNA rRNA Trong vùng siêu biến (HVS I HVS - II) có trình tự thay đổi theo thời gian khác vùng địa lý [3] Sự khác biệt trình tự gen ty thể có ý nghĩa quan trọng không nghiên cứu lịch sử mẫu hệ người đại mà việc xác định mối quan hệ chủng tộc vùng địa lý khác Những khác biệt trình tự mtDNA vùng mã hóa cho biết q trình chọn lọc tự nhiên có ảnh hưởng định đến q trình tiến hóa gen ty thể [3,4] Các nghiên cứu cho thấy trình tự DNA ty thể chủng tộc khác có khác biệt định Trong số h n h Tr n n h nh Tr ng t Pr t n trư ng h YH N n h nh h Ng nh n 2014 Ng h th n 11 2014 24 Ngh n n- trình tự hoàn chỉnh gen ty thể cơng bố khơng có tộc người châu Âu châu Phi mà có tộc người khu vực châu Á Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Philippin, Mã Lai Thái Lan tộc người có quan hệ chủng tộc địa lý gần gũi với người Việt Nam [4 - 8] Đề tài tiến hành với mục tiêu: xác định đa dạng di truyền đoạn siêu biến đoạn siêu biến DNA ty thể dân tộc Mường Việt Nam II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu - 100 mẫu máu 100 người dân tộc Mường, sống tỉnh Hòa Bình - Các hóa chất sử dụng nghiên cứu mua hãng QIAGEN, Sigma, ABI Phương pháp - 100 mẫu DNA tách chiết từ mẫu máu theo phương pháp sử dụng enzym protease K phenol: chloroform: isoamyl alcohol - Hai vùng gen HVS - I HVS - II khuếch đại phương pháp PCR, sử dụng cặp mồi đặc hiệu: HVSI-F: 5’- CTC CAC CAT TAG CAC CCA AAG C -3’ HVSI-R: 5’- CCT GAA GTA GGA ACC AGA TG -3’ HVSII-F: 5’- GGT CTA TCA CCC TAT TAA CCA C -3’ HVSII-R: 5’- CTG TTA AAA GTG CAT ACC GCC A -3’ Thành phần phản ứng PCR (thể tích 20µl) gồm: TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 1X đệm PCR; 2,5mM dNTP; 0,2µl mồi xi ngược; 0,5unit Taq polymerase; 50ng DNA H2O III KẾT QUẢ Chu trình nhiệt phản ứng PCR: 94oC - phút; 30 chu kỳ [94oC - 30 giây, 54oC - 30 giây, 72oC - 30 giây]; 72oC - phút; bảo quản mẫu 15oC Khuếch đại vùng gen HVS - I HVS - II Sản phẩm PCR điện di với thang chuẩn 100bp gel agarose 1% Các băng DNA nhuộm ethidium bromide chụp ảnh hệ thống máy EC3 Imaging system - Thành phần phản ứng PCR giải trình tự vùng gen HVS - I HVS - II gồm: 1X Bigdye buffer; Bigdye; mồi xuôi ngược; DNA H2O Được tiến hành hệ thống máy giải trình tự gen ABI 3100 vant - Kết giải trình tự gen mẫu nghiên cứu so sánh với trình tự chuẩn J01415 Genebank phần mềm phân tích CLC Main Workbench Đạo đức nghiên cứu Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu Bệnh nhân có quyền rút lui khỏi nghiên cứu không đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu Các thông tin cá nhân đảm bảo bí mật DNA sau tách chiết từ mẫu máu nghiên cứu kiểm tra chất lượng, nồng độ độ cách đo phổ hấp thụ tử ngoại hai bước sóng 260 nm, 280 nm Tất mẫu DNA đạt nồng độ ≥ 50 ng/µl, độ tinh khoảng 1,7 ÷ 2, khơng đứt gẫy sử dụng làm khuôn để khuếch đại hai vùng gen HVS - I HVS - II Để xác định đa hình nucleotide đơn (Single Nucleotide Polymorphinsms - SNPs) đoạn siêu biến đoạn siêu biến DNA ty