Bài viết tập trung nghiên cứu tạo tấm tế bào màng ối người đông khô (freeze-dried) và xác định biểu hiện một số dấu ấn của tế bào trong tấm tế bào màng ối người đông khô tạo được. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 7-2012 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ XÁC ĐỊNH BIỂU HIỆN MỘT SỐ DẤU ẤN CỦA TẾ BÀO GỐC TRONG MÀNG ỐI NGƢỜI ĐÔNG KHÔ Đỗ Minh Trung*; Trần Hải Anh*; Nguyễn Bảo Trân* Toshio Nikaido**; Phm Vn Trõn*** TểM TT Mng ối biết đến với nhiều hữu ích công nghệ mô khả ứng dụng cấy ghép Màng ối đóng vai trò màng sinh học giúp làm giảm đau đáng kể vết thương bỏng nhê khả bám dính, che phủ bề mặt vết thương nhanh làm lành vết thương Mục tiêu: tạo tế bào màng ối đơng khơ khơng độc, co giãn, đàn hồi theo nhiệt độ người, dễ sử dụng vật liệu thích hợp che phủ điều trị vết thương bỏng Màng ối sau thu thập xử lý làm sạch, đơng khơ, đóng gói khử trùng chiếu xạ., Đánh giá đặc tính sinh học, đặc điểm hình thái tế bào màng ối tạo xác định biểu số dấu ấn tế bào gốc (TBG) Oct4, vimentin, collagen týp I, Ck5, desmin kỹ thuật hóa mơ miễn dịch (HMMD) Kết cho thấy, tế bào màng ối người đơng khơ giữ đặc tính sinh học * Từ khóa: Màng ối người; Màng ối người đơng khô; Tế bào gốc PRODUCTION AND CHARACTERIZATION THE EXPRESSION OF STEM CELL MARKERS IN FREEZE-DRIED HUMAN AMNIOTIC MEMBRANE SUMMARY Human amniotic membranes are known to be useful in many tissues engineering as well as applied in transplantation Amniotic membrane as a biological membrane can significantly reduce pain in the burn wounds due to its ability adhesion, surface coverage and wound healing The aim of this study was to produce freeze-dried human amniotic membrane which is non-toxic, elastic and easy to use as dressing material in burn wounds treatment After collecting, the fresh membrance was cleaned, freeze-dried, packaged and sterilized and then irradiatedly sterilized The product was evaluated on biological and morphological characteristics and tested for expression of some stem cells markers (including Oct4, vimentin, collagen type I, Ck5, desmin) by immunohistochemistry techniques The results showed that the freeze-dried human amniotic membranes retained its main biological features with the expression of Oct4, vimetin, collagen type I, Ck5, desmin * Key words: Human amniotic membrane; Freeze-dried human amniotic membrane; Stem cells * Học viện Quân y ** Trường Đại học Toyama - Nhật Bản *** Bệnh viện 103 Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: PGS TS Nguyễn Gia Tiến TS.Nguyễn Đặng Dũng 30 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ S 7-2012 đặT VấN đề chuyờn gia nghiờn cu v TBG từ Trường Đại học Toyama (Nhật Bản), tiến Công nghệ mô (Tissue engineering - TE) hành nghiên cứu tạo tế bào màng ối phát triển việc sử dụng vật người đông khô (freeze-dried) xác định liệu sinh học thay nhằm khôi phục, biểu số dấu ấn tế bào trì cải thiện chức mơ Màng ối tế bào màng ối người đông khô tạo được Davis sử dụng lần cho cấy ghép da vào năm 1910 Kể từ đó, màng ối sử dụng rộng rãi vật liệu sinh học hữu ích việc kiểm sốt vết bỏng, vết thương da loét mạn tính chân Màng ối xem nguồn cung cấp mô hay tế bào phù hợp cấy ghép dựa hiệu chống viêm tính sinh miễn dịch thấp (Hao CS, 2005) Ghép ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu 