Biểu hiện của các dấu ấn tế bào gốc ung thư trong ung thư tế bào gan trên hóa mô miễn dịch

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - VƯƠNG QUANG GIANG BIỂU HIỆN CỦA CÁC DẤU ẤN TẾ BÀO GỐC UNG THƯ TRONG UNG THƯ TẾ BÀO GAN TRÊN HĨA MƠ MIỄN DỊCH LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VƯƠNG QUANG GIANG BIỂU HIỆN CỦA CÁC DẤU ẤN TẾ BÀO GỐC UNG THƯ TRONG UNG THƯ TẾ BÀO GAN TRÊN HĨA MƠ MIỄN DỊCH Chuyên ngành: XÉT NGHIỆM Y HỌC Mã số: 60720333 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS.BS.VÕ THỊ NGỌC DIỄM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2017 ii LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các tài liệu trích dẫn, số liệu kết luận văn hoàn toàn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả luận văn VƯƠNG QUANG GIANG iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ VIỆT – ANH vii DANH MỤC CÁC HÌNH ix DANH MỤC CÁC BẢNG xi DANH MỤC SƠ ĐỒ xii ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan ung thư tế bào gan 1.2 Bệnh học ung thư tế bào gan 1.2.1 Đặc điểm đại thể 1.2.2 Đặc điểm vi thể - Phân độ mô học theo WHO 2010 1.3 Lý thuyết tế bào gốc ung thư 10 1.4 Phương pháp xác định tế bào gốc ung thư 11 1.5 Tế bào gốc ung thư gan 12 1.5.1 Các dấu ấn tế bào gốc ung thư gan 13 1.5.2 Các nghiên cứu có liên quan 18 1.6 Hóa mơ miễn dịch 19 1.6.1 Ngun tắc phương pháp hóa mơ miễn dịch 19 1.6.2 Các kỹ thuật hóa mơ miễn dịch 21 1.6.3 Kỹ thuật nhuộm hóa mơ miễn dịch 23 1.6.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết nhuộm HMMD 26 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Thiết kế nghiên cứu 28 2.2 Đối tượng nghiên cứu 28 2.3 Tiêu chuẩn chọn mẫu 28 2.4 Tiêu chuẩn loại trừ 28 2.5 Cỡ mẫu 28 iv 2.6 Phương pháp chọn mẫu 29 2.7 Tiến hành nghiên cứu 29 2.7.1 Ghi nhận thông tin lâm sàng mô bệnh học 29 2.7.2 Nơi thực 30 2.7.3 Quy trình nhuộm hóa mơ miễn dịch 30 2.8 Đánh giá kết nhuộm HMMD 33 2.9 Xử lý số liệu 34 2.10 Vấ n đề y đức nghiên cứu 35 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 36 3.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 36 3.1.1 Đặc điểm phân bố bệnh nhân theo giới 36 3.1.2 Đặc điểm phân bố bệnh nhân theo tuổi 36 3.2 Tối ưu kháng thể 37 3.3 Đặc điểm mô học lỗi kỹ thuật ảnh hưởng đến hóa mơ miễn dịch 42 3.3.1 Hình thái tế bào 42 3.3.2 Khả bắt màu DAB sau nhuộm HMMD 45 3.3.3 Đặc điểm kỹ thuật khác 50 3.4 Phân độ biệt hóa UTTBG theo WHO 2010 50 3.5 Biểu EpCAM, CK19, CD44 UTTBG 52 3.5.1 Biểu EpCAM UTTBG 52 3.5.2 Biểu CK19 UTTBG 55 3.5.3 Biểu CD44 UTTBG 57 3.6 Mối liên quan độ biệt hóa biểu EpCAM, CK19, CD44 UTTBG 60 3.6.1 Liên quan độ biệt hóa biểu EpCAM 60 3.6.2 Liên quan độ biệt hóa biểu CK19 61 3.6.3 Liên quan độ biệt hóa biểu CD44 61 3.7 Đồng biểu EpCAM, CK19 CD44 UTTBG 62 3.7.1 Đồng biểu EpCAM CK19 UTTBG 62 3.7.2 Đồng biểu EpCAM CD44 UTTBG 63 3.7.3 Đồng biểu CK19 CD44 UTTBG 64 v 3.7.4 Đồng biểu EpCAM, CK19 CD44 UTTBG 65 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 66 4.