Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết trình bày tách chiết và làm sạch RNaza từ nọc rắn hổ mang để nhận chế phẩm Enzim có độ sạch cao, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo về tương tác RNara nọc rắn với RI là rất cần thiết.
28(3): 83-87 Tạp chí Sinh học 9-2006 Kết tách enzim ribonucleaza từ nọc rắn hổ mang phơng pháp sắc ký trao đổi ion cột CM-xen-lu-lô Nguyễn Văn Thiết, Giang Thái Sơn Viện Công nghệ sinh học Các nghiên cứu trớc cho thấy enzim ribonucleaza (RNaza) näc r¾n hỉ mang Naja atra (Cantor, 1842) Việt Nam thể hoạt tính xúc tác cao nhÊt vïng axit [7, 8], víi pH tèi u (pHopt) tơng đơng với pHopt pepsin [1] dày ngời động vật bậc cao kh¸c: pHopt = 2,53 ± 0,30 [8]; RNaza nọc rắn hổ mang Naja oxiana vùng Trung [10], RNaza näc r¾n hỉ mang Naja naja vïng Guntur ấn Độ [4] tất enzim khác thuộc siêu họ RNaza A (bao gồm tất RNaza ngoại tiết động vật có xơng sống, trừ lớp Cá) [5] có pHopt > Hơn nữa, kết nghiên cứu bớc đầu cho thấy RNaza nọc rắn hổ mang Việt Nam không bị ức chế protein ức chế RNaza (RI) từ thai ngời [11] Điều có nghĩa RNaza nọc rắn hổ mang không tơng tác với RI nh vậy, có khả thể hoạt tính xytotoxin, không bị ức chế RI nội bào điều kiện tiên để RNaza bÊt kú thc siªu hä RNaza A biĨu hiƯn đợc hoạt tính xytotoxin tiềm tàng [2, 3, 6] Vì việc tách chiết làm RNaza từ nọc rắn hổ mang để nhận chế phẩm enzim có độ cao, phục vụ cho nghiên cứu tơng tác RNaza nọc rắn với RI cần thiết Công trình nghiên cứu trình bày kết tách RNaza từ nọc rắn hổ mang phơng pháp sắc ký trao đổi ion cột với CM-xen-lulô I phơng pháp nghiên cứu Nọc rắn hổ mang đông khô - nguồn RNaza đợc mua làng nghề nuôi rắn xã Vĩnh Sơn, hun VÜnh T−êng, tØnh VÜnh Phóc ChÕ phÈm Eo nhËn đợc hòa tan nọc rắn đông khô vào nớc cất lần hay dung dịch đệm cần thiết theo tû lƯ 10 mg näc r¾n ml ChÕ phÈm ARN tỉng sè tõ nÊm men vµ nhùa trao ®ỉi ion cacb«xymethylxenlul« (CM-xen-lu-l«) cđa h·ng Sigma Glyxin (Gly) cđa hãng Prolabo Các hóa chất khác có độ phân tích cao Phân tách RNaza phơng pháp sắc ký trao đổi ion cột (1,6 ì 12-15 cm) CMxen-lu-lô Trong lần sắc ký cho lên cột (đã đợc cân trớc với đệm xitrat 10 mM có giá trị pH khác 5,8; 5,6; 5,5; 5,2; 4,8 4,4) khoảng 100 mg nọc rắn đông khô (10 ml chÕ phÈm Eo), rưa cét b»ng mét thĨ tích đệm ban đầu, sau protein khỏi cột gradient nồng độ NaCl ữ 1,0 M NaCl với thể tích chung 120 ml (bình chứa: 60 ml NaCl M ®Ưm xitrat 10 mM; bình khuấy: 60 ml đệm xitrat 10 mM), tốc độ chảy ml/phút, thu phân đoạn ml Sau kết thúc công việc sắc ký, hoạt tính RNaza phân đoạn đợc xác định theo phơng pháp nh mô tả trớc [7], protein đợc đo phơng pháp quang phổ II Kết thảo luận Kết sắc ký chế phẩm Eo Trong sắc ký trao đổi ion khác biệt lực tơng tác ion-ion protein chất mang có ý nghĩa định để phân tách protein hỗn hợp Về phần mình, khác biệt lại phụ thuộc vào pH môi trờng bao quanh phân