30 mẫu màng ối sản phụ mổ đẻ, bảo đảm tiêu chuẩn xét nghiệm sàng lọc âm tính với HIV, HBV, HCV, giang mai Màng ối thu thập, bảo quản đảm bảo vô trùng chuyển trung tâm nghiên cứu màng ối sử dụng thành công Phƣơng pháp nghiên cứu bệnh nhân bị dị tật biểu mơ khó lành * Chuẩn bị màng ối: không đáp ứng với điều trị y khoa Đối với vài tháng không Nhau thai thu nhận sau ca mổ đẻ đặt vào bình bảo quản vơ trùng có chứa PBS mơi trường RPMI-1640 lạnh, vận chuyển trung tâm nghiên cứu điều kiện nhiệt độ lạnh khoảng 4ºC Tiến hành bóc tách màng ối phòng sạch, thời gian khơng kể từ thu thập thuận tiện vận chuyển, bảo quản * Tạo tế bào màng ối người đông khô: sử dụng Hiện nay, tế bào màng ối Cắt màng ối thành miếng, nhanh chóng hạ lạnh bảo quản nhiệt độ âm sâu từ -50oC đến -80oC Sau đó, đưa màng ối vào thiết bị đông khô; kết thúc trình đơng khơ, đóng gói bảo quản, đưa đến sở chiếu xạ; kết thúc trình chiếu xạ, kiểm tra độ vô trùng, xác định marker thông số khác tế bào màng ối đông khô tạo yếu tố sinh miễn dịch, dấu hiệu lâm sàng thải ghép cấp tính khơng thấy ghép màng ối người tình nguyện Màng ối tươi bảo quản -80°C để sử dụng cho cấy ghép, người đông khô ứng dụng điều trị lâm sàng Nhật Bản số nước phát triển khác So sánh với màng ối tươi, màng ối đông khô gần không thay đổi cấu trúc, chức dễ xử lý điều trị tổn thương có kích thước khác Màng ối người đông khô ứng dụng điều trị, mang lại kết tốt cho bệnh nhân Được hỗ trợ kỹ thuật * Xét nghiệm HMMD: 31 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 7-2012 Mẫu màng ối sau đúc parafin cắt mỏng, dán lên lam kính, làm khô 45oC Khử parafin xylen cồn 10 phút Ức chế peroxydase nội bào hydrogen peroxide 0,03% 20 phút Ủ với kháng thể đơn clon kháng collagen týp I, desmin, Oct3/4, Ck5, Ck18, vimentin rửa tiêu PBS Ủ với kháng thể thứ hai có gắn biotin Ủ với phức hợp streptavidine peroxydase 20 phút Hiển thị màu với chất DAB Rửa tiêu với nước cất Nhuộm với hematoxylin tạo tương phản phút rửa tiêu với nước cất Khử nước cồn xylen Dán lamen quan sát, chụp lưu lại hình ảnh kính hiển vi Kết sau nhuộm HMMD: âm tính: có màu xanh tím hematoxylin nhuộm nhân; dương tính: có diện kháng nguyên tế bào; phức hợp kháng nguyên - kháng thể streptavidine màu cho màu vàng nâu (màu DAB) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết chế tạo tế bào màng ối đông khô 30 mẫu màng ối đông khô chế tạo, đóng gói, chiếu xạ, kiểm tra vơ khuẩn, độ ẩm làm tiêu nhuộm HE Kết cho thấy, màng ối đơng khơ âm tính với vi khuẩn nấm tổng số Nhuộm HE, kiểm tra màng ối đông khô thấy, màng ối khô giữ cấu trúc, nhẹ, mỏng dễ xử lý sử dụng Hình 1: Hình ảnh tế bào màng ối người đơng khơ: 32 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 7-2012 A: Tấm tế bào màng ối người đông khô; B: Tấm tế bào sau ngâm vào nước muối sinh lý phút; C: Nhuộm HE; D: Nhuộm HE (tiêu cắt ngang) Kết xác định biểu số dÊu Ên cđa TBG biĨu m« màng èi b»ng kü thuËt HMMD Xác định TBG biểu mô kỹ thuật HMMD với dấu ấn TBG biểu mô Kết cho thấy, tế bào biểu dương tính với dấu ấn TBG Oct4, Sox2, SSEA4 dấu ấn tế bào biểu mô vimentin, Ck18; biểu âm tính với desmin Hình 2: Biểu dấu ấn Oct4, vimentin, Ck5, collagen týp I, desmin tế bào màng ối người đông khô xác định kỹ thuật HMMD Màng ối mơ có nguồn gốc bào thai cấu tạo màng chính: màng biểu