Ung thư vu là ung thư thường gặp nhất ở phụ nữ và chiếm tỷ lệ tử vong cao nhất ở các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam. D-loop là vùng không mã hóa, kiểm soát sao chép và phiên mã các gene ty thể. Đột biến trên D-loop làm rối loạn chức năng chuỗi hô hấp từ đó đóng góp vào sự phát triển ung thư vu. SNP rs3937033 (T/C) trên D-loop đã được báo cáo là có liên quan đến ung thư vu ở quần thể Âu Mỹ (OR [95%CI]= 1,98 [1,25–3,12].
SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL: NATURAL SCIENCE, VOL 1, ISSUE 6, 2017 Bước đầu xác định mối liên quan SNP rs3937033 DNA ty thể bệnh ung thư vú người Việt Nam Dương Thị Hồng Hạnh Nguyễn Thị Ngọc Thanh Nguyễn Thị Huệ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Email: honghanh167@gmail.com (Bài nhận ngày 10 tháng 02 năm 2017, nhận đăng ngày 17 tháng 06 năm 2017) TĨM TẮT bệnh/chứng, sau xác định mối liên quan SNP với bệnh Tần số kiểu gene TT, TC CC nhóm bệnh (36 %, % 61 %) nhóm chứng (23 %, % 76 %) tính tốn dựa kết khảo sát kiểu gene mẫu phương pháp HRM với nhiệt độ bắt cặp tối ưu 66 oC Tiến hành phân tích mối liên quan cho thấy allele T làm tăng nguy ung thư vú lên 1,41 lần người bệnh (ORalen [95 % CI] =1,41 [1,03–1,92], P=0,03) Do vậy, SNP rs3937033 thị di truyền tiềm cho chẩn đoán sớm ung thư vú Việt Nam, nhiên nghiên cứu cần tiếp tục thực với cỡ mẫu lớn để đạt độ tin cậy cao Ung thư vú ung thư thường gặp phụ nữ chiếm tỷ lệ tử vong cao nước phát triển, có Việt Nam D-loop vùng khơng mã hóa, kiểm sốt chép phiên mã gene ty thể Đột biến D-loop làm rối loạn chức chuỗi hơ hấp từ đóng góp vào phát triển ung thư vú SNP rs3937033 (T/C) D-loop báo cáo có liên quan đến ung thư vú quần thể Âu Mỹ (OR [95%CI]= 1,98 [1,25–3,12], P=0,036), người da Trắng (OR[95%CI]= 21 [2,15–204,6], P=0,003) Trong nghiên cứu này, phương pháp High Resolution Melt (HRM) tối ưu để tầm soát kiểu gene 100/100 mẫu Từ khóa: mtDNA, D-loop, ung thư vú, SNP T16519C, rs3937033 MỞ ĐẦU Ung thư vú ung thư thường gặp phụ nữ giới, chiếm tỷ lệ tử vong cao phụ nữ với gần 1,7 tỷ ca mắc có 5,20/100.000 ca tử vong thống kê năm 2012 [1] Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh ung thư vú liên tục tăng theo năm Năm 2012, theo ước tính IARC có khoảng 9,91/100.000 ca tử vong số 22,96/100.000 ca mắc ung thư vú nước [2] Nguyên nhân chủ yếu dẫn đến tử lệ tử vong cao xác định bệnh chẩn đoán phát chủ yếu vào giai đoạn trễ bệnh, chủ yếu giai đoạn II (61,2 %), III (19,4 %) [3] Theo báo cáo tổ chức WHO năm 2012 cho biết Trang 40 bệnh phát sớm giảm nguy tử vong xuống 1/3 so với tỷ lệ mắc, từ cho thấy việc chẩn đốn phát sớm ung thư vú đóng vai trò quan trọng hướng điều trị để nâng cao khả sống cho bệnh nhân Những biến đổi di truyền xem nguyên nhân gây nên tiến triển ung thư vú Bên cạnh đột biến nghiêm trọng xảy nhân đột biến mtDNA đặc biệt vùng D-loop quan sát thấy nhiều loại ung thư [4] Gần DNA ty thể (mtDNA) xem thị sử dụng chẩn đoán nguy mắc bệnh giai đoạn sớm Ty thể bào quan đóng vai trò quan trọng chuyển hóa lượng, lão hóa apoptosis [5] mtDNA TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ: CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 1, SỚ 6, 2017 người có cấu trúc sợi đơi, phân tử đóng vòng, có kích thước 16,569 base pairs mã hóa cho 13 polypeptide chuỗi chuyển điện tử (ETC), 22 transfer RNAs (tRNA) ribosomal RNAs (12S 16 S rRNA) [6] mtDNA có tỷ lệ đột biến cao DNA nhân (nDNA) gấp 10-20 lần [7] dễ dàng bị tổn thương oxy hóa thiếu bảo vệ protein giống histon, khơng có introns chế hoạt động hiệu hệ thống sửa chữa chép nhạy cảm với mức độ ROS cao tạo tế bào [8] Displacement loop (D-loop) vùng khơng mã hóa mtDNA có kích thước 1124bp (16024–576np) biết đến điểm nóng thường xảy đột biến, chịu trách nhiệm kiểm soát chép phiên mã gene ty thể [9] Do vậy, biến đổi xảy vùng làm thay đổi trình chép phiên mã gene, gây ảnh hưởng đến chức thành phần chuỗi ETC gốc oxy hóa (ROS) tạo mức tế bào, từ góp phần vào khởi phát tiến triển ung thư, có ung thư vú [10, 11] Không vậy, tăng mức ROS tế bào liên quan đến tổn thương nDNA, ảnh hưởng đến đường truyền tín hiệu dẫn đến hoạt hóa số oncogen ức chế gene ức chế khối u từ ức chế trình apoptosis, tăng sinh mạch thúc đẩy di ung thư [12] Sự đa hình rs3937033 xảy thay đổi allele từ Thymine (T) thành Cystosine (C) vị trí 16519np D-loop mtDNA, gọi SNP T16519C, quan sát thấy điểm nóng thường xảy biến đổi liên quan đến tiến triển ung thư vú [13, 14] Hơn nữa, có nhiều nghiên cứu giới cho thấy SNP rs3937033 có mối liên quan mật thiết đến nguy mắc bệnh ung thư vú quần thể Âu Mỹ Người da trắng [14, 15] Tuy nhiên, quần thể, dân tộc khác có đặc điểm di truyền khác nên việc xác định mối liên quan SNP rs3937033 với bệnh ung thư vú cho dân tộc cần thiết Tại Việt Nam việc xác định mối liên quan SNP rs3937033 với bệnh chưa thực Do vậy, nghiên cứu bước đầu tiến hành xác định mối liên quan SNP rs3937033 nguy phát triển ung thư vú phụ nữ Việt Nam với công cụ tầm soát kiểu gene phương pháp High Resolution Melt (HRM) tối ưu, nhằm mục đích tìm kiếm thị di truyền đặc trưng phục vụ cho chẩn đoán sớm ung thư vú người Việt Nam tương lai VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Quần thể nghiên cứu Quần thể sử dụng cho nghiên cứu phụ nữ người Việt Nam 100 mẫu máu từ bệnh nhân chẩn đoán ung thư vú thu từ Khoa Ngoại Bệnh viện Ung Bướu Thành phố Hồ Chí Minh 100 mẫu máu từ người khỏe mạnh thu nhận từ phòng phòng khám Sức Sống Khoa Ngoại bệnh Viện Ung Bướu Tất mẫu sử dụng có đồng thuận bệnh nhân tham gia nghiên cứu Mẫu sau thu nhận lưu trữ -200C sẵn sàng cho tách chiết Tách chiết DNA DNA tổng số từ mẫu máu tách chiết phương pháp muối theo quy trình N.T Huệ cộng [16] Đầu tiên, tế bào máu trắng phân lập thu nhận lại từ máu tổng số, sau xử lý nhiều hóa chất DNA tổng số thu nhận cách tủa cồn Sau loại bỏ cồn, phần cặn DNA huyền phù nước phân tử dùng cho PCR (nuclease-free water) lưu trữ -20 0C chuẩn bị cho bước Thiết kế tối ưu hóa phương pháp HRM HRM phương pháp xác định kiểu gene SNP dựa vào khác biệt Tm đoạn sản phẩm DNA Hình dạng đường cong nóng chảy với kiểu gene đặc trưng hiển thị biểu đồ phân tích nhờ vào máy đọc tín hiệu màu huỳnh quang phát từ mạch đôi DNA bị biến tính Trang 41 SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL: NATURAL SCIENCE, VOL 1, ISSUE 6, 2017 Và đó, tăng dần nhiệt độ, DNA dần tách mạch với giảm dần tín hiệu huỳnh quang Các kiểu gene khác cho đường cong nóng chảy đặc trưng Do vậy, cặp mồi cho HRM thiết kế nằm gần vị trí SNP để làm giảm kích thước trình tự khuếch đại, tăng khác biệt Tm kiểu gene, tách biệt chúng rõ ràng Việc xác định mẫu chứng đại diện cho kiểu gene chuẩn SNP rs3937033 thực thông qua phân tích HRM số mẫu DNA ngẫu nhiên Thành phần 5µL/phản ứng HRM bao gồm: Brilliant HRM Ultra-Fast Loci Master Mix 1X (AGILENT), 0,2 µM cho mồi, ng/µL DNA tổng số thêm nước cho đủ thể tích Thiết kế mồi Xác định kiểu gene Việc xác định vị trí thu nhận trình tự nucleotide SNP rs3937033 lấy từ NCBI Các cặp mồi thiết kế phần mềm Primer3Plus, kiểm tra độ đặc hiệu mồi nhiều phần mềm chuyên dụng Primer Blast, NCBI Blast tool để chắn khơng có sản phẩm PCR không mong muốn Cuối kiểm tra đặc hiệu mồi dựa hình thành cấu trúc thứ cấp dimer mồi phần mềm OligoAnalyzer 3.1 (https://www.idtdna.com/calc/analyzer) Sau có mẫu chứng đại diện cho kiểu gene, điều kiện phản ứng tiếp tục tối ưu hóa để có tách biệt rõ ràng nhóm đường cong đại diện cho kiểu gene Điều kiện HRM tốt lựa chọn để tầm soát kiểu gene 100/100 mẫu bệnh/chứng Phân tích kết HRM thực phần mềm chuyên dụng LightCycler® 96 SW 1.1 Từ kết phân tích kiểu gene từ HRM, tần số allele C (f(C)) T (f(T)) tính theo cơng thức: f(C) = f(CC) + ½ f (CT) f (T) = f (TT) + ½ f (CT), f (CC, CT TT) số cá thể mang kiểu gene cụ thể chia cho tổng số mẫu nhóm khảo sát Dự đốn sản phẩm HRM phần mềm in silico Trình tự sản phẩm HRM xác nhận lấy từ in silico PCR sở liệu UCSC (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) Dự đoán kiểu gene dựa đường cong nóng chảy từ phần mềm UMELT HETs(https://www.dna.utah.edu/hets/umh.php) Đoạn trình tự sản phẩm HRM truy xuất từ in silico sử dụng để dự đoán đường cong nóng chảy tương ứng với kiểu gene chuẩn cho SNP rs3937033 Nồng độ MgCl2 DMSO khảo sát để kiểm tra ảnh hưởng chúng lên tách biệt dạng đường cong nóng chảy Tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp mồi (Ta) Khảo sát khoảng nhiệt độ từ 60–700C chu trình nhiệt máy PCR Eppendorf Toptaq Master Mix (QIAGEN) Thành phần cho 25 µL/phản ứng PCR bao gồm: Toptaq Master Mix 1X, 0,2 µM mồi, DNA 10 ng/µL nước phân tử (nuclease-free water) cho đủ thể tích Xác định mẫu chứng Trang 42 Phân tích thống kê Để xác định tần số allele kiểu gene có khác biệt đáng kể hay không, sử dụng phần mềm phân tích chuyên dụng STATA ver.12 để thử nghiệm mức ý nghĩa thống kê Chi-Square Với mức ý nghĩa thống kê đạt giá trị P < 0,05 cho thấy SNP rs3937033 có mối liên quan với ung thư vú Hơn OR [95%CI] tính tốn để đánh giá mạnh yếu mối liên quan SNP rs 3937033 với bệnh Ước tính độ tin cậy nghiên cứu Trong nghiên cứu di truyền quần thể, cỡ mẫu sử dụng yếu tố ảnh hưởng đến độ tin cậy kết nghiên cứu Việc sử dụng cỡ mẫu mang lại độ tin cậy cao tiết kiệm kinh phí thực Độ tin cậy nghiên cứu (power), số lượng mẫu (sample size) cần thiết cho nghiên cứu tương lai ước tính phần mềm TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ: CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 1, SỚ 6, 2017 phân tích Philippe Glaziou (http://sampsize sourceforge.net/iface/s3.html) [17] Primer3Plus, Primer Blast, NCBI Blast tool, OligoAnalyzer 3.1 dự đốn đường cong nóng chảy rõ ràng từ UMELT HETs (Hình 1) Cặp mồi sử dụng cho giải trình tự để xác nhận kiểu gene chứng từ phân tích HRM thiết kế cho SNP vị trí vùng trung tâm trình tự sản phẩm mục tiêu Các cặp mồi thiết kế tốt lựa chọn thể Bảng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Thiết kế mồi dự đoán in silico Cặp mồi thiết kế lựa chọn thỏa mãn tiêu chí độ đặc hiệu phần mềm Bảng Các cặp mồi HRM giải trình tự Xi CTATCACACATCAACTGCAACTCCAA 67,9 0C Kích thước mồi 26bp Ngược ATAGGATGAGGCAGGAATCAAAGACA 68,4 0C 26bp Xuôi AGTGAACTGTATCCGACATCTGGTTCC 69,7 0C 27bp 0C 25bp Mồi Mồi giải trình tự Mồi HRM Trình tự mồi Ngược Tm mồi AAGGGGAACGTGTGGGCTATTTAGG A 70,9 Kích thước sản phẩm 496bp 70bp B Hình Kết phân tích biểu đồ nhằm dự đốn đường cong nóng chảy A: đường cong nóng chảy, B: đỉnh nóng chảy UMELT HETs nồng độ Mg2+ 1,5mM, DMSO 0% SNP rs3937033 Tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp mồi Để tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp mồi, khoảng nhiệt độ từ 60 đến 70 0C khảo sát, kết phân tích bảng điện di gel argarose 1,5% (Hình 2) Kết điện di gel cho thấy vạch sản phẩm diện nhiệt độ từ 60– 680C Tuy nhiên để đảm bảo độ đặc hiệu tối đa lượng sản phẩm mục tiêu đủ cho phân tích HRM tốt chọn 66 0C nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho phân tích HRM Hình Kết điện di sản phẩm PCR nhằm xác định nhiệt độ bắt cặp mồi tối ưu Trang 43 SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL: NATURAL SCIENCE, VOL 1, ISSUE 6, 2017 Xác định mẫu chứng Với điều kiện phản ứng HRM lựa chọn: Brilliant HRM Ultra-Fast Loci Master Mix 1X Ta tối ưu 660C, số mẫu DNA ngẫu nhiên tiến hành phân tích HRM để tìm mẫu chứng đại diện cho kiểu gene chuẩn SNP rs3937033 Dựa tách biệt rõ ràng nhóm đường cong nóng chảy hiển thị từ phần mềm LightCycler® 96 SW 1.1, số mẫu đại diện cho nhóm đường cong nóng chảy tiến hành giải trình tự để xác nhận kiểu gene dự đốn từ phân tích HRM Kết giải trình tự phân tích phần mềm Sequencing Analysis 5.3 Kết nhận mong đợi, với kiểu đường cong nóng chảy đặc trưng Chúng nhận kiểu gene SNP: CC, TT TC (Hình 3) Kiểu gene CC Kiểu gene TT Kiểu gene TC Hình Kết giải trình tự xác nhận ba mẫu chứng Xác định kiểu gene cho mẫu bệnh chứng Dựa điều kiện HRM tối ưu mẫu chứng dương đại diện cho kiểu gene chuẩn TT, CC, TC SNP vừa xác định, 100/100 mẫu bệnh/chứng tiến hành phân tích HRM để xác định kiểu gene chúng (Hình 4) A Trang 44 B C TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ: CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 1, SỚ 6, 2017 Hình Kết phân tích HRM xác định kiểu gene 100/100 mẫu bệnh chứng A) đường cong nóng chảy, B) đỉnh nóng chảy, C) cụm biểu đồ khác biệt Xác định tần số kiểu gen, allele xác định mối liên quan SNP rs3937033 với bệnh Dựa kết xác định kiểu gene từ phân tích HRM, việc tính tốn tần số kiểu gene allele thực Kết cho thấy tần số kiểu gene TT, TC CC tương ứng