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 66 4.1.1 Đặc điểm phân bố bệnh nhân theo giới 66 4.1.2 Đặc điểm phân bố bệnh nhân theo tuổi 66 4.2 Chuẩn hóa quy trình nhuộm hóa mơ miễn dịch 67 4.2.1 Cố định bệnh phẩm 68 4.2.2 Sấy khô tiêu 73 4.2.3 Tối ưu kháng thể 74 4.3 Phân độ biệt hóa UTTBG theo WHO 2010 76 4.4 Biểu EpCAM, CK19, CD44 UTTBG 77 4.4.1 Biểu EpCAM UTTBG 77 4.4.2 Biểu CK19 UTTBG 78 4.4.3 Biểu CD44 UTTBG 80 4.5 Mối liên quan độ biệt hóa biểu EpCAM, CK19, CD44 UTTBG 82 4.5.1 Liên quan độ biệt hóa biểu EpCAM 82 4.5.2 Liên quan độ biệt hóa biểu CK19 84 4.5.3 Liên quan độ biệt hóa biểu CD44 86 4.6 Đồng biểu EpCAM, CK19 CD44 UTTBG 87 4.6.1 Đồng biểu EpCAM CK19 UTTBG 87 4.6.2 Đồng biểu EpCAM CD44 UTTBG 89 4.6.3 Đồng biểu CK19 CD44 UTTBG 89 4.6.4 Đồng biểu EpCAM, CK19 CD44 UTTBG 90 KẾT LUẬN 91 KIẾN NGHỊ 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO ……………………………………………………….a PHỤ LỤC ……………………………………………………………………… i vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFP : Alpha-feto protein CSCs : Cancer sterm cells CD : Cluster of differentiation CK19 : Cytokeratin 19 CLSI : Clinical and Laboratory Standards Institute DAB : 3, 3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride EpCAM : Epithelial cell adhesion molecule FFPE : Formalin-fixed, paraffin-embedded HBV : Hepatitis B virus HCV : Hepatitis C virus HMMD : Hoá mô miễn dịch HE : Hematoxylin – Eosin HPCs : Hepatic progenitor cells ICC : Intrahepatic cholangiocarcinoma KN : Kháng nguyên KT : Kháng thể NBF : Neutral Buffered Formalin UTTBG : Ung thư tế bào gan UK NEQAS : The UK National External Quality Assessment Scheme for Immunocytochemistry and In-Situ Hybridisation vii DANH MỤC ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ VIỆT – ANH TIẾNG VIỆT TIẾNG ANH Biệt hóa rõ well-differentiated Biệt hóa vừa moderately-differentiated Biệt hóa poorly-differentiated Biệt hóa ngược de-differentiation Bào tương thối hóa cell cytoplasm disruption Bào tương giới hạn không rõ cell membranes not sharply defined Bắt màu không uneven staining Bắt màu không đặc hiệu non-specific staining Bóng khí/bọt nước air bubbles/water bubbles Cố định Fixation Chuyển đúc Processing Cắt mỏng Microtomy Chứng dương positive control Các khối vơ định hình bắt màu thuốc nhuộm ngồi tế bào đích amorphous masses of detection color appear outside the target cells Dạng bè trabecular variant Dạng đặc compact variant Dạng giả tuyến pseudoglandular variant Độ mô học histological grade Formalin đệm trung tính neutral buffered formalin Hóa mơ miễn dịch immunohistochemistry Kháng ngun Antigen Kháng thể Antibody Khơng biệt hóa undifferentiated Khơng bắt màu bắt màu yếu no staining or weak staining Lát cắt bị mờ sau dán lam phủ tissue section appears hazy Lam phủ Coverslip viii TIẾNG VIỆT TIẾNG ANH Nội chứng internal control Mô cố định formalin, vùi nến formalin-fixed, paraffin-embedded Màu tương phản/bắt màu đặc hiệu counterstain/antibody specific staining Mảnh mơ có vùng màu trắng đục, khơng bắt màu bắt màu nhạt Mảnh mơ có vùng bị bong tróc không đầy đủ mô Nhân chất nhiễm sắc thối hóa areas of the tissue appear as opaque white, no color or weak staining tissue detachment or incomplete tissue section nuclei loss of chromatin or nuclei complete disappearance Nhân