Bài viết trình bày ảnh hưởng của nồng độ Glycerol, thời gian xử lý đến tỷ lệ sống của tuyến trùng; khả năng sống của tuyến trùng sau bảo quản đông lạnh; độc lực của IJs sau bảo quản lạnh.
29(4): 13-18 Tạp chí Sinh học 12-2007 ảNH HƯởNG CủA NåNG §é GLYCEROL §ÕN Tû LƯ SèNG CđA TUỸN TRïNG TRONG BảO QUảN ĐÔNG LạNH BằNG NITƠ LỏNG NGUYễN NGọC CHÂU Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật RALF-UDO EHLERS Viện Bệnh học thực vật, Đại học tổng hợp Kiel, CHLB Đức Nhóm tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (epn) giống Steinernema Heterorhabditis đa dạng với 50 loài loài có nhiều chủng khác với đặc trng sinh học khả phòng trừ sâu hại chúng khác Việc bảo quản chủng tuyến trùng epn có ý nghÜa lín viƯc cung cÊp ngn vËt liƯu ban đầu cho sản xuất thuốc sinh học tuyến trùng Ngoài ra, việc bảo quản chủng epn phục vụ cho việc nghiên cứu, tuyển chọn theo phơng pháp cổ điển kỹ thuật chuyển gien để tạo nên chủng có khả phòng trừ sâu hại tốt Tuy nhiên, vài nghiên cứu cho thấy, việc trì chủng epn phơng pháp nhân nuôi nhiều lần tuyến trùng epn ấu trùng bớm sáp lớn (Galleria mellonella) làm làm giảm độc lực chúng dẫn đến giảm khả phòng trừ sâu hại [13, 15, 17] Vì vậy, việc lựa chọn cải thiện phơng pháp bảo quản chủng epn tự nhiên nh nguồn vật liệu di truyền epn có ý nghĩa định Bảo quản đông lạnh epn nitơ lỏng đợc coi nh lựa chọn đắn để bảo quản lâu dài epn mà giữ đợc độc lực chúng [17] Tuy nhiên, việc bảo quản đông lạnh tuyến trùng epn nitơ lỏng hoàn toàn không đơn giản, tỷ lệ sống sót độc lực tuyến trùng sau bảo quản khác nhau, phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nh nguồn gốc chủng epn, quy trình xử lý epn dung dich bảo vệ đông lạnh trớc đa vào đông lạnh, quy trình điều chỉnh độ làm lạnh nh nồng độ epn quy trình tan đông [8, 16] Đã có số nghiên cứu cải tiến quy trình bảo quản đông lạnh epn nitơ lỏng cho kết tốt với mức độ sống sót cao độc tố hầu nh đợc trì sau bảo quản lạnh [1, 3, 8] Tuy nhiên, hầu hết nghiên cứu đợc tiến hành chủng epn có nguồn gốc từ vùng ôn đới, thông tin với tuyến trùng epn từ vùng nhiệt đới hầu nh cha có Mục tiêu nghiên cứu xác định ảnh hởng nồng độ glycerol trình xử lý bảo quản lạnh hiệu sống sót chủng tuyến trùng epn phân lập từ Việt Nam, nơi có điều kiện khí hậu nhiệt đới cận nhiệt đới I PHƯƠNG PH¸P NGHI£N CøU Ngn tun trïng epn sư dơng cho thí nghiệm chủng tuyến trùng địa Steinernema Heterorhabditis phân lập từ Việt Nam, bao gồm 38 chủng, có 26 chủng Steinernema 12 chủng Heterorhabditis Các chủng đợc thu thập từ năm 1997 đến 2002 trải qua nhiều lần nhân nuôi trì ấu trùng bớm sáp lớn trớc sử dụng cho thí nghiệm bảo quản đông lạnh nitơ lỏng Tuyến trùng đợc nhân nuôi in vivo ấu trùng bớm sáp lớn ấu trùng cảm nhiễm (IJs) đợc bảo quản 12oC theo quy trình Kaya & Stock (1997) Thí nghiệm đánh giá ảnh hởng cđa nång ®é Glycerol ®Õn sù sèng sãt