Bài viết nghiên cứu tính bền nhiệt của Enzim; kết quả phân tách RNaza bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion; kết quả phân tách RNaza bằng phương pháp sắc ký sàng lọc phân tử; sự phụ thuộc hoạt tính của RNaza từ nọc rắn hổ mang chúa vào pH...
29(4): 86-92 Tạp chí Sinh học 12-2007 kết nghiên cøu ribonucleaza näc r¾n hỉ mang chóa (ophiophagus hannah) Nguyễn Văn Thiết Viện Công nghệ sinh học Ribonucleaza (RNaza) nhóm enzim có phân bố rộng rãi đợc nghiên cứu nhiều, chức sinh học thông thờng RNaza tham gia vào trao đổi chất acid nucleic, ngày biết đợc nhiều tính chất (hay chức năng) sinh học enzim thuộc nhóm RNaza nh hoạt tính kháng khuẩn [1, 2], kháng virus [10, 11], hoạt tính gây độc tế bào (hay hoạt tính cytotoxin) [4, 5], hoạt tính ức chế phản ứng miễn dịch [4] Đặc biệt vai trò nucleaza, có RNaza phòng thủ tự vệ thể đợc bảo tồn từ vi sinh vật thể bậc cao nh ngời [3, 6, 12] Tuy nhiên RNaza từ nọc rắn nói chung đợc nghiên cứu Cho đến chØ cã RNaza tõ näc r¾n hỉ mang cđa Ên Độ nhận đợc dạng có độ cao [7], RNaza từ nọc rắn loài khác đợc làm phần Một số nghiên cứu RNaza thời gian gần cho thấy RNaza nọc rắn hổ mang Naja naja Việt Nam enzim đặc biệt, víi pH tèi −u rÊt thÊp (pHopt = 2,0 - 2,6), có nhiều dạng phân tử khác không tơng tác với RI (proteininhibitor RNaza) nội bào có khả thể hoạt tính cytotoxin [8] Nh chóng ta biÕt r»ng näc r¾n hỉ mang chóa (HMC) độc nhiều so với nọc rắn hổ mang thờng (Naja naja) Ngời bị rắn hổ mang chúa cắn mà không đợc cứu chữa cách kịp thời khả tử vong cao RNaza từ nọc rắn hổ mang chúa nớc ta cha đợc nghiên cứu Trong công trình trình bày kết bớc đầu nghiên cứu số tính chất hoá lý xúc tác (tính bền nhiệt, tính chất sắc ký, pHopt) RNaza nọc rắn hổ mang chúa, nhằm mục đích ®iỊu tra ngn enzim q hiÕm nµy ®Ĩ phơc vơ cho mục đích nghiên cứu sau theo 86 hớng làm thuốc chống virus điều trị ung th I phơng pháp Nghiên cứu Nọc rắn hổ mang chúa đông khô đợc mua làng nghề nuôi rắn xã Vinh Sơn, huyện Vĩnh Tờng, tỉnh Vĩnh Phúc RNA toàn phần từ nấm men (Sigma) đợc sử dụng làm chất cho RNaza RNaza nọc rắn hổ mang chúa đợc phân tách phơng pháp sắc ký trao đổi ion sàng lọc phân tử cột với chất mang khác nhau, trình đợc thực thiết bị FPLC CM-xenlulô (CMC) hãng Sigma, SP Sepharose Fast Flow (SP), Superdex 75 (S-75) vµ Superdex 200 (S-200) Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen Viện Công nghệ sinh học cung cấp Xác định protein phơng pháp quang phổ Hoạt tính RNaza đợc đo theo phơng pháp nh mô tả trớc [8] biểu diễn đơn vị OD260 II kết thảo luận Chúng tiến hành nghiên cứu số tính chất hoá lý hoạt tính xúc tác RNaza nọc rắn hổ mang chúa, mục đích nêu trên, để tìm hiểu khả làm enzim phơng pháp