bong bóng nuclei bubbly Nhân đơng vón nuclei pyknotic Nhân mờ lem nhem nuclei muddy or smudgy Nhuộm background staining Nếp gấp, nếp nhăn wrinkles, folds Nhiễm loại mô khác contamination from other tissue source Phân tử kết dính tế bào biểu mơ epithelial cell adhesion molecule Rách mô tears in tissue Sắc tố mô pigments in tissue Tế bào gốc ung thư cancer sterm cells Tự làm self-renewal Tế bào gốc gan hepatic sterm cells Tế bào đầu dòng gan hepatic progenitor cells Tế bào co lại có khoảng trống quanh tế bào cell shrinkage and artifactual spaces around cell Ung thư tế bào gan/carcinôm tế bào gan hepatocellular carcinoma Ung thư tế bào ống mật intrahepatic cholangiocarcinoma Viêm gan siêu vi B hepatitis B virus Viêm gan siêu vi C hepatitis C virus Vết xước, vết trầy Scratches ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Đại thể UTTBG dạng ổ, với nốt vệ tinh Hình 1.2: Đại thể UTTBG dạng nhiều nốt rải rác khắp mơ gan Hình 1.3: Đại thể UTTBG dạng lan tỏa xơ gan Hình 1.4: Vi thể UTTBG biệt hóa rõ, dạng bè, dạng giả tuyến Hình 1.5: Vi thể UTTBG biệt hóa vừa (trái) rõ (phải), dạng bè Hình 1.6: Vi thể UTTBG biệt hóa vừa Hình 1.7: Vi thể UTTBG biệt hóa Hình 1.8: Vi thể UTTBG khơng biệt hóa 10 Hình 1.9: Sơ đồ trị liệu ung thư dựa mục tiêu tế bào gốc ung thư (CSC) 11 Hình 1.10: Mơ hình sinh u tế bào gốc ung thư gan UTTBG 13 Hình 1.11: Cấu trúc kháng thể 20 Hình 1.12: Phương pháp đánh dấu trùng hợp hai bước 23 Hình 2.1: Đọc kết nhuộm EpCAM 34 Hình 2.2: Đọc kết nhuộm CK19 34 Hình 3.1: Chứng dương EpCAM bắt màu dương mạnh, không nhuộm 38 Hình 3.2: Nội chứng EpCAM bắt màu dương nhạt, khơng 38 Hình 3.3: Chứng dương CK19 bắt màu dương mạnh, không nhuộm 39 Hình 3.4: Nội chứng CK19 bắt màu dương mạnh, khơng nhuộm 39 Hình 3.5: Chứng dương CD44 bắt màu dương mạnh, không nhuộm 40 Hình 3.6: Nội chứng CD44 bắt màu dương mạnh, khơng nhuộm 40 Hình 3.7: Chứng dương EpCAM bắt màu dương mạnh, nhuộm 41 Hình 3.8: Tiêu mô bệnh nhuộm nền, EpCAM ủ 24 phút 41 Hình 3.9: Nhân chất nhiễm sắc (HEx400) 43 Hình 3.10: Nhân bong bóng (HEx400) 43 Hình 3.11: Tế bào co lại, nhân đơng vón (HEx400) 44 Hình 3.12: Tế bào thối hóa: nhân NSC, nhân mờ, bào tương thối hóa 44 Hình 3.13: Nhân mờ, lem nhem, giới hạn khơng rõ (HEx400) 45 Hình 3.14: Sắc tố mô (HEx200) 45 Hình 3.15: Nội chứng (tế bào ống mật) bắt màu đậm (EpCAMx400) 47 Hình 3.16: Nhuộm nền, bắt màu không đặc hiệu (EpCAMx400) 47 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM g Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor testing in breast cancer" Journal of clinical oncology, 25 (1), 118-145 76 Wu Pui-Chee, Fang JW, Lau VK, Lai Ching-Lung, Lo Chi-Kin, Lau JY (1996), "Classification of hepatocellular carcinoma according to hepatocellular and biliary differentiation markers Clinical and biological implications" The American journal of pathology, 149 (4), 1167 77 Yamashita Taro, Budhu Anuradha, Forgues Marshonna, Wang Xin Wei (2007), "Activation of Hepatic Stem Cell Marker EpCAM by Wnt–βCatenin Signaling in Hepatocellular Carcinoma" Cancer Research, 67 (22), 10831-10839 78 Yamashita Taro, Forgues Marshonna, Wang Wei, Kim