cđa tun trùng: đợc tiến hành theo mô tả Curran cs (1992): 100 ml dung dịch chứa IJs đợc lọc qua giấy lọc Whatman No1 máy hút chân không để loại bỏ nớc IJs nằm giấy lọc đợc nhúng vào đĩa petri (đờng kính 60 mm) chứa dung dịch 15% 30% glycerol ringer tỷ lệ 1: cho chủng đại diện Steinernema DL23 13 Heterorhabditis BY Sau 48 vµ 72 giê lÊy ml dung dịch tuyến trùng pha loãng 100 lần chuyển sang khay đếm để kiểm tra số lợng tuyến trïng IJs sèng vµ chÕt d−íi kÝnh hiĨn vi soi Thử nghiệm xác định sống sót tuyến trùng sau bảo quản đông lạnh: sở thí nghiệm đợc tiến hành theo quy trình Curran vµ cs (1992) vµ Nurgent vµ cs (1996) cho thÊy nồng độ glycerol theo quy trình cao không phù hợp với chủng epn nhiệt đới, cải tiến giảm nồng độ glycerol 10% chủng Steinernema 7,5% glycerol Heterorhabditis Các khâu xử lý tuyến trùng epn đợc tiến hành theo quy trình Curran cs (1992) vµ Nurgent vµ cs (1996) Sau 72 giê ngâm ủ chủng Steinernema 168 chủng Heterorhabditis epn đợc lọc qua máy hút chân không, sau cho vào methanol 70% đợc làm lạnh (khoảng -10oC) 10 phút, sau epn đợc lọc qua máy hút chân không tiếp tục đợc giội rửa methanol 70% đợc làm lạnh Giấy lọc chứa IJs đợc cuộn lại đặt vào ống týp chuyên dụng cho bảo quản đông lạnh Các týp đợc làm lạnh sẵn -5oC dung dịch muối NaCl Các ống týp đợc ghi số, tên chủng xếp hộp chuyên dụng để giữ lạnh đặt nhanh hộp vào bình nitơ lỏng Sau 72 bảo quản lạnh, đa hộp từ bình nitơ lỏng ra, lấy nhanh ống týp chứa epn làm tan lạnh cách ®ỉ 1,5 ml dung dÞch ringer (chn bÞ dung dÞch ringer theo Kaya & Stock, 1997, nh−ng sư dơng NaHCO3 thay cho NaH2CO5) vµo èng týp cã chøa epn, 30 phút nhiệt độ phòng, sau đổ nhanh dung dịch ringer có chứa tuyến trùng đĩa petri để kiĨm tra d−íi kÝnh hiĨn vi soi nỉi Tun trïng sống đợc xác định sở chúng chuyển động chạm kim nhọn vào chúng Tỷ lệ sống tối u thí nghiệm sơ đợc xác định số trung bình (mean) cộng trừ sai số chuẩn (sd) Thử nghiệm xác đinh độc lực IJs sau bảo quản đông lạnh: đợc tiến hành để xác định độc lực epn sau bảo quản lạnh Mỗi thử nghiệm sử dụng 10 ấu trùng bớm sáp lớn (Galleria mellonella = GM) đặt ®Üa petri ®−êng kÝnh 60 mm cã s½n giÊy läc cho gây 14 nhiễm 150 IJs ml nớc (khoảng 15 IJs/sâu) Thí nghiệm đợc lập lại lần công thức thí nghiệm toàn thí nghiệm đợc lập lại lần Nhiệt độ thí nghiệm 25oC Tỷ lệ sâu chết đợc kiểm tra qua 24, 48 vµ 72 giê sau nhiƠm epn Thống kê số liệu: kết thí nghiệm đợc so sánh theo ANOVA Student - Newman Keuls test (SAS Institute, Inc, Cary, NC) Tû lƯ s©u chÕt tõ thử nghiệm độc lực epn đợc phân tích với t-test II KếT QUả Và THảO LUậN ảnh hởng nồng độ glycerol Kết thí nghiệm ban đầu nồng độ glycerol 15% 30% chủng epn đại diện cho giống Steinernema DL23 Heterorhabditid BY cho thấy nồng độ glycerol thời gian xử lý tuyến trùng (thêi gian đ) glycerol cã ¶nh h−ëng râ rƯt ®Õn tû lƯ sèng cđa tun trïng Trong u tố nồng độ glycerol có ảnh hởng rõ rƯt nhÊt ë cïng thêi gian xư lý sau 48 giờ, công thức xử lý nồng độ glycerol 20 30% tỷ lệ tuyến trùng Steinernema DL23 giảm 46 đến 75% so với nồng độ 10%, tơng tự Heterorhabditid BY tỷ lệ sống nồng độ 15 30% giảm từ 43 đến 64% so với tỷ lệ nồng độ 7,5% (bảng 1) So víi thÝ nghiƯm cđa Curran vµ cs (1992), Nugent cs (1996) Popiel & Vasquez (2002) kết thí nghiệm tiến hành tuyến trùng Việt Nam nh khác biệt: thí nghiệm tác giả sử dụng nồng độ 15 30% cho kết tốt với tỷ lệ sống hầu hết chủng tuyến trùng tỷ lệ sống trung bình cao (58% Steinernema 51% Heterorhabditis), trong thí nghiệm chủng tuyến trùng địa nồng độ tơng đơng sau 72 tỷ lệ sống epn dới 50% Kết thấp so với kết tác giả Trong thí nghiệm với nồng độ glycerol thấp lại cho kết tơng đối tốt, đặc biệt tỷ lƯ sèng cđa chđng Steinernema DL23 cao tíi 85-91%, tû lƯ nµy ë chđng Heterorhabditis BY sau 48 cao (gần 94%), nhng sau 72 giảm xuống đột ngột 44,1% Bảng ảnh hởng nồng ®é glycerol vµ thêi gian xư lý ®Õn tû lƯ sèng cña tuyÕn trïng Steinernema DL23 Heterorhabditis BY Thêi gian XL Nång ®é XL 10% 20% 30% 7,5% 15% 30% Sau 48 giê 58,6 ± 34,2 ± 4,2 91,5 ± 2,6 49,8 ± 3,4 24,5 ± 2,4 93,9 ± 5,7 Sau 72 giê 85,7 ± 2,0 36,4 ± 2,9 18,8 ± 3,1 44,1 ± 13,4 26,3 ± 3,7 16,6 2,7 Từ kết thí nghiệm cho phép điều chỉnh giảm nồng độ glycerol xuống thấp tối u 10% chủng Steinernema 7,5% chủng Heterorhabditis để xử lý tuyến trùng trớc bảo quản đông lạnh Quan sát tuyền trïng IJs qua xư lý GlycerolRinger cho thÊy hÇu hÕt tuyến trùng epn chết trình xử lý tác dụng chất glycerol tạo thành dạng tinh thể nội bào thể tuyến trùng, theo Curran vµ cs (1992) vµ Popiel & Vasquez (2002) chất Glycerol chất làm giảm thiểu hình thành tinh thể nội bào Nh vậy, vấn đề nồng độ Glycerol nồng độ tuyến trùng trình xử lý đóng vai trò việc tạo thành tinh thể nội bào thể tuyến trùng Về chất, dung dịch GlycerolRinger có tác dụng giúp tuyến trùng chuyển dần sang trạng thái đông lạnh mà không bị tổn thơng môi trờng nớc đông lạnh tạo Vì vậy, tinh thể nội bào hình thành thể tuyến trïng nhiỊu hay Ýt chÝnh lµ biĨu hiƯn cho thÊy mức độ tuyến trùng có tổn thơng nhiều hay tuyến trùng tồn đợc hay không Khả sống tuyến trùng sau bảo quản đông lạnh Tổng số 38 chủng epn Việt Nam đợc xử lý để bảo quản động lạnh nitơ lỏng có chủng sống sót sau bảo quản đông lạnh, có chủng S-TS2, S-TX1, HCP6, H-CP16 vµ H-MP11 cã tû lƯ sèng sãt cao tõ 70-95%, tû lƯ sèng cđa chủng S-TG10 S-XT thấp dời 50% (bảng 2) Nh vËy, cã tíi 29 chđng kh«ng thĨ sèng sãt sau bảo quản đông lạnh, số có 22 chđng Steinernema lµ S-BM12, S-CP13, S-CP14, S-DL13, S-DL21, S-DL23, S-HS2, S-NH7, S-TD16, S-BC, S-CP12, S-DL9, S-DL14, S-DL16, S-DL20, S-MP9 S-MP9, S-TK10, S-TN10, S-TN24, S-TN53 S-TS10 Có 12 chủng Heterorhabditis không sống sót sau bảo quản đông lạnh lµ H-BB9, H-BY, H-CP8, H-HS5, H-NT3, H-QB3, H-TN48 vµ H-PP6 Điều