thể mẫu nghiên cứu, sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen HVS - I từ vị trí nucleotide 15975 đến nucleotide 16517, có kích thước 543 bp đoạn gen HVS - II từ vị trí nucleotide đến nucleotide 429, có kích thước 422 bp Với điều kiện thành phần phản ứng chu trình nhiệt mơ tả phần phương pháp, sản phẩm PCR thu có chất lượng tốt, gồm băng đặc hiệu có kích thước tính tốn (hình 1) Hình Sản phẩm khuếch đại đoạn gen HVS - I (1 - 11) gen HVS -II (12 - 21) Kết phân tích trình tự vùng gen HVS - I HVS - II Hình ảnh giải trình tự gen số SNP vùng gen HVS - I HVS - II thể hình 3: tín hiệu đỉnh cao, rõ, khơng bị nhiễu, tín hiệu đường thấp 25 TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 Hình Hình ảnh giải trình tự gen số SNP vùng gen HVS - II Hình Hình ảnh giải trình tự gen số SNP vùng gen HVS - I Bảng Các dạng SNP vùng gen HVS - I HVS - II DNA ty thể 100 mẫu dân tộc Mường Loại đột biến Vị trí Vùng gen HVS-I C-stretch polymorphism A16182C A16183C 16193insC 16193insCC Transition C16069T G16084C T16124C T16126C A16162G A16163G C16192T C16193T C16223T C16226A C16256T C16257A G16274A C16278T T16298C C16299T T16324C C16327T C16465T G16496A Transversion T16092A A16113C A16116C A16122T T16140A C16291A A16194C C16197G C16426G Indel 38delA 469delT 474delG T16086C G16129A C16168T T16195C T16231C C16260T G16279A A16300G C16355T T16092C T16140C T16172C C16201T A16233G C16261T A16289G T16304C T16356C T16093C C16147T T16178C T16209C A16235G C16266A C16291T A16309G T16362C C16095T C16148T A16183G G16213A A16240G A16269G C16292T G16310A A16367C C16108T A16149C C16184T T16217C A16241C T16271C C16295T T16311C G16390A C16111T T16154C T16189C C16221T T16249C A16272G T16297C G16319A A16399G Vùng gen HVS-II C-stretch polymorphism 309insC 309insCC 315insC Transition C43T G53A T55C A56C T57C A73G T146C C150T C151T T152C A183G G185A A189G C194T T195C C198T T199C T204C G207A A210G A214G T217C A225G A234G A235G A237G A249G A263G C308T T310C G316A A328G C332T Transversion T146A G316C T158A C303A Indel 249delA 310delT 315insA 334delA 337delA 352delA 368delA 26 TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 Chú thích: Transition - t n th th n t t n th th n t g r n th nh r h nh ng n t C t n Indel - t n ng g rn( - )h nh ngư ( -T Ch th n t r n (C - T) Tr n r n) C- tr t h r h - Kết phân tích trình tự gen HVS - I HVS - II thể bảng Đối với gen HVS - II, tìm thấy 47 đa hình; 100 mẫu nghiên cứu có SNP A73G A263G; 92 mẫu có SNP 315insC; 59 mẫu có SNP 309insC; 12 mẫu có SNP 309insCC Đối với gen HVS - I, tìm thấy 90 đa hình; 68 mẫu mang haplotype AAAACCCCCTCCCCC (68%) từ nucleotide 16180 đến 16193 32 mẫu có đột biến thay T16189C (32%) gồm: mẫu mang haplotype AAAACCCCCCCCCCC, mẫu mang haplotype AAACCCCCCCCCCCC, 21 mẫu mang haplotype AACCCCCCCCCCCCC, mẫu mang haplotype AAAATCCCCCCCCCC Dựa kết phân tích trình tự gen HVS - I HVS - II, xác định haplogroup cho mẫu nghiên cứu Tần số haplogroup với số