khác nhằm mục đích thu nhận chế phẩm RNaza có độ cao tốt, để sử dụng cho nghiên cứu tơng tác với RI… TÝnh bỊn nhiƯt cđa cđa enzim Theo nh− đợc biết nọc rắn loại giữ đợc độ độc lâu, đợc bảo quản tốt trạng thái đông khô, ®· kiĨm tra ®é bỊn nhiƯt cđa RNaza b»ng c¸ch xử lý dung dịch enzim (chứa 10 mg nọc rắn/ml chế phẩm E0) nhiệt độ khác từ 40oC đến 100oC Kết thí nghiệm đợc trình bày hình A, % 120 100 pháp sắc ký trao đổi ion NR HMC 80 60 40 20 o tC t0C 0 20 40 60 80 100 Hình Đồ thị biểu diễn phụ thuộc hoạt tính RNaza lại dung dịch enzim sau đun cách thuỷ phút nhiệt độ khác Hoạt tính mẫu enzim giữ nhiệt độ phòng (~20oC, tức không bị xử lí nhiệt) đợc coi 100% Đồ thị hình cho thấy tăng nhiệt độ (đun cách thuỷ) từ 18oC đến 100oC, hoạt tính enzim giảm vùng nhiệt độ 40 - 60oC (còn ~88% hoạt tính 50oC), sau lại tăng tới 105 - 106% vïng nhiƯt ®é 70 - 90oC, ®un sôi cách thuỷ 100oC làm giảm không đáng kể (~1%) hoạt tính enzim Những thí nghiệm lặp lại cho kết tơng tự, chứng tỏ RNaza từ nọc rắn hổ mang chúa Việt Nam enzim bền với nhiệt Kết cho thấy xử lý nhiệt đợc sử dụng nh bớc để làm tinh chế enzim Kết phân tách RNaza phơng 0.4 Các phơng pháp sắc ký thờng đợc sử dụng hiệu để tách chiết làm protein hầu hết quy trình tách chiết tinh chế protein, chúng cho phép phân tách protein dựa theo khác biệt kích thớc phân tử hay điện tích bề mặt Do sử dụng phơng pháp nhằm mục đích: để nghiên cứu tính chất RNaza tìm kiếm khả phân tách làm enzim từ nọc rắn hổ mang chúa a Kết sắc ký trao đổi ion cột với CM-xenlulôza Sắc ký trao đổi ion đợc tiến hành chất mang cationit, có thông tin sơ RNaza nọc rắn hổ mang không phân tách đợc cột DEAE-xenluloza, mà lại tách đợc cột CMC thành nhiều đỉnh riêng biệt [9] Sắc ký đợc tiến hành đệm xitrat 10 mM, pH 5,2 Trong thí nghiệm lần sắc ký lấy 25 - 50 mg nọc rắn đông khô hoà vào - 10 ml dung dịch đệm, li tâm loại cặn, thu lấy dịch cho lên cột đợc cân trớc với dung dịch đệm Enzim đợc khỏi cột b»ng gradient nång ®é NaCl - 1,0 M thể tích 120 ml, thu phân đoạn ml Sau kết thúc sắc ký, tiến hành đo hoạt tính RNaza lợng protein tất phân đoạn Sắc ký đồ nọc rắn hổ mang chúa nhận đợc sau sắc ký cột CMC đợc trình bày hình 1.5 40mgNR HMC 0.3 A Pro 0.2 0.5 0.1 0 10 20 30 Số phân đoạn 40 50 Hình Sắc ký đồ nọc rắn hổ mang chúa nhận đợc cột trao đổi ion với CM-xenlulôza (1 ì 11 cm) A Hoạt tính RNaza, OD260; Pr Hàm lợng protein, OD280; Đờng chéo gradient nồng độ NaCl (0 - 1,0 M), với thể tích chung 120 ml 87 Kết sắc ký cột CMC cho thấy protein nọc rắn hổ mang chúa đợc tách thành đỉnh: đỉnh protein không hấp phụ cột trao đổi ion, đỉnh protein đợc phản hấp phụ khỏi cột gradient nång ®é NaCl, ®ã cã ®Ønh nhá khỏi cột trớc đỉnh lớn khỏi cột