đáng lu ý tất chủng có tỷ lệ sống sót cao sau khâu xử lý ngâm ủ dung dịch Glycerol - Ringer tức trớc đa vào xử lý đông lạnh nitơ lỏng Nh khẳng định khâu xử lý đông lạnh nitơ lỏng khâu tan đông có ảnh hởng quan trọng đến khả sống sót chủng tuyến trùng Vấn đề điều kiện xử lý số chủng có khả sống sót, thËm chÝ sèng víi tû lƯ kh¸ cao, nhiều chủng lại không sống đợc sau đông lạnh Để tìm câu trả lời cho vấn đề cần tiếp tục thử nghiệm nhằm làm sáng tỏ số yếu tố ảnh hởng đến khả sống sót epn, có yếu tố nồng độ epn tan đông Ngoài ra, để xác định điều kiện bảo quản tối u cần tiến hành riêng rẽ cho chủng nhóm chủng epn có đặc điểm sinh học, phân bố địa lý gần nh Bảng STT Tû lƯ sèng cđa c¸c tun trùng epn sau đông lạnh EPN isolates Nồng độ glycerol (%) Tỷ lệ sống sau đông lạnh (%) S-TG10 10 ± 1,8 S-XT 10 45,9 ± 3,9 S-TS2 10 70,4 ± 3,7 S-TX1 10 95,0 ± 3,2 H-CP6 7,5 81,5 ± 4,5 H-CP16 7,5 95,0 ± 3,3 H-MP11 7,5 95,2 ± 4,5 15 §éc lùc cđa IJs sau bảo quản lạnh Trong số chủng epn sống sót qua bảo quản đông lạnh đợc sử dụng để xác định độc tố chúng ấu trùng ngài sáp G mellonella cho thấy chủng trì đợc độc tố sau đông lạnh Tỷ lệ chết ấu trùng ngài sáp lớn sau 72 phơi nhiễm với IJs (nồng độ 150 IJs/ml) cao (bảng 2) Đặc biệt, kết thử nghiệm so sánh nguồn IJs qua đông lạnh nguồn IJs không qua đông lạnh cho thấy sai khác rõ ràng độc lực chủng epn thí nghiệm với IJs qua bảo quản lạnh IJs đối chứng (không qua bảo quản lạnh) Bảng Tỷ lệ chết GM gây nhiễm chủng epn sau bảo quản đông lạnh nitơ lỏng STT EPN isolates Nång ®é IJs/ml S-TS2 150 S-TX1 150 S-XT 150 H-CP6 150 H-CP16 150 H-MP11 150 Tû lƯ chÕt cđa GM 24 giê 48 giê 72 giê 36,4 ± 60,2 ± 76,4 ± 2,8 3,3 2,8 35,1 ± 65,4 ± 85,0 ± 3,0 3,5 4,1 29,7 ± 65,0 ± 78,5 ± 2,4 2,7 3,2 30,3 ± 51,9 ± 82,5 ± 2,5 3,8 2,5 29,7 ± 62,1 ± 75,9 ± 3,6 3,3 2,7 25,9 ± 65,2 ± 85,8 ± 3,7 5,5 3,6 Th¶o luËn Các nghiên cứu Curan cs (1992), Nugent cs (1996) chứng minh khả sống sót loài, chủng epn khác sau bảo quản đông lạnh phụ thuộc vào thời gian ủ lạnh trớc, tốc độ tan lạnh chủng loại nồng độ chất chống đông đợc sử dụng Nghiên cứu Bai cs., 2004 cho thấy tỷ lệ sống sót IJs sau bảo quản nitơ lỏng không dựa vào nồng độ Glycerol nhng phụ thuộc lớn vào nồng độ IJs Glycerol trớc bảo quản phụ thuộc vào nồng độ chúng dung dịch Ringer thời gian tan đông sau thêi gian b¶o qu¶n Trong thÝ nghiƯm cđa chóng tôi, nồng độ IJs 12.000 IJs/ml đợc coi nồng độ tối u xử lý hỗn hợp Glycerol-Ringer ảnh hởng nồng độ IJs trình xử lý ủ dung dịch chống đông (Glycerol Ringer) trớc đông lạnh nitơ lỏng nång ®é IJs dung dich Ringer còng nh− thêi gian tan đông đến tỷ lệ sống IJs sau bảo 16 Tỷ lệ chết GM (Đối chứng) 24 giê 48 giê 72 giê 38,5 ± 62,1 ± 78,1 ± 2,1 2,6 2,5 34,9 ± 61,7 ± 87,2 ± 2,7 2,8 3,8 32,4 ± 67,5 ± 80,4 ± 2,9 3,2 3,6 25,1 ± 59,4 ± 78,7 ± 3,2 2,4 3,2 36,2 ± 64,4 ± 76,0 ± 2,7 3,0 2,4 30.3 ± 63,8 ± 83,5 ± 2,5 