nhóm bệnh 36 %, % 61 % nhóm người khỏe mạnh 23 %, % 76 % Tần số allele T C xác định nhóm bệnh 37,5 % 62,5 % nhóm chứng 23,5 % 76,5 % Kết cho thấy kiểu gene CC allele C xuất thường xuyên nhóm chứng Bên cạnh đó, phân tích Chisquare (χ2) rõ khác biệt đáng kể nhóm bệnh nhóm chứng người mang allele T kiểm định χ2=4,77 đạt mức ý nghĩa thống kê (P=0,03), tỷ số nguy ORalen T [95% CI] =1,41 [1,03 – 1,92], P = 0,03) Kiểm định χ2 kiểu gene chứa allele T 5,58, gần đạt mức ý nghĩa thống kê P=0,06 chứng tỏ kiểu gene có chứa allele T mang nguy liên quan đến bệnh Phân tích cụ thể mơ hình di tryền kiểu gene cho thấy: TT vs CC: OR [95% CI] =1,95 [1,05 – 3,63], P = 0,03 ); TT+TC vs CC: OR [95% CI] =2,03 [1,10– 3,73], P = 0,02 (Bảng 2) Với kết phân tích độ tin cậy nghiên cứu đạt 18,67 % Bảng Tần số kiểu gene allele rs3937033 Kiểu gen 100 mẫu ung thư vú 100 người khỏe mạnh χ2 P-value TT 36 (36%) 23 (23%) Alen TC (3%) (1%) χ2 = 5,58 P = 0,06 CC 61 (61%) 76 (76%) T C 75 (37,5%) 125(62,5%) 47 (23,5%) 153(76,5%) χ2 = 4,77 P = 0,03 Bảng Phân tích mối liên quan allele kiểu gene rs3937033 với bệnh Bệnh/chứng 100/100 OR [95%CI] P-value Độ tin cậy T vs C TC vs CC TT vs CC TT+TC vs CC 1,41[1,03-1,92] 3,74[0,38-36,84] 1,95[1,05-3,63] 2,03[1,10-3,73] 0,03 0,23 Ước tính cỡ mẫu để tăng độ tin cậy nghiên cứu Dựa kết phân tích mẫu 100 bệnh/chứng ban đầu cho thấy SNP có mối liên quan với bệnh ung thư vú người Việt Nam, độ tin cậy nghiên cứu thấp 18,67 %, tiến hành ước tính gia tăng độ tin cậy nghiên cứu tăng mẫu nghiên cứu Kết phân tích cho thấy tăng cỡ mẫu lên 428 mẫu bệnh/chứng độ tin cậy nghiên cứu cải thiện đáng kể lên đến ≥ 60 % Để đạt độ 0,03 18,67% 0,02 tin cậy 90 % cỡ mẫu ước tính cần có 916 mẫu bệnh/chứng (Bảng 4) Bảng Ước tính cỡ mẫu cho SNP rs3937033 với tăng độ tin cậy cho nghiên cứu Power SNPs Rs3937033 60 % 70 % 80 % 90 % 428/428 539/539 685/685 916/916 Trong nghiên cứu này, tiến hành xác định mối liên hệ SNPs rs3937033 với bệnh ung thư vú người Việt Nam sử dụng cơng cụ tầm sốt kiểu gene phương pháp HRM Đây Trang 45 SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL: NATURAL SCIENCE, VOL 1, ISSUE 6, 2017 phương pháp xác định kiểu gene với độ phân giải cao, phân biệt trình tự DNA khác nucleotide dựa nhiệt độ nóng chảy (Tm) sản phẩm PCR Các cặp mồi thiết kế đặc hiệu cho phân tích HRM phần mềm chuyên dụng Primer3Plus, Primer Blast, NCBI Blast tool OligoAnalyzer3.1 Cặp mồi lựa chọn đáp ứng đầy đủ điều kiện độ đặc hiệu phân biệt rõ dạng đường cong nóng chảy từ dự đốn UMELT HETs Trong vùng nhiệt độ bắt cặp mồi từ 60 – 70 0C khảo sát cho phân tích HRM cho thấy 66 0C nhiệt độ thích hợp lựa chọn Với điều kiện ban đầu này, số mẫu DNA ngẫu nhiên tiến hành phân tích HRM để tìm mẫu chứng đại diện cho kiểu gene chuẩn dựa kiểu đường cong nóng nóng chảy HRM Các mẫu DNA đại diện cho nhóm đường cong nóng chảy HRM tiến hành giải trình tự tự động để xác nhận kiểu gen Với mẫu chuẩn vừa xác định mẫu chứng âm (sử dụng nuclease-free water làm chứng âm) chúng tơi tiến hành tầm sốt kiểu gene cho mẫu 100/100 mẫu bệnh/chứng Kết phân tích cho thấy tần số kiểu gene TT, TC CC tương ứng