tử protein, điện tích bề mặt phân tử protein phụ thuộc vào pH môi trờng Vì vậy, việc sắc ký chế phẩm Eo đợc tiến hành pH khác vïng pH = 4,4 - 5,8 (nhùa CM-xen-lu-l« bỊn dải pH axit từ - 6) đệm xitrat 10 M, để tìm giá trị pH mà đó, việc tách chiết RNaza tốt Kết sắc ký chế phẩm Eo giá trị pH đợc trình bày hình Đầu tiên, trình sắc ký đợc tiến hành pH = 5,8, sau giảm dần giá trị pH xuống đến pH = 4,4 Từ sắc ký đồ nhận đợc, ta thấy tất giá trị pH, 83 protein nọc rắn đợc khỏi cột dới dạng đỉnh protein không đối xứng, với đuôi (vai) phía bên phải có hàm lợng protein thấp nhiều vùng đỉnh Đỉnh protein nhận đợc chiếm phần lớn tổng số protein cho lên cột (> 80%) Sù ph©n bè 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 3,0 pH = 5,8 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 10 20 40 30 Sè ph©n ®o¹n 1,75 1,50 1,25 1,00 0,75 0,50 0,25 0,0 pH = 5,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0,5 10 20 0,3 0,2 0,1 0,0 20 40 30 Sè ph©n ®o¹n 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 pH = 5,6 0,3 0,2 0,1 0,0 0,6 10 20 40 30 Số phân đoạn 3,0 pH = 5,2 0,5 0,4 0,3 0,2 2,5 2,0 1,5 0,1 0,0 0,5 0,0 1,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0,4 10 0,4 40 30 Số phân đoạn pH = 4,8 0,5 0,0 protein nh theo phân đoạn cho thấy protein nọc rắn có điện tích gần nhau, tạo thành phổ protein liên tục protein nọc rắn không tách đợc thành đỉnh riêng biệt phơng pháp sắc ký trao đổi ion CM-xen-lu-lô vùng pH = 4,4 - 5,8 0,6 10 20 40 30 Sè ph©n ®o¹n 2,5 pH = 4,4 0,5 0,4 0,3 0,2 2,0 1,5 1,0 0,5 0,1 0,0 10 20 40 30 Số phân đoạn 0,0 Hình Sắc ký đồ chế phẩm Eo nhận đợc sau trình sắc ký trao đổi ion cột với CMxen-lu-lô giá trị pH khác đệm xitrat A hoạt tính RNaza đợc đo đệm Gly 10 mM, pH = 2,5, tính đơn vị OD260; Pr protein, tính đơn vị OD280; đờng chéo gradient nồng độ NaCl, nồng độ NaCl tính theo giá trị trục tung bên phải đợc nhân với (trong trờng hợp sắc ký pH = 5,5) Kết xác định hoạt tính RNaza cho thấy giá trị pH > 5,0, có đỉnh RNaza phân biệt rõ rệt sắc ký đồ; đỉnh RNaza I nằm vùng đỉnh protein chính, đỉnh RNaza II - nằm vùng vai phía bên phải đỉnh protein Đỉnh RNaza I phản hấp phụ khỏi cột nồng độ muối NaCl khoảng 0,6 M đỉnh RNaza II - nồng độ NaCl khoảng 84 0,8 M Khi trình sắc ký đợc tiến hành giá trị pH < 5,0, thờng nhận đợc ®Ønh RNaza réng, bao trïm toµn bé ®Ønh protein vµ đuôi phía bên phải Việc phân tích kỹ sắc ký đồ cho thấy: sắc ký tiến hành pH = 5,8 hoạt tính enzim đỉnh RNaza gần nh tơng đơng nhau, đỉnh RNaza I trùng hoàn toàn với nửa trái đỉnh protein chính, đỉnh RNaza II - nằm phía bên phải đỉnh protein nhng gần với đỉnh protein Khi giảm dần giá trị pH từ 5,8 xuống đến 5,2, ta quan sát đợc xu hớng biến đổi sau: 1) hoạt tính enzim đỉnh RNaza I giảm dần hoạt tính enzim đỉnh RNaza II lại tăng dần lên; 2) đỉnh RNaza II tách xa khỏi đỉnh protein giá trị pH = 0.6 0,6 5,2 