2,3 2,9 qu¶n đông lạnh nitơ lỏng đợc cải tiến thay ®ỉi vỊ nång ®é so víi Bai vµ cs (2004) nhng không thu đợc kết nh thí nghiệm Bai cs (2004) hay nói thu đợc kết số chủng mà Có thể giả định nguyên nhân tăng tỷ lệ sống IJs sau bảo quản đông lạnh số công thức thí nghiệm với nồng độ cao tăng nồng độ chung chất chống đông tự nhiên (nh Lipids, Trehalose Glycerol) ống týp đông, IJs phản ứng với hỗn hợp Glycerol-Ringer cách sản sinh Trehalose Glycerol nh chất bảo vệ đối phó với thay đổi nhiệt độ stress môi trờng khác Tuy nhiên nồng độ IJs cao làm giảm tỷ lệ sống IJs hiệu ứng giảm oxy huyết (Jagdale Grewal, 2003; Qiu Bedding, 2002) Trớc nghiên cứu bảo quản đông lạnh epn Bai cs (2004) thông tin mối quan hệ nồng ®é tuyÕn trïng ®Õn sù sèng sau b¶o qu¶n Mét số tác giả nh Popiel, Vasquez (1991) Nugent cs (1996) sử dụng nồng độ 5000 2,5 ì 106 IJs/ml, nghiên cứu Curran cs (1992) không nói rõ nồng độ Trong nghiên cứu không đề cập rõ ràng nồng độ IJs sử dụng trình tan đông Vì vậy, khó để so sánh mối tơng quan nồng độ với tỷ lệ sống thí nghiệm Tuy nhiên, qua nghiên cứu cã thĨ nhËn thÊy r»ng mét sè dÉn liƯu sai khác tỷ lệ sống nghiên cứu trớc ®©y cã thĨ thay ®ỉi vỊ nång ®é IJs bảo quản đông lạnh Bảo quản đông lạnh tuyến trùng epn thực chất kỹ thuật để trì nguồn gen chúng phục vụ cho mục đích nghiên cứu thơng mại Nghiên cứu minh chứng nồng độ IJs tối u, nồng độ Glycerol sử dụng để xử lý IJs trớc đông lạnh có ảnh hởng tới hạn đến tỷ lệ sống sót IJs sau đông lạnh Hy vọng rằng, kết nghiên cứu sở bớc đầu để cải tiến hoàn thiện quy trình bảo quản đông lạnh cho chủng epn Việt Nam nói riêng epn vùng nhiệt đới nói chung Lời cảm ơn Tác giả đầu cảm ơn quan Trao đổi Hàn lâm CHLB Đức (DAAD) tài trợ kinh phí cho tác giả đến thăm hợp tác nghiên cứu với GS R Ehlers, Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Phòng trừ sinh học, Viện Bệnh học thực vật, trờng Đại học tổng hợp Kiel, CHLB Đức Các nghiên cứu tuyến trùng epn Việt Nam đợc tài trợ Chơng trình nghiên cứu khoa học tự nhiên TàI LIƯU THAM KH¶O Bai C., Shapiro D I., Gaugler R., Yi S., 2004: J Nematology, 36: 281-284 Burnell A., 2002: In: R Gaugler, ed Entomopathogenic Nematology, New York, CABI: 241-264 Curran J., Gibert C., Buler K., 1992: J Nematology, 24: 269-270 Grewal P., Georgis R., 1999: In: F.R Hall and J.J Menn, eds Methods in Biotechnology 5, Biopesticides: Use and Delivery Totowa, NJ: Humana Press, Inc., 279-299 Jagdale G B., Grewal P S., 2003: Inter J Parasitology, 33: 145-152 Kaya H K., Stock S P., 1997: In: L A Lacey, ed Manual of techniques in insect pathology, San Diego, Academic Press: 281324 Major C P., Dougal J D., Harrison A P., 1955: J Bacteriology, 69: 244-249 Nugent M J., O’Leary S A., Burnell A M., 1996: Fund and Appl Nematology, 19: 1-6 Palmfeldt J., Radstrom P., HahnHagerdal B., 2003: Cryobiology, 47: 21-29 10 Poinar G O Jr., 