nhóm bệnh 36 %, % 61 % nhóm người khỏe mạnh 23 %, % 76 %, tần số allele T C tương ứng nhóm bệnh 37,5 % 62,5 % nhóm chứng 23,5 % 76,5 % Phân tích thống kê kiểm định Chi-square cho thấy giá trị OR phân tích allele 1,41 với 95% CI = 1,3 – 1,92 có ý nghĩa mặt thống kê (P=0,03) (Bảng3) Điều cho thấy allele T allele nguy đóng góp vào phát triển ung thư vú, với thay đổi allele T thành C cho thấy làm giảm nguy mắc bệnh Bên cạnh đó, kết phân tích kiểu gene đồng hợp TT so với CC [OR [95% CI] =1,95 [1,05 – 3,63], P = 0,03] kết hợp kiểu gene TT TC với CC [OR [95% CI] =2,03 [1,10– 3,73], P = 0,02] tăng nguy mắc ung thư vú người Việt Nam Khác với kết luận chúng tôi, nghiên cứu di truyền quần thể 156 bệnh nhân ung thư vú Trang 46 260 người khỏe mạnh người Maryland (Âu Mỹ) cho thấy thay đổi trình tự T>C SNP rs3937033 có mối liên quan đến nguy tăng ung thư vú (P=0,036; OR=1,98; 95%CI=1,25 – 3,12) [15] Một nghiên cứu tiếp tục quần thể Âu Mỹ 156/260 bệnh/chứng cho thấy có tương tác đồng thời biến đổi T>C rs3937033 rs2853826 A>G cho thấy làm tăng nguy ung thư vú (P=0,02) [18] Một nghiên cứu khác quần thể người da trắng cho thấy thay đổi T>C chiếm 90% người mang đột biến BRCA1 có mối liên quan với bệnh nhân ung thư vú bị đột biến BRCA1 (OR = 21, 95%CI [2,15 – 204,6], P=0,003) so sánh với người không mang đột biến BRCA1 (30 %), bên cạnh rs3937033 cho thấy có liên quan đến giai đoạn biệt hóa khối u xuất 57 % giai đoạn (G3 – tumor grade diffirentiation) 12,5 % giai đoạn (G2) (P=0,05) [14] tìm thấy trước có liên quan đến nguy làm tăng ung thư vú gia đình [15] Điều cho thấy rằng, rs3937033 nóng thường xảy đột biến đóng vai trò quan trọng nguy phát triển ung thư vú [14] Hơn rs3937033 SNP nằm vùng quan trọng mtDNA – DLOOP chịu trách nhiệm khởi động kiểm sốt q trình chép phiên mã gen Đột biến xảy vùng D-Loop dẫn đến thay đổi biểu gen, khả điều hòa hệ thống OXPHOS q trình chuyển hóa chất ty thể [7, 19] Do thay đổi di truyền T>C SNP rs3937033 nguyên nhân góp phần làm rối loạn trình chép phiên mã, từ góp phần vào nguy phát triển ung thư vú Tuy nhiên, nghiên cứu chúng tôi, việc xác định mối liên quan rs3937033 với nguy mắc ung thư vú quần thể Việt Nam với mẫu 100 bệnh/chứng mặc thấy khả cao có mối liên quan với bệnh đạt giá trị tin cậy (Power) 18,67 %, chứng tỏ kết nghiên cứu có độ tin cậy q thấp Và đó, cỡ mẫu sử dụng cho nghiên cứu TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ: CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 1, SỚ 6, 2017 ngun nhân làm giảm giá trị tin cậy nghiên cứu, việc xác định mối liên quan rs3937033 cần thực với cỡ mẫu lớn để đạt độ tin cậy nghiên cứu cao (power 90 % đề xuất) Dựa khác biệt tần số allele nhóm bệnh nhóm chứng (odd ratio), ước tính số cỡ mẫu bệnh/chứng cần sử dụng để tăng độ tin cậy nghiên cứu thực Kết phân tích cho thấy rõ ràng việc tăng độ tin cậy nghiên cứu phụ thuộc vào số lượng cỡ mẫu: với mẫu 100 bệnh/chứng độ tin cậy đạt 18,67 %, cỡ mẫu tăng lên 916 bệnh/chứng độ tin cậy nghiên cứu đạt đến 90 % Điều cho thấy việc ước tính để dự đoán cỡ mẫu sử dụng độ tin cậy nghiên cứu cần thiết cho nghiên cứu di truyền quần