Jin Woo, Ye Qinghai, Jia Huliang, Budhu Anuradha, Zanetti Krista A, Chen Yidong, Qin LunXiu (2008), "EpCAM and α-fetoprotein expression defines novel prognostic subtypes of hepatocellular carcinoma" Cancer research, 68 (5), 1451-1461 79 Yamashita Taro, Ji Junfang, Budhu Anuradha, Forgues Marshonna, Yang Wen, Wang Hong–Yang, Jia Huliang, Ye Qinghai, Qin Lun–Xiu, Wauthier Elaine (2009), "EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features" Gastroenterology, 136 (3), 1012-1024 e4 80 Yang Guo-Huan, Fan Jia, Xu Yang, Qiu Shuang-Jian, Yang Xin-Rong, Shi Guo-Ming, Wu Bing, Dai Zhi, Liu Yin-Kun, Tang Zhao-You (2008), "Osteopontin combined with CD44, a novel prognostic biomarker for patients with hepatocellular carcinoma undergoing curative resection" The oncologist, 13 (11), 1155-1165 81 Yang Zhen Fan, Ho David W, Ng Michael N, Lau Chi Keung, Yu Wan Ching, Ngai Patricia, Chu Patrick WK, Lam Chi Tat, Poon Ronnie TP, Fan Sheung Tat (2008), "Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer" Cancer cell, 13 (2), 153-166 82 Yang Zhen Fan, Ngai Patricia, Ho David W, Yu Wan Ching, Ng Michael NP, Lau Chi Keung, Li Mandy LY, Tam Ka Ho, Lam Chi Tat, Poon Ronnie TP (2008), "Identification of local and circulating cancer stem cells in human liver cancer" Hepatology, 47 (3), 919-928 83 Yin Shengyong, Li Jinjun, Hu Chen, Chen Xinhua, Yao Ming, Yan Mingxia, Jiang Guoping, Ge Chao, Xie Haiyang, Wan Dafang (2007), "CD133 positive hepatocellular carcinoma cells possess high capacity for tumorigenicity" International journal of cancer, 120 (7), 1444-1450 84 Yoon Seung Kew (2012), "The biology of cancer stem cells and its clinical implication in hepatocellular carcinoma" Gut Liver, (1), 29-40 85 Yoshikawa Seiichi, Zen Yoh, Fujii Takahiko, Sato Yasunori, Ohta Tetsuo, Aoyagi Yutaka, Nakanuma Yasuni (2009), "Characterization of CD133+ parenchymal cells in the liver: Histology and culture" World Journal of Gastroenterology: WJG, 15 (39), 4896 86 Zhao Qihong, Zhou Heng, Liu Qifei, Cao Ye, Wang Gang, Hu Anla, Ruan Liang, Wang Sufang, Bo Qingli, Chen Wenjun (2016), "Prognostic value Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM h of the expression of cancer stem cell-related markers CD133 and CD44 in hepatocellular carcinoma: From patients to patient-derived tumor xenograft models" Oncotarget, (30), 47431 87 Zhu Zheng, Hao Xiangfang, Yan Mingxia, Yao Ming, Ge Chao, Gu Jianren, Li Jinjun (2010), "Cancer stem/progenitor cells are highly enriched in CD133+ CD44+ population in hepatocellular carcinoma" International Journal of Cancer, 126 (9), 2067-2078 88 El-Serag H B (2011), "Hepatocellular carcinoma" N Engl J Med, 365 (12), 1118-27 89 El-Serag H B., Rudolph K L (2007), "Hepatocellular carcinoma: epidemiology and molecular carcinogenesis" Gastroenterology, 132 (7), 2557-76 90 Ferlay J., Soerjomataram I., Dikshit R., Eser S., Mathers C., Rebelo M., Parkin D M., Forman D., Bray F (2015), "Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012" Int J Cancer, 136 (5), E359-86 91 Tong C M., Ma S., Guan X Y (2011), "Biology of hepatic cancer stem cells" J