SNP đặc trưng haplogroup thể bảng Bảng Tần số Haplogroup vùng gen HVS - I HVS - II 100 mẫu dân tộc Mường [5] Haplogroup (%) Các SNP đặc trưng (+A73G, A263G) HVS - I Haplogroup (%) HVS - II Các SNP đặc trưng (+A73G, A263G) HVS - I HVS - II B (8) T16189C G2 (6) C16278T, T16362C B4 (4) T16189C, T16217C M (5) C16223T B4a (4) T16189C, T16217C, C16261T M10 (2) T16311C B5 (1) T16140C/A, T16189C M7 (6) B5a (7) T16140C/A, T16189C, C16226A, M7b (4) T16297C, T150C, T199C C (5) T16298C, C16327T M7b1 (10) G16129A, C16192T, T16297C, T150C, T199C D4 (4) T16362C M7c (1) C16295T, T146C/A, T199C F1a (16) G16129A, T16172C, T16304C, 249delA M8a (2) C16184T, T16298C, G16319A F1b (1) T16189C, T16304C, 249delA N9a (2) C16257A, C16261T, T150C F2 (2) T16304C, 249delA R (3) F2a (1) C16291T, T16304C, 249delA R9a (6) T16298C, C16355T, T16362C, 249delA 249delA T146C/A, T199C Đã xác định 22 haplogroup thuộc nhóm B, C, D, F, G, M, N, R Haplogroup F1a có tỷ lệ cao nhất, chiếm 16%, haplogroup M7b1 10%; B 8%; B5a 7%; G2, M7, R9a 6%; M 5%; B4, B4a, D4, M7b 4%; F2, M10, M8a, N9a 2% Haplogroup B5, F1b, F2a, M7c có tỷ lệ thấp nhất, chiếm 1% 27 TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 IV BÀN LUẬN Nghiên cứu năm 1999 nhóm R Ivanova 50 người Việt Nam phát 20 đa hình vị trí enzym cắt DNA ty thể Trong đó, vị trí enzym HaeII - 13Viet, MspI - 19Viet, MspI - 20Viet đa hình [9] Năm 2005, Huỳnh Thị Thu Huệ cộng giải trình tự vùng gen HVS - I HVS - II mẫu dân tộc Kinh, mẫu dân tộc Tày mẫu dân tộc H’Mông, phát 26 vị trí đa hình HVS - I vị trí đa hình HVS - II [10] Kết nghiên cứu Han Jun Jin cộng (năm 2009) 47 người Việt Nam cho thấy, haplogroup F1a có tỷ lệ cao 10/47, haplogroup D4 7/47, G2a 6/47, B4 N9a 3/47 [6] Trong nghiên cứu 100 mẫu dân tộc Mường, haplogroup nhóm B, F, M chiếm tỷ lệ cao haplogroup F1a có tỷ lệ cao (16%), haplogroup D4, B4 chiếm 4%, haplogroup N9a chiếm 2% khơng có haplogroup G2a Theo kết năm 2010 nhóm nghiên cứu Ya-Ping Zhang, haplogroup B, R9 M7 dạng haplogroup phổ biến dân tộc Chăm Kinh Bắc [11] Ở số cá thể vùng siêu biến có đoạn lặp lại liên tiếp nucleotide Cytosine (C-stretch) Vùng C - stretch nằm từ vị trí nucleotide 16183 đến 16193 HVS - I từ vị trí nucleotide 303 đến 327 HVS - II Theo trình tự chuẩn CRS, vùng C - stretch HVS - I ngắt quãng nucleotide Thymine vị trí 16189 Tuy nhiên, nhiều trình tự DNA ty thể có đột biến T16189C tạo thành chuỗi 10 nucleotide Cystosine liên tiếp [1, 2] Đột biến T16189C xem đột biến có tốc độ cao hệ gen ty thể người [12] Dạng dị hợp tử vùng lặp Cystein trình tự HVS - I HVS - II nghiên cứu nhiều tỷ lệ đa hình vùng có khác biệt có ý nghĩa thống kê chủng tộc người khác Vì vậy, đa dạng di truyền vùng C - stretch có ý nghĩa quan trọng giám định hình gen nghiên cứu di truyền quần thể Năm 2009, Chen cộng nghiên cứu đa dạng di truyền vùng C - stretch 919 người Trung Quốc, thuộc chủng tộc khác Kết cho thấy, haplogroup AAAACCCCCTCCCCC AACCCCCCCTCCCCC