Khảo sát kiểu gen Cytochrome P450 3A4 Subtype 1B (CYP3A4*1B) trên bệnh nhân viêm loét dạ dày tá tràng

Helicobacter Pylori (Hp) là nguyên nhân gây viêm dạ dày mãn tính, loét dạ dày tá tràng và đã được ghi nhận là tác nhân gây ung thư dạ dày loại I (1, 2). Tuy nhiên, các nghiên cứu thống kê gần đây cho thấy tỉ lệ thất bại trong tiệt trừ Hp ngày càng có xu hướng tăng. Bài viết trình bày khảo sát kiểu gen CYP3A4*1B của bệnh nhân viêm loét dạ dày tá tràng do Hp bằng phương pháp giải trình tự.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học KHẢO SÁT KIỂU GEN CYTOCHROME P450 3A4 SUBTYPE 1B (CYP3A4*1B) TRÊN BỆNH NHÂN VIÊM LOÉT DẠ DÀY TÁ TRÀNG Vũ Diễm My*, Hoàng Thị Phương Chi**, Bùi Hữu Hoàng***, ĐỗThị Thanh Thuỷ * TÓM TẮT Giới thiệu: Helicobacter Pylori (Hp) nguyên nhân gây viêm dày mãn tính, loét dày tá tràng ghi nhận tác nhân gây ung thư dày loại I (1, 2) Tuy nhiên, nghiên cứu thống kê gần cho thấy tỉ lệ thất bại tiệt trừ Hp ngày có xu hướng tăng Tính đa hình kiểu gen Cytochrome P450 3A4 (CYP3A4) ghi nhận có ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính sinh học khả tiệt trừ kháng sinh Đồng thời, thuốc ức chế bơm proton (proton pump inhibitor - PPI) sử dụng nhằm trì pH dày trung tính, giúp tăng hiệu tiệt trừ Hp;cũng chuyển hố phần enzyme Chính vậy, việc xác định kiểu gen CYP3A4 cần thiết nhằm cải thiện tỉ lệ tiệt trừ Hp Mục đích: Khảo sát kiểu gen CYP3A4*1B bệnh nhân viêm loét dày tá tràng Hp phương pháp giải trình tự Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu cắt ngang mơ tả Tối ưu hố phản ứng PCR giải trình tự Sử dụng phần mềm tin sinh học xác định kiểu gen CYP3A4*1B Tiến hành thu nhận mẫu sinh thiết dày bệnh nhân viêm loét, ly trích thu DNA, thực phản ứng PCR giải trình tự, phân tích kết xác định kiểu gen Kết quả: Áp dụng thành công quy trình PCR giải trình tự xác định kiểu gen CYP3A4*1B bệnh nhân Thực khảo sát 50 bệnh nhân, ghi nhận có trường hợp bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp tử Các bệnh nhân lại mang kiểu gen đồng hợp tử Kết luận: Nghiên cứu áp dụng thành cơng quy trình PCR giải trình tự nhằm xác định kiểu gen CYP3A4*1B bệnh nhân Từ khố: CYP3A4*1B, Helicobacter pylori, giải trình tự, thất bại điều trị ABSTRACT CHARACTERISTIC OF CYTOCHROME P450 3A4 SUBTYPE1B (CYP3A4*1B) POLYMOPHISMS BY USING MULTIPLEX REAL-TIME PCR Vu Diem My, Hoang Thi Phuong Chi, Bui Huu Hoang, Do Thi Thanh Thuy * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No - 2016:319 - 323 Background: Helicobacter Pylori (Hp) causes chronic gastritis, gastric and duodenal ulcer It also has been recognized as class I gastric carcinogen Unfortunately, the recent stastistics have shown that Hp eradication efficacy seems lower The antibiotic resistance is reported for affecting to unresponded treatment Many antibiotics used in Hp eradiacation that calalyzed by the Cytochrome P450 (CYP) system CYP3A4 enzyme is the main path among them, as well as has been recorded for greatly contribution to variations in bioavailability and clearance of many antibiotics CYP3A4 catalyzes proton pump inhibitors (PPIs), one of the most necessary drugs, as well Therefore, the determination of CYP3A4 will help to enhancethe treatment * Trung tâm Y sinh học phân tử, Đại học