thể, cỡ mẫu thích hợp sử dụng có vai trò quan trọng nghiên cứu bệnh/chứng nhằm tiết kiệm kinh phí, mang lại hiệu cao xác KẾT LUẬN Trong nghiên cứu bệnh/chứng cho thấy SNP rs3937033 thị nhạy cảm với nguy mắc ung thư vú quần thể Việt Nam với OR=1,41; 95 % CI = [1,3 – 1,92], P=0,03 Tuy nhiên, giá trị tin cậy nghiên cứu thấp có 18,67 %, cần thiết phải tăng cỡ mẫu lên 916 mẫu bệnh/chứng để đảm bảo đạt đến độ tin cậy 90 %, cần thiết cho nghiên cứu di truyền quần thể Như vậy, với kết giới hạn nghiên cứu 100 bệnh/chứng cung cấp thông tin ban đầu để định hướng cho việc thực nghiên cứu lớn sâu sắc để xác định cách xác tin cậy mối liên hệ SNP rs3937033 với bệnh ung thư vú, từ cung cấp thơng tin đầy đủ cho việc chẩn đoánvàchữatrị bệnh ung thư vú phụ nữ Việt Nam trongtươnglai Lời cảm ơn: Chúng cảm ơn tất bác sĩ nhân viên Bệnh viện Ung Bướu thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam cung cấp mẫu máu cho nghiên cứu Nghiên cứu tài trợ Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh – C2016-18-01 Initial determination of the association between SNP rs3937033 on the D-LOOP mtDNA and breast cancer in Vietnam Duong Thi Hong Hanh Nguyen Thi Ngoc Thanh Nguyen Thi Hue University of Science, VNU-HCM ABSTRACT Breast cancer (BC) is the most common cancer among women and accounts for the highest mortality rates in the developing countries, including Vietnam D-loop, is a non-coding region in mitochondrialcircular DNA molecules, related to control the replication and transcription of mitochondrial genes D-loop mutations cause the dysfunction of the respiratory chain, which contributes to the process of BC SNP rs3937033 (T/C) on D-loop was reported to have the association with BC in Europe America population (OR [95%CI]= 1.98 [1.25–3.12], P=0.036), and Caucasian (OR[95%CI]= 21 [2.15–204.6], P=0.003) In this study, the High Resolution Melting (HRM) method is optimized for genotyping 100/100 cases/controls samples, then to determine the association between the disease and this SNP TT, TC and CC genotype Trang 47 SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL: NATURAL SCIENCE, VOL 1, ISSUE 6, 2017 frequencies in patient group (36 %, % and 61 %) and control group (23 %, % and 76 %) were calculated based on the results of genotyping by optimal HRM method with the annealing temperature is 66 0C Association analysis result showed that T allele increases the risk of breast cancer patients up to 1.41 times (OR [95% CI] = 1.41 [1.3-1.92], Pallele = 0.03) Therefore, SNP rs3937033 could be a potential biomarker for early BC diagnosis in Vietnamese However, this research needs to be conducted with a larger sample size to reach the greater confidence Keyword:mtDNA, D-loop, breast cancer, SNP T16519C, rs3937033 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] L.A.Torre, et al., Global cancer statistics, 2012 cancers, Mutation Research/Reviews in CA Cancer J Clin, 2015 Mutation Research, 488, 1, 9–23 (2001) [2] GLOBOCAN, GLOBOCAN 2012: Estimated [11] A.Lièvre, et al., Clinical value of mitochondrial Incidence, Mortality and Prevalence mutations in colorectal cancer, Journal of Worldwide in 2012; Available from: Clinical Oncology, 23, 15, 3517–3525 (2005) http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_canc [12] P.C.Goswami, Mutant mitochondria and cancer er.aspx cell metastasis: quest for a mechanism, Cancer [3] N.H.Lan, W Laohasiriwong, J.F Stewart, Biology & Therapy, 8, 14, 1386–1388 (2009) Survival probability and prognostic factors for [13] M.Kulawiec, K.M Owens, K.K Singh, Cancer breast cancer patients in Vietnam, Global cell mitochondria confer apoptosis resistance Health Action, 17, 6, 1–9 (2013) and promote metastasis, Cancer Biology & [4] M.Yu, et al., Sequence variations of Therapy, 8, 14, 1378–1385 (2009) mitochondrial DNA D-loop region are highly [14] S.Tommasi, et al., Mitochondrial DNA variants frequent events in familial breast cancer, and risk of familial breast cancer: an Journal of Biomedical Science, 15, 4, 535–543 exploratory study, International Journal of (2008) Oncology, 44, 5, 1691–1698 (2014) [5] D.C.Chan, Mitochondria: dynamic organelles [15] R.K.Bai, et al., Mitochondrial genetic in disease, aging, and development, Cell, 125, background modifies breast cancer risk, Cancer 7, 1241–1252 (2006) Research, 67, 10, 4687–4694 (2007) [6] A.Smith, R Staden, I Young, Sequence and [16] N.T.Hue, et al., Extraction of human genomic organization of the human mitochondrial DNA from dried blood spots and hair roots, genome, Nature, 290, 5806, 457–465 (1981) International Journal of Bioscience, [7] H.C Lee, et al., Mitochondrial genome Biochemistry and Bioinformatics, 2, 1, 21, instability and mtDNA depletion in human 2012 cancers, Annals of the New York Academy of [17] Glaziou, P Sample Size Available from: Sciences, 1042, 1, 109–122 (2005) http://sampsize.sourceforge.net/iface/s3.html, [8] D.L Croteau, V.A Bohr, Repair of oxidative 2005 [cited 2015 August 25th] damage to nuclear and mitochondrial DNA in [18] D.Covarrubias, et al., Mitochondrial DNA mammalian cells, Journal of Biological variant interactions modify breast cancer risk, Chemistry, 272, 41, 25409–25412 (1997) Journal of Human Genetics, 53, 10, 924–928 [9] Clayton, D.A., Transcription and replication of (2008) mitochondrial DNA, Human Reproduction, [19] K.K Singh, M Kulawiec, Mitochondrial DNA 15(suppl 2), 11–17 (2000) polymorphism and risk of cancer, Cancer [10] N.O.Bianchi, M.S Bianchi, S.M Richard, Epidemiology, 291–303 (2009) Mitochondrial genome instability in human Trang 48 ... nên việc xác định mối liên quan SNP rs3937033 với bệnh ung thư vú cho dân tộc cần thiết Tại Việt Nam việc xác định mối liên quan SNP rs3937033 với bệnh chưa thực Do vậy, nghiên cứu bước đầu tiến... nghiên cứu chúng tôi, việc xác định mối liên quan rs3937033 với nguy mắc ung thư vú quần thể Việt Nam với mẫu 100 bệnh/ chứng mặc thấy khả cao có mối liên quan với bệnh đạt giá trị tin cậy (Power)... đoán sớm ung thư vú người Việt Nam tương lai VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Quần thể nghiên cứu Quần thể sử dụng cho nghiên cứu phụ nữ người Việt Nam 100 mẫu máu từ bệnh nhân chẩn đoán ung thư vú thu