haplogroup đặc trưng cho quần thể người dân tộc Tibetan Salar Trung quốc tỷ lệ đa hình T16189C thuộc vùng lặp nucleotide Cystein gen HVS - I 25,14% [13] Tỷ lệ đa hình T16189C dân tộc Mường nghiên cứu chúng tơi 32%, cần có thêm nghiên cứu dân tộc khác để tìm haplogroup đặc trưng cho dân tộc Việt Nam quốc gia đa văn hoá với 54 dân tộc anh em, việc nghiên cứu đặc điểm nguồn gốc 28 tộc người mối liên quan tộc người việc làm cần thiết, điều kiện phát triển kinh tế xã hội nay, việc di cư vùng, việc kết hôn dân tộc ngày trở nên phổ biến Một số khía cạnh nhân chủng học khảo cổ, nhân trắc, văn hoá - xã hội, ngôn ngữ quan tâm nghiên cứu từ lâu, riêng khía cạnh gen học lại chưa quan tâm nghiên cứu nhiều Ở Việt Nam, nghiên cứu khảo cổ, nhân trắc, văn hoá - xã hội, ngôn ngữ… cho thấy tộc người Kinh, Mường, Chăm Khmer có điểm tương đồng Trên sở kết nghiên cứu này, tiếp tục nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền DNA ty thể dân tộc khác Việt Nam nhằm khảo sát đặc điểm gen học tộc người Việt, đưa chứng khoa học nguồn gốc tộc người này, nhằm triển khai dự án bảo tồn lưu trữ nguồn gen phục vụ cho cơng tác bảo vệ chăm sóc sức khỏe người dân V KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu cho phép rút kết luận: Đã giải trình tự hồn thiện vùng gen HVS - I HVS - II DNA ty thể 100 mẫu dân tộc Mường, cụ thể: - Tỷ lệ SNP A73G A263G 100%; 315insC 92%; 309insC 59%; 309insCC 12%; T16189C 32% - Xác định 22 haplogroup, haplogroup F1a có tỷ lệ cao 16%, haplogroup M7b1 10%; B 8%; B5a 7%; G2, M7, R9a 6%; M 5%; B4, B4a, D4, M7b 4%; F2, M10, M8a, N9a 2% Haplogroup B5, F1b, F2a, M7c có tỷ lệ thấp nhất, chiếm 1% Như vậy, đánh giá đa dạng di truyền vùng HVS - I HVS - II DNA ty thể 100 mẫu dân tộc Mường Lời cảm ơn Đề tài thực với hỗ trợ kinh phí đề tài nhánh cấp nhà nước “Nghiên cứu số số sinh học, trình tự gen ty thể người Việt Nam trưởng thành đột biến gen gây bệnh thalassemia” thuộc đề tài nhiệm vụ Quỹ gen “Đánh giá đặc điểm di truyền người Việt Nam” TÀI LIỆU THAM KHẢO Anderson A, Bankier AT, Barrel BG et al (1981) Sequence and organisation of the human mitochondrial genome N t r 290: 457 - 465 TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 Andrews RM, Kubacka I, Chinnery PE et al (1999) Reanalysis and revision of the Cambridge reference sequence for human mitochondrial DNA N t r n t23, 147 DiMauro S, Schon EA (2003) Mitochondrial respiratory-chain diseases N ng 348: 2656 - 2668 Li YC, Korol AB, Fahima T et al (2002) Microsatellites: genomic distribution, putative functions and mutational mechanisms: a review 11(12): 2453 - 2465 Yao YG, Kong QP, Bandelt HJ et al (2002) Phylogeographic Differentiation of Mitochondrial DNA in Han Chinese H n t 70: 635 – 651 Jin HJ., Chris TS., Kim W (2009) The peopling of Korea revealed by analyses of mitochrondrial DNA and Y-chromosomal markers P N 4(1): e4210 Jain S., Panigrahi I., Sheth J et al (2011) STR markers for detecting heterogeneity