Y Dược Tp HCM ** Đại học Khoa học tự nhiên Tp HCM *** Bệnh viện Đại học Y Dược Tp HCM Tác giả liên lạc: CN Vũ Diễm My ĐT: 0919 789 811 Email: diemmyvu@ump.edu.vn Tiêu Hóa 319 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Objectives: Characterized CYP3A4*1B genotype of patients by using sequencing technique Methods: This is a cross section study PCR and Sanger sequencing procedures were optimized Using the bioinformatics for analyzing sequencing results The biopsy of ulcer patients was collected for DNA extraction, PCR and sequencing to define the genotypes Results: Successfully applied PCR and sequencing techniques for determining CYP3A4*1B genotype of 50 patients The results recorded one case what had heterozygeous genotype while remaining cases with homozygeous genotype Conclusions: Successfully optimized PCR and sequencing proceduresfor identifying CYP3A4*1B polymorphism Keywords: Real-time PCR, CYP2C19 polymorphism, Helicobacter pylori, eradicative treatment ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiễm Hp nguy gây ung thư dày biết rõ (10) Có khoảng 90% trường hợp viêm dày có diện vi khuẩn Hp Tương tự, tỷ lệ chiếm từ 75 - 85% bệnh loét dày; 95 - 100% bệnh loét tá tràng; biến chứng thủng loét dày tá tràng diện loại vi khuẩn chiếm từ 80 - 95% trường hợp Chính vậy, việc điều trị tiệt trừ Hp cần thiết nhằm ngăn ngừa biến chứng xuất huyết; loét thủng dày; nặng ung thư dày, tá tràng Hp xoắn khuẩn có dạng hình cánh én, với kích thước dao động từ 0,5 - 1µm Nhờ có đặc tính sinh lý, sinh hóa chúng tồn môi trường pH acid thấp dày gây bệnh(10) Trên 50% dân số giới nhiễm Hp(3,6) Tỷ lệ nhiễm Hp tăng theo lứa tuổi chiếm tỉ lệ cao nước phát triển Điển hình Canada Mỹ tỷ lệ nhiễm Hp người trưởng thành khoảng 30%, Ethiopia tỷ lệ lên đến 95% (6) Ở nước ta khoảng 70% người trưởng thành nhiễm Hp Hiện nay, phác đồ điều trị tiệt trừ Hp sử dụng thuốc ức chế bơm proton (proton pump inhibitor - PPI) kết hợp hai loại kháng sinh khác (4) Tuy nhiên, giảm tiết acid dịch vị PPI gây ảnh hưởng đến hấp thụ kháng sinh này(7) Đồng thời, tỷ lệ kháng thuốc cao nguyên nhân dự báo thất bại điều trị 320 CYP3A4 enzyme có tính đa hình cao thuộc hệ thống Cytochrome P450 (CYP), chịu trách nhiệm chuyển hoá khoảng 50% loại thuốc thương mại hoá(5) Gen CYP3A4 bao gồm 13 exon nằm nhiễm sắc thể số vị trí 7q22.1 Tính đến nay, có khoảng 23 biến thể CYP3A4 ghi nhận (http://www.ebmconsult.com/articles/geneticpolymorphisms-cytochrome-p450-cyp3a4enzyme) Sự tương tác loại thuốc (drug drug interactions) sử dụng tiệt trừ Hp clarithromycin, amoxicillin với PPI chịu ảnh hưởng enzyme Mặt khác, tỷ lệ kiểu gen CYP3A4 thay đổi tùy quần thể Do đó, sử dụng liều thuốc cho tất bệnh nhân dẫn đến tỷ lệ thành công tiệt trừ Hp không đồng Vì vậy, việc xác định tính đa hình kiểu gen CYP3A4 giúp tối ưu hoá hiệu tiệt trừ Hp ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu cắt ngang mô tả Đối tượng nghiên cứu 50 bệnh nhân viêm loét dày tá tràng đến thăm khám điều trị Bệnh viện Đại học Y dược Tp.HCM từ tháng 01/2015 đến tháng 10/2015 Phương pháp nghiên cứu Ly trích DNA từ mẫu mơ: mẫu mơ sau tiến hành xét nghiệm CLO test thu nhận xử lý với proteinase K, sau ly trích kit Chuyên Đề Nội Khoa I Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Boom (Nam Khoa) theo hướng dẫn nhà sản xuất Khảo sát tối ưu hoá phản ứng PCR: mồi phản ứng tham khảo từ cơng trình tác Nghiên cứu Y học giả A Sapone, phản ứng PCR thực kit TaKaRa Taq™ Hot Start Version (Takara) theo hướng dẫn nhà sản xuất Bảng 1: Trình tự mồi dùng phản ứng PCR giải trình tự (8) Tên mồi Trình tự (5’ - 3’) CYP3A4 3B CYP3A4 2B CTCTGTCTGTCTGGGTTTGG CCTTTCAGCTCTGTGTTGCTC Kích thước (base pair) 20 21 Nhiệt độ bắt cặp Kích thước sản phẩm (base pair) o 501 54 C Giải trình tự phân tích kết quả: phản ứng giải trình tự thực kit Big Dye Terminator V3.1 (ABI) theo hướng dẫn nhà sản xuất Sử dụng phần mềm CLC Main Workbench để phân tích kết Các thành phần phản ứng PCR bao gồm: 1,5l PCR 10X buffer, 1,5l dNTPs, 0,75l mồi CYP3A4 3B, 0,75l mồi CYP3A4 2B, 0,1l Takara Taq Hotstart Polymerase, 3l genomic DNA (20 50ng/ul), 8,4l nước cất hai lần khử ion KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết giải trình tự phân tích kết xác định kiểu gen CYP3A4*1B: sử dụng phần mềm CLC Main Work Bench để phân tích liệu thơ, kết giải trình tự thể qua đỉnh sóng màu khác nhau, nucleotide A mã hố đỉnh sóng màu xanh lá, nucleotide C mã hố đỉnh sóng màu xanh dương, nucleotide T mã hố đỉnh sóng màu đỏ, nucleotide G mã hố đỉnh sóng màu xanh đen Kết thu nhận mẫu bệnh phẩm: tổng số mẫu thu nhận 50 Đặc điểm mẫu thể bảng sau: Bảng 2: Đặc điểm mẫu bệnh thu nhận Tuổi Tỷ lệ nam/nữ Pylori test dương/âm 28 - 72 19/31 43/7 Kết tối ưu phản ứng PCR: tiến hành khảo sát nhiệt độ bắt cặp (50oC, 52oC, 54oC, 56oC,58oC) thành phần khác phản ứng Kết thu nhận nhiệt độ tối ưu phản ứng 54oC Trường hợp bệnh nhân mang kiểu CYP3A4 bình thường (AA) cho đỉnh sóng A màu xanh lá, bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp CYP3A4*1B (GA) cho tín hiệu sóng đơi, bệnh nhân mang kiểu gen biến đổi CYP3A4*1B Tiêu Hóa đồng hợp (GG) cho đỉnh sóng G màu đen Kết khảo sát 50 mẫu bệnh, ghi nhận có mẫu mang kiểu gen dị hợp CYP3A4*1B mẫu lại mang kiểu gen bình thường 321 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 BÀN LUẬN Trong năm gần đây, việc điều trị tiệt trừ Hp bệnh lý viêm, loét dày tá tràng phải đối mặt với nhiều thách thức, tỷ lệ thất bại ngày có xu hướng tăng Đã có nhiều yếu tố xác định nguyên nhân làm giảm hiệu điều trị Hp Trong đó, hai yếu tố quan trọng việc sử dụng kháng sinh không hiệu ức chế toan không tốt dùng PPI không đủ liều lượnglà nguyên nhân chủ yếu Như đề cập trên, gen CYP3A4 có khoảng 23 biến thể ghi nhận, kiểu gen CYP3A4*1B dạng phổ biến CYP3A4*1B nằm vị trí -392 vùng promoter gen CYP3A4, dạng có đột biến thay đổi nucleotide A thành G dẫn đến tạo protein khiếm khuyết làm giảm hoạt tính enzyme Có khoảng 53% người Mỹ gốc Phi ghi nhận mang kiểu biến thể này, người da trắng tỉ lệ 9% chưa ghi nhận người châu Á (http://www.ebmconsult.com/ articles/genetic-polymorphisms-cytochromep450-cyp3a4-enzyme) Tuy nhiên, theo kết khảo sát 50 bệnh nhân ghi nhận trường hợp mang kiểu gen dị hợp CYP3A4*1B, cho thấy cần phải tiến hành khảo sát với số mẫu lớn để xác định tỉ lệ phân bố kiểu biến thể dân số Việt Nam KẾT LUẬN Hình 2: Các yếu tố dẫn đến thất bại điều trị tiệt trừ Hp Sự chuyển hoá loại kháng sinh sử dụng điều trị Hp như: clarithromycin, metronidazole thực chủ yếu enzyme