đỉnh RNaza II hầu nh tách đợc hoàn toàn khỏi đỉnh protein đỉnh RNaza phân tách khỏi tốt Trong số lần sắc ký pH > 5,0, thay nhận đợc đỉnh RNaza bình thờng nh nêu trên, lại nhận đợc tới đỉnh RNaza phân biệt phản hấp phụ khỏi cột nồng độ muối NaCl tơng ứng 0,5; 0,65 0,86 M (hình 2) A Pr 0.5 0,5 A 0.4 0,4 Pr 2,0 1.5 1,5 0.3 0,3 1,0 0.2 0,2 0.5 0,5 0.1 0,1 0,00 2.5 2,5 15 15 20 20 25 25 30 35 40 30 35 40 Số phân đoạn 0,0 45 50 55 45 50 55 Số phân đoạn Hình Sắc ký đồ chế phẩm Eo trờng hợp nhận đợc đỉnh RNaza (các ký hiệu ghi nh hình 1) Trong đỉnh RNaza nhận đợc đỉnh III có hoạt tính enzim cao nhất, đỉnh enzim phân tách đợc khỏi đỉnh protein sắc ký đồ, giống nh trờng hợp nhận đợc đỉnh RNaza, mà độ chế phẩm RNaza thu đợc đỉnh cao Nh vậy, từ kết nhận đợc, ta thấy sắc ký chế phẩm Eo cột CM-xen-lu-lô đợc tiến hành pH = 5,2 tốt nhất, giá trị pH này, đỉnh enzim (đỉnh II) gần nh đợc tách hoàn toàn khỏi đỉnh protein nọc rắn; hàm lợng protein phân đoạn thuộc đỉnh thấp hoạt tính đặc trng chế phẩm RNaza tơng ứng nhận đợc tăng khoảng 10 lần so với chế phẩm Eo Cho đến nay, tiến hành khoảng 30 lần sắc ký chế phẩm Eo giá trị pH = 5,2 10 lần giá trị pH khác lớn 5,0, nhng lần sắc ký nhận đợc đỉnh RNaza phân biệt (trong có lần sắc ký pH = 5,2 lần sắc ký pH = 5,5); tất lần sắc ký lại, nhận đợc đỉnh RNaza Trong trờng hợp sắc ký nhận đợc đỉnh RNaza, phân bố hoạt tính đỉnh tơng ứng 34% 66% dạng RNaza ứng với đỉnh đợc ký hiệu SK-12 SK-22; trờng hợp sắc ký nhận đợc đỉnh, phân bố hoạt tính chúng tơng ứng là: 24%; 39% 37% - theo tổng hoạt tính RNaza khỏi cột dạng RNaza ứng với đỉnh đợc ký hiƯu lµ SK-13, SK-23 vµ SK-33 Mét sè tÝnh chất đỉnh (dạng) RNaza phân tách đợc sắc ký a lực với cột CM-xen-lu-lô Từ kết phần ta thấy, RNaza nọc rắn hổ mang Việt Nam tơng tác mạnh với nhựa CM-xen-lu-lô Cả dạng RNaza nọc rắn phản hấp phụ khỏi cột trao đổi ion nồng độ muối cao (> 0,5 M NaCl) Điều cho phép kết luận dạng RNaza nọc rắn có tổng điện tích dơng bề mặt lớn khác biệt nhiều Theo nồng độ muối mà dạng SK-12, SK-22 dạng SK-23, SK-33 khỏi cột, ta thấy dạng SK-12 tơng ứng với dạng SK-23, dạng SK-22 tơng ứng với dạng SK-33; điều phù hợp với kết xác định giá trị pH tối u (pHopt) dạng RNaza đợc trình bày phần sau b pH tối u đỉnh RNaza Kết xác định pHopt đỉnh (dạng) RNaza tách đợc phơng pháp sắc ký chế phẩm Eo đợc trình bày h×nh 85 0,4 a 0,7 b 0,6 0,3 0,5 0,4 0,2 0,3 0,2 0,1 0,1 0,0 0,0 5 Hình Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính đỉnh RNaza nhận đợc sau sắc ký chế phẩm Eo cột CM-xen-lu-lô vào pH Hoạt tính RNaza đợc đo đệm Gly 10 mM a trờng hợp nhận đợc hai đỉnh RNaza; b trờng hợp nhận đợc ba đỉnh RNaza 0,3 0.3 c Tính chất động học Do dạng SK-1 nhận đợc, dạng SK-2 SK-3 nhận đợc tất lần sắc ký, phần này, so sánh tính chất động học dạng RNaza Kết nghiên cứu động học bão hòa enzim chất dạng RNaza SK-2 SK-3 vùng giá trị pH