in Indian population 39(1): 461 - 465 Zhong H., et al (2011) Extended Y chromosome investigation suggests postglacial migrations of modern humans into East Asia via the northern route 28(1): 717 - 727 Ivanova R., An Vu Trieu., et al (1999) Mitochondrial DNA polymorphism in the Vietnamese population r n rn n g n t 26, 417 - 422 10 Huỳnh Thị Thu Huệ, Hoàng Thị Thu Yến, Nguyễn Đăng Tơn (2005) Phân tích trình tự vùng điều khiển (D-LOOP) genome ty thể cá thể người Việt Nam T h C ng ngh nh h 3(1): 15 - 22 11 Peng MS., Ho QH., Pham DK., et al (2010) Tracing the Austronesian Footprint in Mainland Southeast Asia: A Perspective from Mitochondrial DNA 27(10): 2417 – 2430 12 Liou CW, L.T., Huang FM, Chen TL, Lee CF., et al (2004) Association of the mitochondrial DNA 16189 T to C variant with lacunar cerebral infarction: evidence from a hospital-based case-control study nn N Y 1011: 317 - 324 13 Chen F., Dang Y., Yan C et al (2009) Sequencelength variation of mtDNA HVS - I C-stretch in Chinese ethenic groups h ng n 10(10): 711 - 720 Summary VARIATION OF mtDNA HYPERVARIABLE SEGMENT AND HYPERVARIABLE SEGMENT OF MUONG ETHNIC IN VIETNAM The sequences polymorphism of mtDNA hypervariable Segment (HVS - I) and hypervariable Segment (HVS - II) are studied and applied for assessing the genetic diversity and evolution of human population, the forensic genetics, consanguinity, and mitochondrial disease diagnosis We define the variations of HVS - I and HVS - II genes of 100 Muong ethnic samples by direct sequencing method We find 22 haplogroup; F1a haplogroup frequency is the highest (16%); M7b1 haplogroup frequency is 10%; B is 8%; B5a is 7%; G2, M7, R9a is 6%; M is 5%; B4, B4a, D4, M7b is 4%; F2, M10, M8a, N9a is 2% B5, F1b, F2a, M7c haplogroup frequencies are the lowest (1%) The frequencies of SNP A73G and A263G are 100%; 315insC is 92%; 309insC is 59%; 309insCC is 12%; T16189C is 32% In conclusion, we have assessed the genetic polymorphism of mtDNA HVS - I and HVS - II of 100 Muong ethnic samples This is the first and complete data of HVS - I and HVS - II gene sequences of a large number of Muong individuals Key words: mitochondrial DNA, HVS - I gene, HVS - II gene, Muong ethnic 29 ... C1 626 6A C1 629 1T A16309G T16362C C16095T C1 614 8T A1 618 3G G16 21 3 A A1 624 0G A1 626 9G C1 629 2T G16 310 A A16367C C1 610 8T A1 614 9C C1 618 4T T16 21 7 C A1 624 1C T1 627 1C C1 629 5T T16 311 C G16390A C1 611 1T T1 615 4C T1 618 9C... C1 619 2T C1 619 3T C1 622 3T C1 622 6A C1 625 6T C1 625 7A G1 627 4A C1 627 8T T1 629 8C C1 629 9T T16 324 C C16 327 T C16465T G16496A Transversion T16092A A1 611 3C A1 611 6C A1 6 12 2T T1 614 0A C1 629 1A A1 619 4C C1 619 7G C16 426 G... 474delG T16086C G1 6 12 9A C1 616 8T T1 619 5C T1 623 1C C1 626 0T G1 627 9A A16300G C16355T T16092C T1 614 0C T1 617 2C C1 620 1T A1 623 3G C1 626 1T A1 628 9G T16304C T16356C T16093C C1 614 7T T1 617 8C T1 620 9C A1 623 5G C1 626 6A