CYP3A4 Các kháng sinh khác amoxicillin khơng chuyển hố trực tiếp enzyme chịu tác động Do đó, hoạt động enzyme CYP3A4 có ảnh hưởng lớn đến hiệu điều trị Hp(8) Các PPI chuyển hố phần thơng qua đường Sự giảm tiết acid dịch vị PPI ghi nhận gây ảnh hưởng đến hấp thu thuốc khác Độ hòa tan thuốc giảm pH trung tính so với điều kiện có tính acid Khoảng 10 - 20% bệnh nhân sử dụng PPI không ghi nhận hiệu kháng tiết acid mà nguyên nhân chủ yếu chuyển hoá thuốc bị ảnh hưởng tính đa hình kiểu gen(9) Chính vậy, việc xác định kiểu biến thể CYP3A4 cần thiết nhằm tối ưu hiệu tiệt trừ Hp 322 Nghiên cứu thành công việc tối ưu quy trình PCR giải trình tự xác định kiểu biến thể CYP3A4*1B, quy trình sử dụng để khảo sát vai trò CYP3A4*1B việc chuyển hố loại thuốc khác nhiều nhóm bệnh lý khác TÀI LIỆU THAM KHẢO Amieva MR, et al (2008) "Host-bacterial interactions in Helicobacter pylori infection", Gastroenterology 134(1), 306323 Anzenbacher P, et al (2003) "Cytochromes P450: review on their basic principles"Proceedings-indian national science academy part B 69(6), 883-892 Billard A, et al (2012) "The allele-specific probe and primer amplification assay, a new real-time PCR method for fine quantification of single-nucleotide polymorphisms in pooled DNA", Applied and environmental microbiology 78(4), 10631068 Chaudhry AS, et al (2008) "Genetic polymorphism of CYP2C19 and therapeutic response to proton pump inhibitors", Indian J Med Res 127(6), 521-530 Ekroos M, et al (2006) Structural basis for ligand promiscuity in cytochrome P450 3A4 PNAS vol 103, no 37, 13682 - 13687 Hunt RH, et al (2011), "Helicobacter pylori in developing countries World Gastroenterology Organisation global guideline", J Gastrointestin Liver Dis 20(3), 299-304 Ogawa R, Echizen H (2010) Drug - drug interaction profiles of proton pump inhibitors Clin Pharmacokinet 49(8), 509-533 Chuyên Đề Nội Khoa I Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Sapone A, et al (2003) The Clinical Role of Cytochrome P450 Genotypes in Helicobacter pylori Management The American Journal of Gastroenterology Vol 98, No 5, 1010-1015 Shimatani T, et al (2006) Acid-suppressive effects of rabeprazole, omeprazole, and lansoprazole at reduced and standard doses: a crossover comparative study in homozygous extensive metabolizers of cytochrome P450 2C19 Clin Pharmacol Ther 79(1), 144-152 Tiêu Hóa 10 Nghiên cứu Y học Wroblewski LE, et al (2010) "Helicobacter pylori and gastric cancer: factors that modulate disease risk", Clinical microbiology reviews 23(4), 713-739 Ngày nhận báo: 20/11/2015 Ngày phản biện nhận xét báo: 30/11/2015 Ngày báo đăng: 15/02/2016 323 ... xanh lá, bệnh nhân mang kiểu gen dị hợp CYP3A4 *1B (GA) cho tín hiệu sóng đơi, bệnh nhân mang kiểu gen biến đổi CYP3A4 *1B Tiêu Hóa đồng hợp (GG) cho đỉnh sóng G màu đen Kết khảo sát 50 mẫu bệnh, ... ung thư dày biết rõ (10) Có khoảng 90% trường hợp viêm dày có diện vi khuẩn Hp Tương tự, tỷ lệ chiếm từ 75 - 85% bệnh loét dày; 95 - 100% bệnh loét tá tràng; biến chứng thủng loét dày tá tràng. .. liều lượnglà nguyên nhân chủ yếu Như đề cập trên, gen CYP3A4 có khoảng 23 biến thể ghi nhận, kiểu gen CYP3A4 *1B dạng phổ biến CYP3A4 *1B nằm vị trí -392 vùng promoter gen CYP3A4, dạng có đột biến