CYP11B1 và CYP11B2 là 2 enzyme tham gia lần lượt vào sự tổng hợp cortisol và aldosterone. CYP11B1 tham gia quá trình chuyển hóa 11-deoxycortisol tới cortisol còn CYP11B2 tham gia vào quá trình chuyển hóa 11-deoxycorticosterone tới aldosterone trong quá trình tổng hợp steroid ở người. Trong bài báo này, chúng tôi sử dụng các phương pháp nuôi cấy 2 dòng tế bào động vật (COS-1 và HCT116), biến nạp vector pSVL, pSVL+11B1, pSVL+11B2 vào tế bào động vật và biểu hiện đồng thời với bAdx / hAdx trong 2 dòng tế bào này. Steroid được tách chiết bằng chloroform và được phân tách bằng sắc ký lớp mỏng trên bản kính silica. Kết quả chúng tôi đã đánh giá được mức độ biểu hiện của CYP11Bs trong dòng tế bào người HCT116. Ảnh hưởng của chuỗi truyền điện tử bAdx tốt hơn chuỗi truyền điện tử hAdx trong hệ thống biểu hiện tế bào HCT116. Chính vì vậy, tế bào HCT116 có thể được sử dụng cho nghiên cứu chuyển hóa steroid bởi hai isozyme CYP11Bs.
TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 326-330 ĐÁNH GIÁ SỰ BIỂU HIỆN CỦA CYP11Bs TRONG DÒNG TẾ BÀO HCT116 Nguyễn Huy Hồng1,2, Rita Bernhardt2 (1) Viện Cơng nghệ sinh học, nhhoang@ibt.ac.vn (2) Đại học Tổng hợp Saarland, CHLB Đức TÓM TẮT: CYP11B1 CYP11B2 enzyme tham gia vào tổng hợp cortisol aldosterone CYP11B1 tham gia q trình chuyển hóa 11-deoxycortisol tới cortisol CYP11B2 tham gia vào q trình chuyển hóa 11-deoxycorticosterone tới aldosterone trình tổng hợp steroid người Trong báo này, sử dụng phương pháp nuôi cấy dòng tế bào động vật (COS-1 HCT116), biến nạp vector pSVL, pSVL+11B1, pSVL+11B2 vào tế bào động vật biểu đồng thời với bAdx / hAdx dòng tế bào Steroid tách chiết chloroform phân tách sắc ký lớp mỏng kính silica Kết chúng tơi đánh giá mức độ biểu CYP11Bs dòng tế bào người HCT116 Ảnh hưởng chuỗi truyền điện tử bAdx tốt chuỗi truyền điện tử hAdx hệ thống biểu tế bào HCT116 Chính vậy, tế bào HCT116 sử dụng cho nghiên cứu chuyển hóa steroid hai isozyme CYP11Bs Từ khóa: Adrenodoxin bò (bAdx), Adrenodoxin người (hAdx), CYP11B1, CYP11B2, tế bào COS-1, tế bào HCT116 MỞ ĐẦU Ở người, isozyme 11β-hydroxylase đáp ứng với tổng hợp cortisol aldosterone CYP11B1 (được đặt tên 11βhydroxylase, P450c11, P450XIB1) CYP11B2 (sinh tổng hợp aldosterone hay gọi tên P450aldo, P450c18, P450cmo P450XIB2) Hai isozyme thuộc nhóm enzyme cytochrome P450 nằm màng ty thể Mỗi enzyme tổng hợp 503 amino acid, chuyển lên màng ty thể loại bỏ peptide tín hiệu lại 479 amino acid [1] Hai enzyme CYP11B1 CYP11B2 có 93% trình tự protein giống [2] Mặc dù protein CYP11B1 CYP11B2 có độ tương đồng cao trọng lượng phân tử chúng lại khác nhau, 51 kDa 49 kDa chạy điện di SDSPAGE [3, 4] Isozyme CYP11B1 hydroxy hóa vị trí 11β 11-deoxycortisol để tạo thành cortisol [3], đồng thời chuyển hóa 11deoxycorticosterone tới corticosterone 18hydroxy-11-deoxycorticosterone q trình hydroxy hóa vị trí 18 corticosterone thấp CYP11B1 