mơ đơn, màng dày màng vô mạch Màng ối màng sinh học ứng dụng nhiều cấy ghép, muốn sử dụng được, màng ối cần phải 32 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 7-2012 thu thập, xử lý, bảo quản đảm bảo vô trùng tất giai đoạn Ngân hàng Mô châu Âu, Ngân hàng Mô Hoa Kỳ FDA thiết lập tiêu chuẩn với việc trì đặc tính sinh học mô giảm thiểu nguy lây truyền tác nhân gây nhiễm Ngồi áp dụng tiêu chí để sàng lọc lựa chọn, kết mẫu xét nghiệm phải âm tính để đảm bảo tối thiểu nguy lây truyền bệnh truyền nhiễm, số xét nghiệm vi sinh thực hiện, mẫu thử phải âm tính với vi khuẩn nấm tổng số Đối với mẫu màng ối đơng khơ chúng tơi tạo được: màng ối bị nhiễm hệ sinh vật âm đạo ca sinh nở bình thường, đó, cần tuyển chọn mẫu từ sản phụ mổ đẻ, sinh một, đủ tháng, bảo đảm tiêu chuẩn xét nghiệm sàng lọc âm tính với HIV, HBV, HCV, giang mai Màng ối sau đơng khơ đóng gói, chiếu xạ, kiểm tra vơ trùng xét nghiệm vi sinh, kết cho âm tính với vi khuẩn nấm tổng số Kết sau nhuộm HE cho thấy, cấu trúc màng ối không thay đổi so với màng ối tươi Như vậy, phương pháp đông khô làm cho tinh thể nước thăng hoa chuyển thành thể khí Phương pháp giúp màng tế bào trì kích thước hình dạng tế bào ban đầu Màng ối đơng khơ sử dụng cách ngâm nước muối sinh lý - phút (hình 2B), màng ối suốt giữ đặc tính đàn hồi, co giãn Màng ối có nhiều đặc điểm khả thích hợp để sử dụng kỹ thuật mơ Các lớp biểu mô màng ối bao gồm tế bào có đặc tính TBG Theo mơ tả, tế bào biểu dấu ấn TBG vạn tiềm (pluripotent) biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác Tế bào biểu mô màng ối nguồn cung cấp tế bào sử dụng công nghệ mô Màng ối giá đỡ (scaffold) có thành phần collagen, fibronectin, laminin proteoglycans khác, thành phần quan trọng cho tế bào tăng trưởng Màng ối tươi người chứng minh xem nguồn cung cấp mô hay tế bào phù hợp cấy ghép dựa hiệu chống viêm tính sinh miễn dịch thấp (Hao CS, 2005; Niknejad H CS, 2008) [7] Màng ối người băng sinh học, sử dụng nhiều thập kỷ qua với tiện ích đặc tính mong muốn ứng dụng điều trị bệnh giác mạc tổn thương bỏng Sử dụng màng ối tươi gặp khó khăn vận chuyển lưu trữ, trước số phương pháp sử dụng để bảo quản đông lạnh nhiệt độ thấp bảo quản glycerol nhiệt độ âm sâu, lưu trữ vài tháng đòi hỏi nhiều thiết bị đắt tiền, cồng kềnh tủ lạnh nhiệt độ thấp Màng ối đơng khơ tạo khắc phục nhược điểm Để đảm bảo vô trùng an toàn cho sử dụng, việc khử trùng quan trọng Tuy nhiên, liệu màng ối đông khô khử trùng chiếu xạ có giữ đặc điểm sinh học hay không? Trong khuôn khổ nghiên cứu này, sử dụng kỹ thuật HMMD để xác định biểu số dấu ấn màng ối đông khô với dấu ấn Ck5, vimentin, collagen týp I, Oct3/4, desmin Màng ối tế bào màng ối người thường biểu dấu ấn biểu bì Ca125 dấu ấn biểu mô phổ biến cytokeratin biểu dương tính với dấu ấn desmin, vimentin (Toda A CS, 2007) [1] Nghiên cứu Ilancheran S CS (2007) [5], tế bào biểu mô màng ối người biểu dấu ấn TBG Oct4 (octamer binding protein 4), NANOG, SOX2 (SRY-related HMG-box gene 2) REX-1 (Silvia Dı´azPrado CS, 2011; Parolini CS, 2009; Miki CS, 2007, 2005, Toda CS, 2007) 33 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 7-2012 [1, 3, 4] Kết hình cho thấy dấu ấn Ck5, vimentin, collagen týp I biểu dương tính mạnh, Oct 3/4 dương tính yếu hơn, dấu ấn desmin cho kết âm tính Kết phù hợp với nhiều