sau RNaza nọc rắn tách thành đỉnh, ®ã ®Ønh enzim nhá trïng víi ®Ønh protein kh«ng hÊp phụ cột, trớc gradient nồng độ muối ®Ønh enzim lín trïng víi ®Ønh protein lín Ngoµi có đỉnh RNaza nhỏ trùng với đỉnh protein nhỏ phía bên trái đỉnh protein lớn Hình cho thấy, phần lớn protein nọc rắn đợc khỏi cột tập trung đỉnh protein lớn, lợng chế phẩm nọc rắn cho lên cột nhiều đỉnh protein rộng, chí che phủ đỉnh protein nhỏ thứ phía bên trái đỉnh protein lớn sắc ký đồ 0.5 đỉnh RNaza Đỉnh RNaza lớn đỉnh protein lớn trùng nhau, nhng đầu đỉnh chúng lệch chút (nồng độ muối tơng ứng với đỉnh 0,55 0,525 M NaCl) Nh vậy, phơng pháp sắc ký cột CMC tách đợc đỉnh RNaza Mặt khác, xét khía cạnh làm enzim sắc ký cột CMC pH = 5,25 không thích hợp, để sử dụng sắc ký chất mang cách hiệu cần phải tìm giá trị pH khác thích hợp b Kết sắc ký trao đổi ion cột SP Sepharose Fast Flow Quá trình sắc ký cột với chất mang cationit khác - SP Sepharose Fast Flow (SP), đợc tiến hành tơng tự nh− víi chÊt mang CMC KÕt qu¶ cđa mét thí nghiệm đợc trình bày hình 0.05 30mg NR HMC 0.4 0.04 0.3 0.03 A, 24 h A Pr 0.2 0.1 0.02 0.01 0.0 0 10 20 30 Số phân đoạn 40 50 Hình Sắc ký đồ chế phẩm nọc rắn hổ mang chúa nhận đợc cột trao đổi ion SP Sepharose Fast Flow (1 ì 20 cm) Ghi nh hình Gradient nồng độ muối (0 - 1,0 M) Kết hình cho thấy sắc ký cột SP, toàn protein nọc rắn hổ mang chúa hấp phụ cột trao đổi ion Tuy nhiên, protein khỏi cột gradient nồng độ NaCl, protein không tách đợc thành đỉnh riêng biệt, mà khỏi cột dạng đỉnh với chân đỉnh rộng, đặc biệt chân đỉnh phía bên phải Kết đo hoạt tính RNaza cho thấy có tới ®Ønh RNaza riªng biƯt, ®ã cã ®Ønh chÝnh đỉnh phụ, đợc ký hiệu tơng ứng E1 (đỉnh phụ), E3, E3, E4 E5, với nồng độ muối mà chúng phản hấp phụ khỏi cột tơng øng lµ 0,18; 0,32; 0,42; 0,52 vµ 0,59 M NaCl, ®ã E1 trïng víi dØnh protein phơ, E2 trïng với đỉnh protein 88 đỉnh enzim lại nằm vai phải đỉnh protein Tuy nhiên, sau 24 h đo lại hoạt tính, có đỉnh đầu hoạt tính, đỉnh E5 bị hết hoạt tính Nh vậy, nọc rắn hổ mang chúa có dạng (đỉnh) RNase phát đợc phơng pháp sắc ký cột SP Kết phân tách RNaza phơng pháp sắc ký sàng lọc phân tử Sau biết đợc thông tin việc phân tách protein nọc rắn hổ mang chúa theo điện tích không mang lại hiệu cao điện tích chúng gần nhau, tiến hành nghiên cứu tìm khả phân tách chúng theo kích thớc phơng pháp sắc ký sàng lọc phân tử cột với chất mang Superdex 200 75 với lợng nọc rắn khác lµ 12; 25 vµ 50 mg (pha 1-1,5 ml dung dịch đệm xitrat natri 10 mM, pH = 5,25), phân đoạn thu với thể tích - 1,5 ml Sắc ký đồ nhận đợc sau chạy sắc ký với 25 mg nọc rắn đông khô đợc biểu diễn hình a Kết sắc ký sàng lọc phân tử cột Superdex 200 (S-200) Sắc ký sàng lọc phân