khơng thể chuyển hóa corticosterone đến aldosterone Ngược lại, CYP11B2 có hoạt tính 11β-hydroxylase yếu CYP11B1 lại hydroxyl hóa vị trí C-18 sau tiếp tục 18-hydroxy corticosterone tới aldosterone CYP11B2 326 chuyển hóa 11-deoxycortisol đến 18oxocortisol Phản ứng khơng có ý nghĩa in vivo khơng biểu vùng fasciculata, lại đóng vai trò quan trọng bệnh nhân có hội chứng glucocorticoid áp chế tăng aldosterone Giống P450 khác, CYP11B1 CYP11B2 cần oxy phân tử từ khử điện tử NADPH Điện tử truyền từ NADPH qua Adrenodoxin reductase Adrenodoxin để chuyển tới P450s, lúc P450s có khả xúc tác để khởi động q trình chuyển hóa chất thành sản phẩm tương ứng Trong nghiên cứu này, tiến hành đánh giá biểu protein CYP11B1 CYP11B2 dòng tế bào người HCT116 so sánh với dòng tế bào khỉ COS-1 có sử dụng chuỗi truyền điện tử Adrenodoxin (Adx) PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Dòng tế bào: Tế bào COS-1 dòng tế bào có nguồn gốc từ vỏ thượng thận khỉ mặt xanh châu Phi, dòng tế bào phù hợp cho biến nạp vector có biểu kháng nguyên SV40 T [5] Tế bào HCT116 tế bào bắt nguồn từ tế bào ung thư biểu mô ruột Các tế bào dương Nguyen Huy Hoang, Rita Bernhardt tính với keratin peroxidase nhuộm miễn dịch Vector: Vector pSVL thiết kế để biểu tế bào eukaryote pSVL+CYP11B2 vector thiết kế có chứa cDNA gen mã hóa tổng hợp aldosterone tác giả Kawamoto et al (1992) [6] với điểm đột biến vị trí 249, nơi mà Ser thay Arg [2] pSVL+CYP11B1 cấu trúc vector có chứa cDNA gen mã hóa 11-hydroxylase người Vector bAdx4 cấu trúc vector mang cDNA gen adrenodoxin bò điều khiển CMV [7] Vector hAdx cấu trúc vector mang cDNA gen adrenodoxin người điều khiển CMV Hóa chất: Mơi trường ni cấy tế bào gồm: pyruvate, glutamine, fetal bovine serum kháng sinh hãng Sigma 11-deoxycortisol (RSS), cortisol (F), 11-deoxycorticosterone (DOC), corticosterone (B), 18hydroxycorticosterone (18-OH-B), aldosterone (Aldo), [14C] 11-deoxycorticosterone [3H] 11-hydroxycortisol hãng DuPont NEN (Boston, Hoa Kỳ) Các dung mơi dùng cho sắc khí lớp mỏng số hóa chất thơng dụng mua từ hãng Merck Các hố chất thơng dụng sử dụng sản phẩm hãng New England Biolabs, Merck/BHD Chemicals (Đức), Sigma (Hoa Kỳ) Phương pháp Ni cấy tế bào Dòng tế bào COS-1 nuôi cấy 37°C 6% CO2 mơi trường DMEM có bổ sung 5% huyết bò (fetal bovine serum), 0,1 mg/ml streptomycin, 100 U/ml penicillin, mM pyruvate mM L-glutamine Dòng tế bào HCT116 nuôi đĩa 37°C 6% CO2 mơi trường McCoy’s có bổ sung 5% huyết bò, 0,1 mg/ml streptomycin, 100 U/ml penicillin Biến nạp vào tế bào động vật Các tế bào nuôi cấy tới mật độ khoảng × 105 tế bào/ đĩa từ 18-24 h, sau tế bào biến nạp với µg vector pSVL+CYP11B1/ pSVL+CYP11B2 µg vector biểu adrenodoxin bò Kit Effectene Transfection Reagent (Qiagen) Sau biến nạp, tế bào ủ tiếp 37ºC, 72 ml mơi trường có bổ sung 11deoxycortisol [3H]-11-deoxycortisol mơi trường có bổ sung 11-deoxycorticosterone [14C]-11-deoxycorticosterone Tách chiết steroid Steroid tách chiết lần từ dịch tế bào (800 µl) với chloroform sản phẩm steroid phân tích sắc ký lớp mỏng theo Nguyen et al (2008) [8] Các steroid phân tách kính silica so sánh với steroid chuẩn Hàm lượng steroid phân tích sau ngày phơi nhiễm máy phân tích hình ảnh (BAS-2500, Fuji Photo Film Co., Ltd) số liệu phân tích phần mềm TINA 20 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Các tế bào HCT116 biến nạp với vector pSVL+CYP11B2 ủ với chất DOC nồng độ khác (20 M, 10 M, M, M M) Sản phẩm chuyển hóa steroid từ DOC tới B, 18-OH-B Aldo so sánh với steroid chuẩn Kết hình cho thấy, sử dụng chất giảm dần từ 20 µM đến µM chuyển hóa chất lại tăng dần đạt mức độ chuyển hóa tối ưu µM thời gian ni tế bào 72 Kết cho thấy tương tác chất DOC µM với enzyme CYP11B2 phù hợp cho dòng tế bào HCT116 Hình Sắc ký lớp mỏng steroid tách từ tế bào HCT116 với nồng độ DOC khác Các tế bào biến nạp sau ủ với chất DOC (20 µM, 10 µM, µM, µM, µM) nCi [14C]-11-deoxycorticosterone Vị trí steroid đánh dấu sau: DOC, 11deoxycorticosterone; B, corticosterone; 18-OHB, 18-hydroxycorticosterone; Aldo, aldosterone 327 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 326-330 Ngoài ra, tế bào HCT116 biến nạp với vector pSVL+CYP11B1 ủ với chất 11β-deoxycortisol (RSS) nồng độ khác 60 M, 40 M, 20 M, 10 M M Kết điện di sắc ký lớp mỏng hình cho thấy nồng độ chất giảm dần từ 60 M tới M tỷ lệ nghịch với chuyển hóa chất tăng lên đạt nồng độ M Kết cho thấy tương tác enzyme CYP11B1 với M chất 11β-deoxycortisol phù hợp với thời gian ni cấy tế bào sau 72 Hình Sắc ký lớp mỏng steroid tế bào HCT116 với nồng độ 11β-deoxycortisol khác Các tế bào biến nạp sau ủ với chất 11β-deoxycortisol khác nhau: 60 µM, 40 µM, 20 µM, 10 µM, µM 0.6 µCi [ H]-RSS Vị trí steroid đánh dấu sau: RSS 11βdeoxycortisol; F Cortisol Hình Hoạt tính enzyme q trình sinh tổng hợp aldosterone biểu đồng thời với bovine adrenodoxin dòng tế bào HCT116 tế bào COS-1 Các thành phần steroid chuyển hóa DOC phân tích sắc ký lớp mỏng Các thí nghiệm tiến hành độc lập với giá trị trung bình SEM Lượng chất, chất trung gian B, 18-OH-B sản phẩm cuối Aldo biểu thị thành % hoạt tính xem hoạt tính tổng số enzyme (100%) Để tối ưu hóa q trình truyền điện tử hệ enzyme CYP11B2, vector pSVL+CYP11B2 biến nạp với vector bovine adrenodoxin 328 (bAdx) vector human adrenodoxin (hAdx) vào tế bào HCT116 Kết hình cho thấy, tỷ lệ phần trăm sản phẩm steroid đươc Nguyen Huy Hoang, Rita Bernhardt tách từ tế bào biến nạp với pSVL+CYP11B2 (WT) phAdx tăng 1,2 lần corticosterone (B), tăng 1,3 lần 18hydroxycorticosterone (18-OH-B) tăng khơng có ý nghĩa với aldosterone (Aldo) so với WT biểu riêng rẽ không với phAdx Khi thay phAdx pbAdx sản phẩm steroid tăng lên 2,9 lần B, 2,8 lần 18-OH-B 3,1 lần Aldo so với WT biểu đơn lẻ không với Adx Điều chứng tỏ, trình chuyển điện tử từ bAdx đến CYP11B2 tốt trình chuyển điện tử từ hAdx đến CYP11B2 Vì vậy, biểu đồng thời bAdx chứng minh làm tăng hoạt tính CYP11B2 người hệ thống tế bào HCT116, kết hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu biểu đồng thời với bAdx dòng tế bào COS-1 [9, 10] chuỗi truyền điện tử hAdx Khơng có khác biệt biểu CYP11Bs dòng tế bào HCT116 với dòng tế bào COS-1 Ngồi ra, chúng tơi so sánh hoạt tính enzyme CYP11B2 tế bào HCT116 COS-1 biểu đồng thời với bAdx Các đặc tính enzyme CYP11B2 thường nghiên cứu tế bào khỉ COS-1 tế bào COS-7 [11, 12] Mặc dù dòng tế bào COS phổ biến chưa phải dòng tế bào tối ưu cho biểu enzyme CYP11B người Ở biểu enzyme CYP11B người dòng tế bào người HCT116 có hiệu so với biểu dòng tế bào khỉ COS Chính vậy, chúng tơi lựa chọn sử dụng tế bào người HCT116 với ưu tế bào mọc nhanh dễ thao tác để so sánh với dòng tế bào khỉ COS-1 Kết cho thấy, tỷ lệ phần trăm sản phẩm steroid tế bào HCT116 giống với tỷ lệ phần trăm sản phẩm steroid tế bào COS-1 (hình 3) Điều có nghĩa thành phần sản phẩm khơng phụ thuộc vào dòng tế bào sử dụng Vì vậy, dòng tế bào ứng dụng cho nghiên cứu ảnh hưởng đột biến gen hydroxylase steroid người Curnow K M., Tusie-Luna M T., Pascoe L., Natarajan R., Gu J L., Nadler J L., White P C., 1991 The product of the CYP11B2 gene is required for aldosterone biosynthesis in the human adrenal cortex Mol Endocrinol., 5(10): 1513-22 KẾT LUẬN Okamura T., Kagimoto M., Simpson E R., Waterman M R., 1987 Multiple species of bovine adrenodoxin mRNA Occurrence of two different mitochondrial precursor sequences associated with the same mature sequence J Biol Chem., 262(21): 1033510338 CYP11B1 biểu tế bào HCT116 với chất RSS tối ưu M CYP11B2 biểu tế bào HCT116 với chất DOC tối ưu M Sự biểu CYP11Bs tế bào HCT116 sử dụng chuỗi truyền điện tử bAdx tốt sử dụng TÀI LIỆU THAM KHẢO Yanagibashi K., Haniu M., Shively J E., Shen W H., Hall P., 1986 The synthesis of aldosterone by the adrenal cortex Two zones (fasciculata and glomerulosa) possess one enzyme for 11 beta-, 18- hydroxylation, and aldehyde synthesis, J Biol Chem., 261(8): 3556-62 Mornet E., Dupont J., Vitek A., White P C., 1989 Characterization of two genes encoding human steroid 11 betahydroxylase (P-450(11) beta) J Biol Chem., 264(35): 20961-7 Ogishima T., Shibata H., Shimada H., Mitani F., Suzuki H., Saruta T., Ishimura Y., 1991 Aldosterone synthase cytochrome P-450 expressed in the adrenals of patients with primary aldosteronism, J Biol Chem., 266(17): 10731-4 Gluzman Y., 1981 SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants Cell, 23(1): 175-182 Kawamoto T., Mitsuuchi Y., Toda K., Yokoyama Y., Miyahara K., Miura S., Ohnishi T., Ichikawa Y., Nakao K., Imura H., 1992 Role of steroid 11 betahydroxylase and steroid 18-hydroxylase in the biosynthesis of glucocorticoids and mineralocorticoids in humans Proc Natl Acad Sci USA, 