Gastroenterol Hepatol, 26 (8), 1229-37 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM i PHỤ LỤC 1: BẢNG KIỂM ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ SAU NHUỘM HMMD A TIÊU CHÍ CHÍNH HÌNH THÁI TẾ BÀO Điểm* 1.1 Nhân A.1.1.a Nhân chất nhiễm sắc thối hóa A.1.1.b Nhân bong bóng A.1.1.c Nhân đơng vón A.1.1.d Nhân mờ lem nhem 1.2 Bào tương A.1.2.a Bào tương thoái hóa A.1.2.b Tế bào co lại có khoảng trống quanh tế bào A.1.2.c Bào tương giới hạn không rõ 1.3 Các thành phần khác tế bào A.1.3.a Điểm* Điểm* Có sắc tố mơ KHẢ NĂNG BẮT MÀU DAB 2.1 Nội chứng/chứng dương A.2.1.a Không bắt màu bắt màu yếu A.2.1.b Bắt màu không A.2.1.c Bắt màu không đặc hiệu A.2.1.d Màu tương phản đậm che lấp vị trí bắt màu đặc hiệu A.2.1.e Có khối vơ định hình bắt màu thuốc nhuộm ngồi tế bào đích A.2.1.f Nhuộm Tn thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Điểm** Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM j Điểm** 2.2 Mô bệnh A.2.2.a Bắt màu không đặc hiệu A.2.2.b Màu tương phản đậm che lấp vị trí bắt màu đặc hiệu A.2.2.c Có khối vơ định hình bắt màu thuốc nhuộm ngồi tế bào đích A.2.2.d Nhuộm Điểm* 2.3 Mảnh mô chứng/mô bệnh A.2.3.a Mảnh mơ có vùng màu trắng đục, vùng khơng bắt màu bắt màu nhạt A.2.3.b Mảnh mơ có vùng bị bong tróc khơng đầy đủ mơ TỔNG ĐIỂM ❖ QUY ƯỚC TÍNH ĐIỂM [71]: (*) Tỷ lệ phát lỗi: điểm: ≥ 75% điểm: 50 – < 75% điểm: 25 – < 50% điểm: – < 25% (**) Cường độ bắt màu lỗi (trừ tiêu chí A.2.1.a): điểm: bắt màu mạnh điểm: bắt màu vừa điểm: bắt màu yếu điểm: không bắt màu (***) Cường độ bắt màu lỗi tiêu chí A.2.1.a: điểm: khơng bắt màu điểm: bắt màu yếu điểm: bắt màu vừa điểm: khơng bắt mạnh Tn thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM k B TIÊU CHÍ PHỤ LÁT MƠ B.1.a Lát cắt có nếp gấp, nếp nhăn B.1.b Lát cắt bị rách B.1.c Lát cắt có vết xước, vết trầy B.1.d Lát cắt khơng B.1.e Lát cắt có bóng khí B.1.f Lát cắt nhiễm loại mơ khác DÁN LAM PHỦ B.2.a Lát cắt bị mờ sau dán lam phủ B.2.b Lam kính có bọt khí/ bọt nước lam phủ B.2.c Lam kính có tượng co rút dung dịch dán lam phủ B.2.d Lam kính có dung dịch dán dính vào mặt lam phủ GIẢI THÍCH Ý NGHĨA CỦA BẢNG KIỂM I TỔNG QUAN: Bảng kiểm xây dựng dựa y văn giới thực nghiệm quy trình nhuộm EpCAM, CK19 CD44 Mã số tiêu chí đánh giá nhằm đối chiếu với nguyên nhân cách khắc phục tương ứng phụ lục Các thuật ngữ sử dụng bảng kiểm diễn đạt y văn quốc tế kỹ thuật chuyên ngành giải phẫu bệnh thích danh mục đối chiếu thuật ngữ Việt – Anh II MỤC TIÊU: Chuẩn hóa bước giai đoạn quy trình nhuộm HMMD để đạt kết HMMD ổn định tin cậy Hướng đến việc kiểm định đảm bảo chất lượng kỹ thuật nhuộm HMMD Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM l III NỘI DUNG: Bảng kiểm gồm phần: Tiêu chí chính: gồm tiêu chí đánh giá hình thái tế bào dựa tiêu nhuộm HE 12 tiêu chí đánh giá khả bắt màu DAB tiêu nhuộm HMMD Tiêu chí phụ: gồm 10 tiêu chí đánh giá tiêu nhuộm HMMD IV ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ: Quy ước tính điểm đánh giá kết bảng kiểm dựa cách tính điểm đánh giá UK NEQAS kết hợp với thực nghiệm quy trình nhuộm EpCAM, CK19 CD44 nghiên cứu Đánh giá kết dựa tổng điểm