tử đợc tiến hành 1.2 25 mg NR HMC A Pr mAU 300 A Pr, mAU 0.8 0.6 400 200 0.4 100 0.2 0 10 20 30 V, ml 40 50 60 Hình Sắc ký đồ chế phẩm nọc rắn hổ mang đông khô nhận đợc cột Superdex 200 (1 ì 60 cm) A Hoạt tính Rnaza, OD260; Pr Hàm lợng protein, OD280; V Thể tích khỏi cột, ml Kết sắc ký với lợng nọc rắn khác đợc tóm tắt bảng Bảng Phân bố hoạt tính RNaza đỉnh enzim (%) từ kết chạy sắc ký cột S-200 với lợng nọc rắn hổ mang chúa khác Lợng nọc rắn cho lên cột sắc ký 50 mg 25 mg 12 mg % hoạt tính đỉnh enzim §Ønh §Ønh §Ønh 10,8 8,6 31,8 33,1 48,4 58,5 2,7 21,3 76,0 Kết chạy sắc ký cột S-200 cho thấy protein nọc rắn hổ mang chúa đợc phân tách thành 3-4 đỉnh, RNaza - phân tách đợc thành đỉnh, có đỉnh (E2 E3) gần trùng với đỉnh protein lớn đỉnh phụ (E1) nằm vùng đỉnh protein nhỏ Khi tăng lợng nọc rắn đợc sử dụng cho chạy sắc ký từ 12 lên 50 mg, tỉ lệ % hoạt tính ®Ønh chÝnh E3 gi¶m tõ 76% xuèng 48,4%, hoạt tính đỉnh phụ E1 lại tăng từ 2,7% lên 10,8%, tỉ lệ % hoạt tính enzim đỉnh E2 biến đổi không nhiều (bảng 1) b Kết sắc ký sàng lọc phân tử cột với Superdex 75 (S-75) Để tìm hiểu rõ khả phân tách RNaza nọc rắn hổ mang chúa phơng pháp sắc ký sàng lọc phân tử, sử dụng chất mang S-75 (có độ phân giải protein tối u từ 000 - 70 000 Da, hẹp so với S-200) Quá trình sắc ký chất mang đợc tiến hành nh với chất mang S-200 Kết chạy sắc ký với 20 mg nọc rắn đợc trình bày hình Sắc ký đồ hình cho thấy, protein nọc rắn phân tách đợc thành đỉnh riêng biệt, RNaza tách đợc thành đỉnh (trùng với đỉnh protein đầu), với thể tích khỏi cột tơng ứng 21,3; 31,3; 38,3 45,3 ml phân bố hoạt tính đỉnh RNaza 4,4; 23,8; 55,4 vµ 16,4% 89 1.0 20 mg NR HMC A 250 Pr 200 0.8 A, AU Pr, mAU 0.6 150 0.4 100 0.2 50 0.0 0 10 20 30 40 50 V, ml 60 Hình Sắc ký đồ chế phẩm nọc rắn hổ mang chúa đông khô nhận đợc sau sắc ký cột Superdex 75 (ghi nh hình 4) Kết nghiên cøu sù phơ thc ho¹t tÝnh cđa RNaza tõ näc rắn hổ mang chúa vào pH Trong tất thí nghiệm trình bày 0.3 A phần trên, hoạt tính RNaza đợc đo đệm glixin 10 mM pH 2,5 Trên hình kết nghiên cứu mối phụ thuộc hoạt tính RNaza chế phẩm enzim khác từ nọc rắn hổ mang chúa 0.5 Eo HMC RNase II (CMC) A 0.4 0.2 0.3 0.2 0.1 0.1 pH pH 0.0 0 0.4 A RNase II (SP) 0.3 0.7 RNase III (S75) A 0.6 0.5 0.4 0.2 0.3 0.2 0.1 0.1 pH 0.0 pH 0.0 5 Hình Đồ thị biểu diễn sù phơ thc ho¹t tÝnh RNaza mét sè chÕ phẩm enzim khác từ nọc rắn hổ mang chúa vào pH, Eo HMC chế phẩm enzim nhận đợc hòa tan (10 mg/ml) nọc rắn hổ mang chúa đông khô dung dịch đệm, RNaza II III chế phẩm enzim ứng với đỉnh RNaza nhận đợc sau sắc kí cột với chất mang tơng ứng Hoạt tính RNaza đợc đo hỗn hợp đệm Glixin-Xitrat 10 mM Từ đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc A pH hình ta thÊy, RNaza näc r¾n hỉ mang 90 chóa tất chế phẩm enzim khác thể hoạt tính xúc tác vùng giá trị pH axit, gièng nhu RNaza näc r¾n hỉ mang [8] Thống kê theo tất lần xác định pH tèi −u cđa RNaza c¶ chÕ phÈm näc rắn hổ mang chúa đông khô đỉnh RNaza nhận đợc lần sắc ký khác nhau, nhận đợc giá trị trung bình pHopt = 2,00 0,25 (với n = 28) Trên số kết sơ nghiên cứu RNaza nọc rắn hổ mang chúa Từ kết nhận đợc thấy RNaza nọc rắn hổ mang chúa enzim bền nhiệt Đây còng lµ mét tÝnh chÊt chung cđa nhiỊu enzim thc nhóm RNaza Tính chất đợc sử dụng tách chiết làm RNaza từ nguồn enzim Kết phân tách RNaza phơng pháp sắc ký trao đổi ion cho thấy giá trị pH 5,25 protein nọc rắn khác biệt không nhiều điện tích bề mặt, chúng đợc khỏi cột trao đổi ion không thành đỉnh protein riêng biệt tách cách nhau, mà hầu hết protein nọc rắn tập trung đỉnh protein lớn, có vai dài với mét sè ®Ønh nhá vỊ phÝa cđa ®Ønh protein Nếu nh cột CMC phân tách đợc RNaza nọc rắn hổ mang chúa thành - đỉnh (dạng), cột SP lại tách đợc tới đỉnh (dạng) RNaza khác Tuy nhiên, đỉnh RNaza thứ năm lại hoạt tính enzim nhanh (sau 24 h đo lại không hoạt tính, hình 3) Mặt khác, protein nọc rắn hổ mang chúa lại khác biệt nhiều kích thớc phân tử: cột S-200 tách đợc đỉnh protein rõ ràng đỉnh RNaza; cột S75 tách đợc đỉnh protein đỉnh RNaza; đỉnh enzim có vị trí trùng gần nh hoàn toàn với đỉnh protein tơng ứng, đỉnh protein thø khái cét sau cïng øng víi vïng kích thớc phân tử nhỏ hoạt tính enzim Từ kết ta thấy sắc ký đợc tiến hành đệm xitrat 10 mM pH 5,25, sắc ký cột SP S75 cho phép tách RNaza thành dạng phân tử khác điện tích kích thớc tơng ứng, nhng hầu nh không làm đợc RNaza Để sử dụng phơng pháp sắc ký cho làm RNaza từ nọc rắn hổ mang chúa cách hiệu quả, cần phải tiến hành nghiên cứu tối u hoá để điều kiện sắc ký, cho phép tách đợc RNaza khỏi protein khác nọc rắn Cuối còng ph¶i nhËn xÐt r»ng, còng nh− RNaza tõ näc r¾n hỉ mang Naja naja, RNaza tõ näc r¾n hỉ mang chóa Ophiophagus hannah còng thĨ hiƯn ho¹t tÝnh xóc tác cao vùng axit, với giá trị pHopt = 2,0 Nh− vËy, RNaza näc r¾n hỉ mang hổ mang chúa giống tính chất sinh học xúc tác: chúng có pHopt vùng axit, enzim bền nhiệt tồn nhiều dạng phân tử khác §iỊu nµy cã lÏ chØ mèi quan hƯ hä hàng gần loài rắn nớc ta Theo mối phụ thuộc hoạt tính xúc tác vào pH, loài rắn hổ mang nớc ta khác xa nhiều loài rắn hổ mang khác nh loài rắn khác đợc nghiên cứu giới với giá trị pHopt > III kết luận Từ kết trình bày ®©y cã thĨ kÕt ln nh− sau: RNaza näc rắn hổ mang chúa Việt Nam enzim bền nhiệt, thể hoạt tính xúc tác cao vùng axit với giá trị pHopt = 2,00 0,25 có dạng phân tử khác kích thớc điện tích bề mặt Tài liệu tham kh¶o Harder J., Schroder J