1990: In: R Gaugler and H.K Kaya, eds Entomopathogenic Nematodes in Biological Control Boca Raton, FL, CRC Press: 23-62 11 Popiel I., Vasquez E M., 1991: J Nematology, 23: 432-437 12 Qiu L H., Bedding R A., 2002: Comparative Biochem and Physiol Part B: Biochem and Molec Biology, 131: 757765 13 Shapiro D I., Glazer I., Segal D., 1996: Bio-Control, 6: 238-244 14 Shapiro-Ilan D I., Gauge D H., Koppenhofer A M., 2002: In: R Gaugler, ed Entomopathogenic Nematology New York, NY: CABI: 333-355 15 Stuart R J., Gaugler R., 1996: Canadian J Zoology, 74: 164-170 16 Triantaphyllou A C., McCabe E., 1989: J Nematology, 21: 423-426 17 Wang X., Grewal P.S., 2002: Bio-Control, 23: 71-78 17 INFLUENCE OF GLYCEROL CONCENTRATION ON SURVIVAL OF ENTOMOPATHOGENIC NEMATODES THROUGH CRYOPRESERVATION NGUYEN NGOC CHAU, RALF-UDO EHLERS SUMMARY A modified procedure based on reduced concentration of glycerol for cryopreservation of infective juvenile stage nematodes has been developed using indigenous isolates Steinernema and Heterorhabditis collected from Vietnam The survival of infective juveniles (IJs) depended on some factors such as concentration of glycerol, IJs concentration and timing for thawing Optimum survival for both genera was archived with 12,000 IJs/ml in glycerol and 7,500 IJs/ml in ringer’s solution For Steinernema strains optimum survival also was observed with 12,000 IJs/ml in 10% glycerol concentration whereas with the same IJs concentration in 7.5% Glycerol concentration The maximum retentions of Steinernem were 45.9-95% whereas these retentions of Heterorhabditis isolates were 81.5-95.2% The survival of Vietnamese epn isolates in post-cryopreservation was more or less low that only Steinernema isolates among 26 treated were survival whereas only per 12 Heterorhabditis isolates were post-cryopreservation survival Among survival isolates, apart from two isolates S-TG10 and S-TX1 with survival percentage was lower as and 45.9%, respectively, remaining isolates with survival percentage was higher as 70-95% For toxicology, Steinernema were 78-87 retention of original virulence to GM larvae, whereas this toxicology of Heterorhabditis was 76-83.5 retention of original virulence to GM larvae Ngµy nhËn bµi: 26-7-2007 18 ... hay tuyến trùng tồn đợc hay không Khả sống tuyến trùng sau bảo quản đông lạnh Tổng số 38 chủng epn Việt Nam đợc xử lý để bảo quản động lạnh nitơ lỏng có chủng sống sót sau bảo quản đông lạnh, ... lý nồng độ glycerol 20 30% tỷ lệ tuyến trùng Steinernema DL23 giảm 46 ®Õn 75% so víi ë nång ®é 10%, t−¬ng tù Heterorhabditid BY tỷ lệ sống nồng độ 15 30% giảm từ 43 đến 64% so với tỷ lệ nồng độ. .. bảo quản nitơ lỏng không dựa vào nồng độ Glycerol nhng phụ thuộc lớn vào nồng độ IJs Glycerol trớc bảo quản phụ thuộc vào nồng độ chúng dung dịch Ringer thời gian tan đông sau thời gian bảo quản