tiêu chí Các tiêu chí phụ cần đánh giá nhằm hoàn kỹ thuật nhuộm HMMD phục vụ công tác giảng dạy nghiên cứu THANG ĐIỂM ĐÁNH GIÁ Tiêu đánh giá Tổng điểm Rất tốt 50 – 60 Tốt 40 – 49 Đánh giá 30 – 39 < 30 Tiêu chí A.1.1.a: điểm, Khơng thể đánh giá được, cần thực lại Tiêu chí A.1.2.a: điểm, Tiêu chí A.2.1.a: điểm V TÀI LIỆU THAM KHẢO [8], [10], [15], [19], [21], [43], [71] Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM m PHỤ LỤC 2: NGUYÊN NHÂN ẢNH HƯỞNG ĐẾN KẾT QUẢ NHUỘM HMMD VÀ CÁCH KHẮC PHỤC [8], [10], [15] LỖI DO CỐ ĐỊNH Tiêu chí (*) Nguyên nhân A.1.1.a  Cố định chậm trễ Cách khắc phục  Cố định bệnh phẩm lấy khỏi thể trước 30 phút A.1.1.b  Cố định khơng hồn tồn: + Bệnh phẩm kích thước to,  Bệnh phẩm u đặc, to cần xẻ A.1.1.c dày thành lát dày 1-2 cm trước + Thể tích dung dịch khơng cố định A.1.1.d đủ so với lượng mô  Mô cắt lọc dày không mm A.1.2.a + Cố định khơng đủ thời gian  Đảm bảo thể tích dung dịch  Nồng độ, pH dung dịch cố cố định gấp 15 – 20 lần thể tích A.1.2.b định không đảm bảo bệnh phẩm A.1.2.c  Loại dung dịch cố định  Thời gian cố định từ – 48  Sử dụng dung dịch cố định Formalin 10%, dung dịch đệm muối phosphate, pH = 7,2 – 7,4 A.1.3.a  Dung dịch formalin có pH <  Sử dụng dung dịch cố định 5,5 Formalin 10%, dung dịch đệm muối phosphate, pH = 7,2 – 7,4  Mơ có nhiều máu, chất hoại  Loại bỏ sắc tố trước nhuộm tử, sắc tố, … LỖI DO CHUYỂN ĐÚC A.1.1.c  Khử nước mức  Giảm thời gian khử nước A.1.2.b  Quy trình chuyển đúc mơ sinh  Mẫu sinh thiết nên có quy trình thiết với mẫu mơ lớn chuyển đúc riêng để giảm thời gian xử lý cồn chất làm  Nhiệt độ paraffin cao sáng  Nhiệt độ nên cao nhiệt độ nóng chảy paraffin từ – độ C A.1.1.d  Khử nước chưa hết  Đảm bảo thời gian khử nước  Còn chất cố định/chất làm  Đảm bảo cồn cuối cồn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM n A.1.2.c sáng mơ tuyệt đối  Ngấm paraffin khơng hồn  Thay dung dịch khử nước, chất toàn làm sáng paraffin định kỳ LỖI DO NHUỘM A.2.1.a  Cố định bệnh phẩm chậm trễ  Kiểm sốt q trình cố định bệnh phẩm cách  Cố định bệnh phẩm khơng  Sử dụng quy trình bộc lộ kháng hồn toàn nguyên mạnh để bộc lộ  Cố định bệnh phẩm lâu kháng nguyên đích  Bộc lộ kháng nguyên yếu A.2.1.b  Cố định bệnh phẩm không  Kiểm sốt q trình cố định hồn tồn bệnh phẩm cách  Kháng thể khuếch tán không  Bảo trì định kỳ thiết bị tự động A.2.1.c  Cố định bệnh phẩm chậm trễ  Kiểm sốt q trình cố định cố định khơng hồn tồn bệnh phẩm cách A.2.1.f  Mơ có nhiều chất hoại tử  Ức chế peroxidase, biotin nội sinh A.2.2.a  Có peroxidase, biotin nội sinh  Sử dụng quy trình bộc lộ kháng A.2.2.d  Bộc lộ kháng nguyên mức nguyên mạnh  Kháng thể khơng tinh  Sử dụng kháng thể đơn dịng, tinh  Giảm thời gian nhuộm màu  Thời gian nhuộm màu tương tương phản phản lâu A.2.2.b  Giảm nồng độ thuốc nhuộm màu  Nồng độ thuốc nhuộm màu tương phản tương phản cao  Cắt lát cắt mỏng hơn, từ –  Lát cắt mơ q dày µm A.2.1.d A.2.1.e  Mơ có nhiều chất hoại tử, sắc  Loại bỏ sắc tố trước nhuộm tố  Bảo quản thuốc thử kháng thể A.2.2.c  Thuốc thử, kháng thể có chứa theo hướng dẫn nhà sản xuất tạp chất bị nhiễm khuẩn  Tránh lát cắt mô bị nếp gấp, có  