nghiên cứu giả khác giới đặc điểm màng ối màng ối đông khô Như vậy, màng ối sau đông khô, chiếu xạ khử trùng, giữ đặc tính sinh học lý học Màng ối đông khô tạo nhẹ, dễ dàng vận chuyển bảo quản Kết bước đầu mở hướng tạo nguồn vật liệu sinh học cho lĩnh vực cấy ghép mô tương lai KẾT LUẬN Đã tạo tế bào màng ối người đông khô, tế bào sau chiếu xạ đảm bảo độ vô trùng có biểu dương tính với số dấu ấn vimentin, collagen týp I, Ck5, Oct4 TÀI LIỆU THAM KHẢO Ayaka Toda, Motonori Okabe, Toshiko Yoshida, Toshio Nikaido The potential of amniotic membrane/amnion-derived cells for regeneration of various tissues J Pharmacol Sci 2007, 105, pp.215-228 Kiyotaka Kitagawa, Shuichiro Yanagisawa, Kazuhiko Watanabe, Tatsuya Yunoki, Atsushi Hayashi, Motonori Okabe, Toshio Nikaido A hyperdry amniotic membrane patch using a tissue adhesive for corneal perforations and bleb leaks American Journal of Ophthalmology 2009, 148 (3), pp.383-389 Toshio Miki, Keitaro Mitamura, Mark A Ross, Donna B Stolz, Stephen C Strom Identification of stem cell marker-positive cells by immunofluorescence in term human amnion Journal of Reproductive Immunology 2007, 75, pp.91-96 Silvia Dı´az-Prado, EmmaMuinos-Lo´pez, TamaraHermida-Go´mez, ClaudiaCicione, M EstherRendal-Va´zquez, IsaacFuentes-Boquete, Francisco J De Toro, Francisco J Blanco Human amniotic membrane as an alternative source of stem cells for regenerative medicine Differentiation 2011, 1, pp.162-171 Ilancheran S, Michalska A, Peh G, Wallace EM, Pera M, Manuelpillai U Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differ-entiation potential Biol Reprod 2007, 77, pp.577-588 Parolini O, Soncini M, Evangelista M, Schmidt D Amniotic membrane and amniotic fluid-derived cells: potential tools for regeneative medicine Regen Med 2007, 4, pp.275-291 Niknejad H, Peirovi H, Jorjani M Ahmadiani A, Ghanavi J, Seifalian AM Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering Eur Cell Mater 2008, 15, pp.88-99 Insausti CL, Blanquer M, Bleda P, Iniesta P, Majado MJ, Castellanos G, Moraleda JM The amniotic membrane as a source of stem cells Histol Histo-pathol 2010, 25, pp 91-98 Haochuan Li, Jerry Y Niederkorn, Sudha Neelam, Elizabeth Mayhew, R Ann Word, James P McCulley, Hassan Alizadeh Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells IOVS 2005, 46 (3) 10 G Saraswathy, SE Noorjahan, S Chinni Krishnan, Ganga Adhakrishnan, TP Sastry Preparation of hydrogels using human amniotic membrane and their characteration Trends Biomater Artif Organs 2004, 17 (2), pp.31-36 Ngày nhận bài: 16/5/2012 Ngày giao phản biện: 26/7/2012 Ngày giao thảo in: 31/8/2012 34 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 7-2012 35 ... việc sử dụng vật người đông khô (freeze-dried) xác định liệu sinh học thay nhằm khôi phục, biểu số dấu ấn tế bào trì cải thiện chức mơ Màng ối tế bào màng ối người đông khô tạo được Davis sử dụng... 2: Biểu dấu ấn Oct4, vimentin, Ck5, collagen týp I, desmin tế bào màng ối người đông khô xác định kỹ thuật HMMD Màng ối mơ có nguồn gốc bào thai cấu tạo màng chính: màng biểu mô đơn, màng dày màng. .. không? Trong khuôn khổ nghiên cứu này, sử dụng kỹ thuật HMMD để xác định biểu số dấu ấn màng ối đông khô với dấu ấn Ck5, vimentin, collagen týp I, Oct3/4, desmin Màng ối tế bào màng ối người thường