tối u chúng đợc trình bày hình 0.4 0,4 SK-2 P, OD260 0.4 0,4 mà đó, chúng bị phản hấp phụ khỏi cột CMxen-lu-lô: đỉnh RNaza sớm nhất, phản hấp phụ khỏi cột CM-xen-lu-lô nồng độ muối khoảng 0,5 M NaCl, đợc ký hiệu SK-1; đỉnh RNaza thứ hai, phản hấp phụ khỏi cột CMxen-lu-lô nồng độ muối khoảng 0,60 - 0,65 M NaCl, đợc ký hiệu SK-2; đỉnh RNaza sau cùng, phản hấp phụ khỏi cột CM-xen-lu-lô nång ®é muèi rÊt cao: 0,80 - 0,86 M NaCl, đợc ký hiệu SK-3 Theo cách ký hiệu đỉnh RNaza thờng nhận đợc đại đa số lần sắc ký chế phẩm nọc rắn đông khô Eo cột CM-xen-lu-lô phải đợc gọi SK-2 SK-3, thay cho SK-1 SK-2 nh trớc [9] P, OD260 Từ kết đợc trình bày hình 3, ta thấy: trờng hợp sắc ký nhận đợc đỉnh RNaza, đỉnh SK-12 có pHopt = 2,57 đỉnh SK-22 có pHopt = 2,09; trờng hợp nhận đợc đỉnh RNaza, đỉnh SK-13 có pHopt = 2,08, đỉnh SK23 có pHopt = 2,51 đỉnh SK-33 có pHopt = 2,0 Nh vậy, giá trị pHopt đỉnh RNaza củng cố kết luận đa phần là: đỉnh SK-12 tơng ứng với đỉnh SK-23 (giá trị pHopt chúng nh nhau, 2,57 2,51 tơng ứng) đỉnh SK-22 tơng ứng với đỉnh SK-33 (giá trị pHopt chúng, 2,09 2,0 tơng ứng) Còn đỉnh SK-13 nhận đợc lần tổng số khoảng 40 lần sắc ký Đỉnh RNaza khỏi cột sớm đỉnh kia, nhng lại có giá trị pHopt giống nh đỉnh SK-33 Nh vậy, từ kết sắc ký xác định pHopt đỉnh RNaza nhận đợc sau sắc ký kết luận nọc rắn hổ mang đông khô có từ đến dạng phân tử khác RNaza Để cho tiện lợi, đỉnh RNaza đợc ký hiệu theo thø tù khái cét cđa chóng, tøc lµ theo hớng tăng nồng độ muối NaCl 0,3 0.3 pH = 2,00 2,0 0,2 0.2 SK-3 pH = 2,00 2.00 0.2 0,2 pH = 2,51 2.51 pH = 2,54 0,1 0.1 0.1 0,1 [S], mcg/ml 0,00 20 40 60 80 100 [S], mcg/ml 0,00 20 40 60 80 100 Hình Đồ thị biểu diễn động học bão hòa enzim chất dạng RNaza SK-2 SK-3 giá trị pH tơng ứng với giá trị pHopt chúng Động học đợc nghiên cứu đệm Gly 10 mM 86 Từ đồ thị hình 4, ta thấy đờng cong động học bão hòa enzim chất dạng RNaza SK-2 SK-3 có dạng sigma (dạng hình chữ S) hay không tuân theo động học Michaelis-Meten thông thờng Hơn nữa, dạng SK-3 có lực với chất cao nhiều so với dạng SK-2; dạng SK-3 đạt bão hòa nồng độ chÊt [S] > 40 µg ARN/ml ë pH = 2,51 vµ [S] > 60 µg ARN/ml ë pH = 2,0, dạng SK-2 dờng nh lâu đạt bão hòa, chí nồng độ chất [S] = 80 àg ARN/ml; nồng độ chất cao nh mà lợng sản phẩm tạo thành (P) gần nh tỉ lệ tuyến tính với nồng độ chất pH = cha có dấu hiệu đạt b·o hßa ë pH = 2,54 III KÕt luËn Tõ kết đợc trình bày trên, kết luận nh sau: Bằng phơng pháp sắc ký trao đổi ion cột với CM-xen-lu-lô, tách đợc từ đến dạng RNaza nọc rắn hổ mang khác biệt nhiều điện tích bề mặt Trong đó, dạng SK-2 SK-3 nhận đợc tất lần sắc ký, dạng SK-1 nhận đợc số lần sắc ký Các dạng SK-1 vµ SK-3 cã pH tèi −u nh− nhau, víi pHopt dạng SK-2 có pHopt 2,5 Hai dạng enzim SK-2 SK-3 không khác lực với nhựa CM-xen-lu-lô giá trị pHopt, mà khác biệt nhiều tính chất động học: dạng SK-3 có lực với chất cao