Chất thị màu đọng lại bóng khí mơ lam kính  Sử dụng lam kính có độ bám dính cao (chất bám dính tích điện dương) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM o A.2.3.a  Khử paraffin không hồn tồn  Đảm bào lát mơ phải tiếp xúc hồn tồn với dung dịch khử  Lát cắt mơ rộng, dung paraffin dịch khử paraffin không phủ  Bảo trì định kỳ thiết bị tự hết lát cắt động theo hướng dẫn nhà sản xuất A.2.3.b  Mơ cố định có nhiều  Kiểm sốt q trình cố định chất hoại tử bệnh phẩm cách  Không loại bỏ  Loại bỏ lát mô lát mô lam kính cách để nghiêng lam kính, tuân thủ nhiệt độ thời gian  Bám dính lát mơ sấy khơ lam kính lam kính  Sử dụng lam kính có độ bám  Bộc kháng nguyên dính cao (chất bám dính mức tích điện dương)  Sử dụng quy trình bộc lộ kháng nguyên phù hợp cho loại mô LỖI DO CẮT MỎNG B.1.a  Căng mô chưa hết bể  Căng mô nhẹ nhàng làm thẳng nếp gấp dàn lát cắt mô  Nhiệt độ nước căng mô không  Điều chỉnh nhiệt độ nước căng mơ để tối ưu hóa độ mềm phù hợp paraffin lát cắt  Mơ khơng bám dính chặt lên  Sử dụng lam kính có chất bám lam kính dính tốt lam kính có tích điện dương B.1.b  Xử lý mơ khơng hồn tồn  Căng mô mức  Nhiệt độ nước căng mô cao  Lưỡi dao cắt mỏng không sắc bén  Đảm bảo quy trình xử lý mơ  Căng mô nhẹ nhàng làm thẳng nếp gấp  Nhiệt độ nước bể dàn lát cắt nên thấp nhiệt độ nóng chảy paraffin từ – 100C  Sử dụng lưỡi dao sắc bén B.1.c  Trong mơ có thành phần cứng  Khử canxi mơ (mơ canxi hóa, tinh thể, kẹp,  Loại bỏ thành phần lạ Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM p khâu, …) B.1.d mô  Có tạp chất paraffin  Vùi lại mơ paraffin  Lưỡi dao cắt mỏng bị mẻ  Thay lưỡi dao cắt vị trí khác dao  Độ nghiêng lưỡi dao (góc  Không sử dụng lát cắt cắt) thấp cao cuối dải cắt  Tốc độ cắt mỏng nhanh  Điều chỉnh góc cắt lưỡi dao cho phù hợp  Mơ cứng khử nước  Giảm tốc độ cắt mỏng mức  Paraffin mềm  Giảm thời gian khử nước  Lưỡi dao khối paraffin  Sử dụng paraffin có nhiệt độ tan khơng cố định chặt chảy phù hợp  Các phận máy cắt bị  Đảm bảo lưỡi dao khối mịn, bảo trì khơng đúng, hiệu paraffin cố định chặt chuẩn không quy cách  Kiểm tra bảo trì máy cắt định kỳ theo hướng dẫn nhà sản xuất  Hiệu chuẩn máy quy cách B.1.e  Bóng khí bị nhốt lát cắt  Khuấy nước bồn nước mô vớt lên lam kính từ bồn căng mơ để tất bóng khí nước căng mơ ngồi trước thả lát cắt vào  Vớt nghiêng từ từ lát cắt mơ từ bể dàn lên lam kính B.1.f  Mơ từ lát cắt trước lưu  Làm bể dàn lát cắt mô lại bể dàn lát cắt mô cách dùng khăn giấy hớt ngang qua bề mặt bồn nước thay  Mô bị nhiễm lúc cắt lọc nước trước cắt khối lúc vùi mơ paraffin khác  Khơng gói kỹ mơ vụn trước  Rửa dụng cụ cắt lọc đặt vào cassette dụng cụ vùi mô trước qua ca khác  Gói mơ vụn trước đặt vào cassette LỖI DO DÁN LAM PHỦ B.2.a  Lát mô không khử nước  Đảm bảo lọ cồn cuối cồn tốt sau bước nhuộm tương phản tuyệt đối Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM q B.2.b  Thao tác dán lam phủ không  Thực thao tác dán lam phủ, tránh có bọt khí  Tiêu khơng làm khô  Đảm bảo tiêu khô trước trước dán lam phủ dán lam phủ B.2.c  Dung dịch dán lam phủ  Đảm bảo dung dịch dán lam phủ vừa đủ, khơng q  Dung dịch dán lam phủ  