89(4): 1458-1462 329 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 326-330 Nguyen H H., Hannemann F., Hartmann M F Wudy S A., Bernhardt R., 2008 Aldosterone synthase deficiency caused by a homozygous L451F mutation in the CYP11B2 gene Mol Genet Metab., 93(4): 458-67 Bottner B., Denner K., Bernhardt R., 1998 Conferring aldosterone synthesis to human CYP11B1 by replacing key amino acid residues with CYP11B2-specific ones, Eur J Biochem., 252(3): 458-466 10 Cao P R., Bernhardt R., 1999 Interaction of CYP11B1 (cytochrome P-45011 beta) with CYP11A1 (cytochrome P-450scc) in COS-1 cells Eur J Biochem., 262(3): 720-726 11 Dunlop F M., Crock P A., Montalto J., Funder J W., Curnow K M., 2003 A compound heterozygote case of type II aldosterone synthase deficiency J Clin Endocrinol Metab., 88(6): 2518-2526 12 Nomoto S., Massa G., Mitani F., Ishimura Y., Miyahara K., Toda K., Nagano I., Yamashiro T., Ogoshi S., Fukata J., Onishi S., Hashimoto K., Doi Y., Imura H., Shizuta Y., 1997 CMO I deficiency caused by a point mutation in exon of the human CYP11B2 gene encoding steroid 18hydroxylase (P450C18) Biochem Biophys Res Commun., 234(2): 382-385 EVALUATION OF CYP11Bs EXPRESSION IN HCT116 CELLS Nguyen Huy Hoang1,2, Rita Bernhardt2 (1) Institute of Biotechnology, VAST Saarland University, Germany (2) SUMMARY CYP11B1 and CYP11B2 are enzymes respectlively responsible for cortisol and aldosterone biosynthesis In human steroid biosynthesis, CYP11B1 converts 11-deoxycortisol to cortisol and CYP11B2 converts 11deoxycorticosterone to aldosterone In this study, we utilized methods cell culture (COS-1 and HCT116), transfection of vector pSVL, pSVL+11B1, pSVL+11B2 and coexpression of bAdx/hAdx into cell culture Steroids were extracted by using chloroform and separated on high performance thin layer chromatography (HPTLC) on silica plate Results showed evaluation of CYP11Bs in HCT116 cells The effect of electron transport protein of bovin adrenodoxin was better than electron transport protein of human adrenodoxin in HCT116 cells Therefore, HCT116 cell could be used to study the metabolism of steroids by isozyme CYP11Bs Keywords: Bovin Adrenodoxin (bAdx); COS-1 cell; CYP11B1; CYP11B2; HCT116 cell; Human Adrenodoxin (hAdx) Ngày nhận bài: 21-6-2012 330 ... nghiên cứu tế bào khỉ COS-1 tế bào COS-7 [11, 12] Mặc dù dòng tế bào COS phổ biến chưa phải dòng tế bào tối ưu cho biểu enzyme CYP11B người Ở biểu enzyme CYP11B người dòng tế bào người HCT116 có... Biol Chem., 262(21): 1033510338 CYP11B1 biểu tế bào HCT116 với chất RSS tối ưu M CYP11B2 biểu tế bào HCT116 với chất DOC tối ưu M Sự biểu CYP11Bs tế bào HCT116 sử dụng chuỗi truyền điện tử bAdx... điện tử hAdx Khơng có khác biệt biểu CYP11Bs dòng tế bào HCT116 với dòng tế bào COS-1 Ngồi ra, chúng tơi so sánh hoạt tính enzyme CYP11B2 tế bào HCT116 COS-1 biểu đồng thời với bAdx Các đặc tính