M., 2002: J B C., 277: 46779-46784 Hooper L V., Stappenbeck T S., Hong C V., Gordon J I., 2003: Nat Immunol., 4: 269-273 James R., Cleanthous C., Moore G R., 1996: Microbiology, 142: 1569-1580 Kim J S., Soucek J., Matousek J., Raines R T., 1995: JBC, 270: 10525-10530 Leland P A., Staniszewski K E., Kim B M., Raines R T., 2001: J B C., 276: 43095-43102 Lers A et al., 1998: Plant Mol Biol., 36: 439-449 Mahalakshmi Y V., Jagahnadham M V., Pandit M W., 2000: IUBMB Life, 49: 309316 Nguyễn Văn Thiết, 2005: Tạp chí Dợc liệu, 10(5): 153-158 Nguyễn Văn Thiết, Giang Thái Sơn, 2006: Tạp chí Sinh học, 28(3): 83-87 91 10 Potenza N., Salvatore V., Migliozzi A., Martone V., Nobile V., Russo A., 2006: Nucleic Acids Research, 34: 2906-2913 (PMID: 6179462) 11 H F Rosenberg, Domachowske J B., 2001: Journal of Leukocyte Biology, 70: 691-698 12 Sen G C., Lengyel P., 1992: JBC, 267: 5017-5020 The results of studies on ribonuclease from king cobra venom (Ophiophagus hannah) Nguyen Van Thiet Summary In this paper Ribonuclease (RNase) from Vietnam king cobra (Ophiophagus hannah) venom was characterized in detail by ion-exchange chromatographic methods and its some properties were studied It seems that king cobra venom RNase is very thermostable: treatment by heating enzyme solutions (in a water bath) for at temperature from 70oC to 100oC almost does not abolish its activity The existence of this enzyme in multiple molecular forms was confirmed by chromatographic methods, including ion-exchange chromatography on columns with CM-cellulose and SP Sepharose Fast Flow and gel-filtration on columns with Superdex 200 and Superdex 75 These methods have revealed at least molecular forms of this enzyme differing in net charge and forms differing in molecular size The enzyme is the most active in the pH range of 1.5 - 4.0 and its pH optimum is about 2.00 ± 0.25 in glycine or in mix glycine-citrate (in a ratio 1: 1) buffers These properties of RNase from Vietnam king cobra venom is very similar to those ones of the enzyme from Vietnam cobra venom Ngµy nhËn bµi: 13-3-2007 92 ... Sắc ký đồ chế phẩm nọc rắn hổ mang chúa đông khô nhận đợc sau sắc ký cột Superdex 75 (ghi nh hình 4) Kết nghiên cứu phụ thuộc hoạt tính RNaza từ nọc rắn hổ mang chúa vào pH Trong tất thí nghiệm... loài rắn nớc ta Theo mối phụ thuộc hoạt tính xúc tác vào pH, loài rắn hổ mang nớc ta khác xa nhiều loài rắn hổ mang khác nh loài rắn khác đợc nghiên cứu giới với giá trị pHopt > III kết luận Từ kết. .. thc ho¹t tÝnh RNaza mét số chế phẩm enzim khác từ nọc rắn hổ mang chúa vào pH, Eo HMC chế phẩm enzim nhận đợc hòa tan (10 mg/ml) nọc rắn hổ mang chúa đông khô dung dịch đệm, RNaza II III chế phẩm