Thay dung dịch dán lam phủ lỏng, dễ co rút B.2.d  Thao tác dán lam phủ không  Thực thao tác dán lam phủ  Dung dịch dán lam phủ  Đảm bảo dung dịch dán lam phủ nhiều vừa đủ, không nhiều (*) Mã số tương ứng với tiêu chí phụ lục Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM r PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ NHUỘM HMMD VÀ CÁCH KHẮC PHỤC TRONG TỐI ƯU KHÁNG THỂ [43] Khả bắt màu/nhuộm Bắt màu mạnh/không nhuộm Cách khắc phục - Đạt độ pha loãng kháng thể cho kết tối ưu - Giảm nồng độ kháng thể - Giảm thời gian ủ kháng thể Bắt màu mạnh/nhuộm yếu - Giảm thời gian ủ kháng thể thứ - Tăng ức chế peroxidase biotin nội sinh - Giảm nồng độ kháng thể - Giảm thời gian ủ kháng thể - Giảm thời gian ủ kháng thể thứ Bắt màu mạnh/ nhuộm mạnh - Tăng ức chế peroxidase biotin nội sinh - Sử dụng phương pháp bộc lộ kháng nguyên khác - Tăng nồng độ kháng thể - Tăng thời gian ủ kháng thể - Tăng thời gian ủ kháng thể thứ Bắt màu yếu/không nhuộm - Sử dụng hệ thống phát tín hiệu có độ nhạy cao - Sử dụng phương pháp bộc lộ kháng nguyên khác - Tăng nồng độ kháng thể giảm thời gian ủ Bắt màu yếu/nhuộm yếu - Tăng ức chế peroxidase biotin nội sinh - Tăng thời gian ủ kháng thể thứ Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM s - Sử dụng hệ thống phát tín hiệu có độ nhạy cao - Sử dụng phương pháp bộc lộ kháng nguyên khác - Sử dụng kháng thể khác - Tăng ức chế peroxidase biotin nội sinh - Sử dụng hệ thống phát tín hiệu có Bắt màu yếu/nhuộm mạnh độ nhạy cao - Sử dụng phương pháp bộc lộ kháng nguyên khác - Sử dụng kháng thể khác - Kiểm tra bước quy trình nhuộm Không bắt màu/không nhuộm Không bắt màu/nhuộm yếu - Tăng nồng độ thời gian ủ kháng thể - Sử dụng phương pháp bộc lộ kháng nguyên khác - Sử dụng hệ thống phát tín hiệu có độ nhạy cao - Sử dụng kháng thể khác - Kiểm tra bước quy trình nhuộm - Sử dụng phương pháp bộc lộ kháng Không bắt màu/nhuộm mạnh nguyên khác - Sử dụng hệ thống phát tín hiệu có độ nhạy cao - Sử dụng kháng thể khác Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM t PHỤ LỤC 5: PHIẾU THU THẬP SỐ LIỆU Thời điểm phẫu thuật Thời điểm lấy mẫu Mã sô GPB Họ tên bệnh nhân Tuổi Giới Chẩn đốn lâm sàng Chẩn đốn hình ảnh Chẩn đốn đại thể Kích thước u Vị trí (nếu có) Vi thể Số lát cắt khảo sát Diện tích Chứng dương Chứng âm EpCAM Cường độ Tỉ lệ Mức độ Chứng dương Chứng âm CD44 Cường độ Tỉ lệ Mức độ Chứng dương Chứng âm CK19 Cường độ Tỉ lệ Mức độ Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM u Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... bào gốc ung thư gan ung thư tế bào gan lý sau: - EpCAM dấu ấn biểu sớm tế bào gốc ung thư gan [35] - CK19 dấu ấn biểu đặc tính biệt hóa kém, xâm lấn, di tế bào gốc ung thư gan [22] - CD44 dấu ấn. .. dụng dấu ấn bề mặt tế bào đặc hiệu để biểu rõ tế bào gốc ung thư gan UTTBG [30] Mặc dù kiểu biểu dấu ấn tế bào gốc ung thư gan khơng đồng có nguồn gốc tế bào khác tế bào gan biệt hóa ngược, tế bào. .. độ biểu dấu ấn tế bào gốc ung thư: EpCAM, CK19, CD44 ung thư tế bào gan theo phân độ biệt hóa WHO 2010 Xác định tỷ lệ đồng biểu dấu ấn tế bào gốc ung thư: EpCAM, CK19, CD44 ung thư tế bào gan