nhiều so với dạng SK-2 Tài liệu tham kh¶o Fersht A., 1977: Enzyme structure and mechanism Freeman and Company Ltd Haigis M C., Kurten E L., Raines R T., 2003: Nucleic acids Research, 31: 31024 – 1032 Leland P A., Raines R T., 2001: JBC, 8: 405-413 Mahalakshmi Y V., Jagahnadham M V., Pandit M W., 2000: IUBMB Life, 49: 309316 Raines R T., 1998: Chem Rev., 98: 10451065 Raines R T., 1999: Enzymatic mechanism: 235-249, IOC press, Washington DC Nguyễn Văn Thiết, 2002: Tạp chí Dợc liệu, 7(6): 181-185 Hà Nội Nguyễn Văn Thiết, Ngô Thị Hải Yến, 2003: Những vấn đề nghiên cứu khoa häc sù sèng: 515-518 Nxb Khoa häc vµ Kü thuËt, Hà Nội Nguyễn Văn Thiết, Ngô Thị Hải Yến, 2004: Tạp chí Dợc liệu, 9(3): 89-93 Hà Nội 10 Vasilenko S K., Babkina G T., 1965: Biokhimiya, 30(4): 705-712 (in Russian) 11 Ngô Thị Hải Yến, Nguyễn Văn Thiết, 2004: Những vấn đề nghiên cứu khoa häc sù sèng: 195-198 Nxb Khoa häc vµ Kü thuËt, Hµ Néi Results of the ribonuclease isolation from the Cobra venom by ion-exchange column with CM-cellulose method Nguyen Van Thiet, Giang Thai Son Summary In this paper, the cobra (Naja atra Cantor, 1842) venom ribonuclease (RNase) was isolated of ionexchange column with CM-cellulose method The chromatographic isolation was carried out at different values of pH within an interval of pH = 4.4 – 5.8 At pH > 5.0, the cobra venom RNase was almost always eluded from the column in two picks at salt concentrations of about 0.6 M and 0.8 M NaCl; but in some cases - in three picks at salt concentrations of about 0.5 M, 0.65 M and 0.86 M NaCl, respectively; whereas, at pH < 5.0, the cobra venom RNase was always eluded from the column in single broad pick The forms of the cobra venom RNase corresponding to these picks were designated as SK-1, SK-2 and SK-3, respectively It seemed that these RNase forms were differed from each other in many properties, such as an optimum of pH (pHopt) and the kinetic property Thus, the pHopt of the form SK-2 was about 2.5, whereas this value of the forms SK-1 and SK-3 was the same and about 2.0 Besides, two main forms SK-2 and SK-3 had sigmoidal curves of the saturation of the enzyme with the substrate, but they differed significantly in an affinity to the substrate Ngµy nhËn bµi: 14-11-2005 87 ... ë pH = 2,54 III KÕt luËn Tõ kết đợc trình bày trên, kết luận nh sau: Bằng phơng pháp sắc ký trao đổi ion cột với CM-xen-lu-lô, tách đợc từ đến dạng RNaza nọc rắn hổ mang khác biệt nhiều điện tích... khoảng 40 lần sắc ký Đỉnh RNaza khỏi cột sớm đỉnh kia, nhng lại có giá trị pHopt giống nh đỉnh SK-33 Nh vậy, từ kết sắc ký xác định pHopt đỉnh RNaza nhận đợc sau sắc ký kết luận nọc rắn hổ mang đông... đoạn cho thấy protein nọc rắn có điện tích gần nhau, tạo thành phổ protein liên tục protein nọc rắn không tách đợc thành đỉnh riêng biệt phơng pháp sắc ký trao đổi ion CM-xen-lu-lô vùng pH =